RU2081411C1

RU2081411C1 - Composition for detecting sodium ions

Info

Publication number: RU2081411C1
Application number: SU915010738A
Authority: RU
Inventors: Натаниель Берри Майкл; Таун Майкл-Гарольд; Крессе Джордж-Буркхард; Геррманн Уве
Original assignee: Дзе Флиндерс Юниверсити оф Саут Аустрэлиа; Берингер Маннгейм ГмбХ
Priority date: 1987-04-10
Filing date: 1988-04-02
Publication date: 1997-06-10

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves studying sodium ions influence upon enzyme activity for determining sodium contents in liquid. Composition has ingredients needed for detecting sodium ions presence. EFFECT: enhanced accuracy. 3 cl

Description

Изобретение относится к способам и реагентам для определения ионов натрия, здесь и далее именуемых аналитами, в биологических и небиологических жидкостях. The invention relates to methods and reagents for determining sodium ions, hereinafter referred to as analytes, in biological and non-biological fluids.

Изобретение основано на способности многих аналитов стимулировать или ингибировать активность чувствительных ферментов. Аналиты могут быть катионными или анионными, металлами или неметаллами, простыми или составными. На практике часто обнаруживают, что аналиты присутствуют в образце в концентрации, которая находится вне пределов чувствительности соответствующего аналитического индикаторного фермента, или возникают сложности, связанные с наличием других ионов, к которым данный фермент также чувствителен. Изобретение касается этих проблем и разрешает их различными способами. The invention is based on the ability of many analytes to stimulate or inhibit the activity of sensitive enzymes. The analytes may be cationic or anionic, metals or non-metals, simple or compound. In practice, it is often found that analytes are present in a sample at a concentration that is outside the sensitivity limits of the corresponding analytical indicator enzyme, or that difficulties arise in the presence of other ions to which this enzyme is also sensitive. The invention addresses these problems and solves them in various ways.

В практике клинической биохимии измерения электролитов в сыворотке являются наиболее обычными аналитическими тестами, которые осуществляют в больницах. Такие определения необходимы не только для рутинных исследований, но часто и в экстренных, угрожающих жизни случаях, когда важна скорость анализа. Так как основной причиной задержек в больницах является перевозка образцов из палат в диагностические лаборатории, способ, который позволяет легко произвести определение у постели больного, особенно ценен в опасных ситуациях. In clinical biochemistry practice, serum electrolyte measurements are the most common analytical tests performed in hospitals. Such definitions are necessary not only for routine research, but often also in urgent, life-threatening cases where the speed of analysis is important. Since the main reason for delays in hospitals is the transportation of samples from the wards to diagnostic laboratories, a method that makes it easy to determine at the patient's bedside is especially valuable in dangerous situations.

Обычным способом анализа натрия в практике клинической биохимии является плазменная фотометрия. Этот способ основан на том принципе, что некоторые атомы при нагружении переходят в возбужденное состояние и излучают свет характеристической длины волны при возвращении в основное состояние. Интенсивность энергии излучения на характеристической длине волны, которую излучают атомы в пламени, прямо пропорциональна количеству атомов, возбужденных в пламени, что соответственно прямо пропорционально концентрации интересующего вещества в образце. Необходимые приборы сложны и относительно дороги и требуют использования горячих газов. A common method for analyzing sodium in clinical biochemistry is plasma photometry. This method is based on the principle that, when loaded, some atoms go into an excited state and emit light of a characteristic wavelength when they return to the ground state. The intensity of the radiation energy at the characteristic wavelength that atoms emit in the flame is directly proportional to the number of atoms excited in the flame, which is accordingly directly proportional to the concentration of the substance of interest in the sample. The necessary appliances are complex and relatively expensive and require the use of hot gases.

В альтернативном способе, особенно для натрия, используют ионо-селективные электроды. В идеале каждый электрод обладает уникальным ионо-селективным свойством, которое должно позволить ему реагировать только на один ион. На практике это не так, и для каждого ионо-селективного электрода имеются "мешающие" ионы. Более того, ионо-селективные электроды вовсе не абсолютно специфичны, хотя обычно возможны поправки. Такие электроды измеряют потенциал, создаваемый в присутствии специфического иона. Приборы относительно дорогостоящи. Ни один из способов нельзя осуществить спектрофотометрически, и поэтому клиническая потребность в определении ионов приводит к существенному усложнению коммерчески доступных клинических анализаторов, большинство из которых сконструировано главным образом для спектрометрических анализов. Оба способа требуют высокой степени профессионализма и опыта для их успешного применения. In an alternative method, especially for sodium, ion-selective electrodes are used. Ideally, each electrode has a unique ion-selective property, which should allow it to respond to only one ion. In practice, this is not so, and for each ion-selective electrode there are "interfering" ions. Moreover, ion-selective electrodes are not completely specific at all, although corrections are usually possible. Such electrodes measure the potential created in the presence of a specific ion. Instruments are relatively expensive. None of the methods can be performed spectrophotometrically, and therefore the clinical need for ion determination leads to a significant complication of commercially available clinical analyzers, most of which are designed primarily for spectrometric analyzes. Both methods require a high degree of professionalism and experience for their successful application.

В аналитической биохимии W. H. Outlaw и O.H.Zowry, 92, 370-374 (1979) описан ферментативный анализ для определения ионов калия в тканях. В этом способе использована пируваткиназа из мускула кролика, которая активируется ионами кальция и ионами натрия, причем первые примерно в сорок раз более эффективны. Благодаря такой неспецифичности этот способ годится для растительных материалов, в которых ионы калия являются преобладающими, но не подходят для измерения в тканях живого организма, подобных сыворотке, которые содержат тридцатикратный избыток ионов натрия. Поэтому ионы натрия вызывают неприемлемые помехи при использовании ферментативной фотометрической методики, описанной Лоури с сотрудниками для измерения калия в плазме или сыворотке. Другой проблемой является то, что ионы аммония аналогичным образом активируют ионы калия. Вышеупомянутая публикация не предназначена для решения этих критических проблем в отношении анализа ионов калия в биологических жидкостях, таких, как сыворотка. In analytical biochemistry, W. H. Outlaw and O.H. Zowry, 92, 370-374 (1979) describe an enzymatic assay for determining potassium ions in tissues. This method uses pyruvate kinase from a rabbit muscle, which is activated by calcium ions and sodium ions, the former being about forty times more effective. Due to this nonspecificity, this method is suitable for plant materials in which potassium ions are predominant, but not suitable for measurement in tissues of a living organism, such as serum, which contain a thirty-fold excess of sodium ions. Therefore, sodium ions cause unacceptable interference when using the enzymatic photometric technique described by Lowry and coworkers to measure potassium in plasma or serum. Another problem is that ammonium ions similarly activate potassium ions. The above publication is not intended to solve these critical problems regarding the analysis of potassium ions in biological fluids, such as serum.

Поэтому целью изобретения является создание способа и реагентов, которые позволили бы избежать вышеуказанные затруднения. В изобретении эти проблемы разрешены за счет способа определения ионов (аналитов) в жидкостях, в котором измеряют влияние этих ионов на активность фермента. Therefore, the aim of the invention is to provide a method and reagents that would avoid the above difficulties. In the invention, these problems are solved by a method for determining ions (analytes) in liquids, in which the effect of these ions on enzyme activity is measured.

Ключевым признаком изобретения является использование селективно связывающих агентов для доведения свободной концентрации аналита до оптимального интервала для аналитического фермента, особенно если разбавление жидкости невозможно. Дополнительным элементом изобретения является использование конкурентноспособных ингибиторов соответствующего аналитического фермента для снижения его чувствительности к аналиту, что позволяет измерять последний при более высоких концентрациях. Это особенно полезно, например, если селективно связывающие агенты труднодоступны или неприемлемо дороги. A key feature of the invention is the use of selectively binding agents to bring the free concentration of the analyte to the optimal range for the analytical enzyme, especially if dilution of the liquid is not possible. An additional element of the invention is the use of competitive inhibitors of the corresponding analytical enzyme to reduce its sensitivity to the analyte, which allows you to measure the latter at higher concentrations. This is especially useful, for example, if selectively binding agents are difficult to access or unacceptably expensive.

Другой особенностью изобретения является то, что используют селективно связывающие агенты для снижения свободных концентраций посторонних ионов до уровня, при котором их влияние более не принимается во внимание. Используют также тот факт, что конкурирующий ингибитор может взаимодействовать более эффективно с посторонними ионами, отличающимися от аналита, за счет чего возрастает чувствительность фермента к аналиту по сравнению с посторонним ионом. Another feature of the invention is that selectively binding agents are used to reduce free concentrations of foreign ions to a level at which their effect is no longer taken into account. They also use the fact that a competing inhibitor can interact more efficiently with extraneous ions different from the analyte, thereby increasing the sensitivity of the enzyme to the analyte compared to the extraneous ion.

Важным моментом является выбор оптимальных условий реакций, включая выбор подходящего изофермента, с тем, чтобы стимуляторные воздействия аналита оказались значительно сильнее, чем для посторонних ионов. В дополнение действия аналита и посторонних ионов на активность аналитического фермента должны быть аддитивны, с тем чтобы, если известна концентрация мешающих ионов, концентрацию аналита легко можно было бы определить по разности. Если известно, что посторонний ион присутствует в относительно постоянной концентрации в анализируемой жидкости, то на него может быть сделана поправка путем включения соответствующей концентрации постороннего иона в стандартные (калибровочные) растворы. Другим способом анализа таких аналитов является использование конкурентного связывающего анализа, если аналит вытесняет другой ион из связывающего агента, и определение действия высвобожденного иона на активность соответствующего фермента. An important point is the selection of optimal reaction conditions, including the selection of a suitable isoenzyme, so that the stimulatory effects of the analyte are much stronger than for extraneous ions. In addition, the actions of the analyte and foreign ions on the activity of the analytic enzyme should be additive so that if the concentration of interfering ions is known, the concentration of the analyte could easily be determined by the difference. If it is known that an extraneous ion is present in a relatively constant concentration in the analyzed liquid, then it can be corrected by including the corresponding concentration of the extraneous ion in standard (calibration) solutions. Another way to analyze such analytes is to use a competitive binding assay if the analyte displaces another ion from the binding agent and to determine the effect of the released ion on the activity of the corresponding enzyme.

Эти общие принципы можно проиллюстрировать более подробно, представив их применение для определения ионов калия, натрия, кальция, хлора и бикарбоната в плазме или сыворотке. Однако они применимы к широкому ряду ионов, например таких катионов, как катионы магния, марганца, лития, свинца, цинка, меди, железа или других тяжелых металлов. Примером неметаллических ионов, которые можно измерить, могут служить протоны или аммоний. Можно также определять такие вещества, как мочевина, которые служат источником аммония. These general principles can be illustrated in more detail by presenting their application for the determination of potassium, sodium, calcium, chlorine and bicarbonate ions in plasma or serum. However, they are applicable to a wide range of ions, for example, cations such as cations of magnesium, manganese, lithium, lead, zinc, copper, iron or other heavy metals. Examples of non-metallic ions that can be measured are protons or ammonium. You can also define substances such as urea, which serve as a source of ammonia.

Подходящие ферменты
В качестве подходящих ферментов можно указать (H.J. Evans et al. Ann. Rev. Plant Physiol. 17, 47, 1966):
Трансферазу, например трансферазу, переносящую фосфорсодержащие группы. Такой трансферазой может быть пируваткиназа. Вместо пируваткиназы можно использовать и другие киназы, такие, как аденилаткиназу или гексокиназу, чувствительные к иону магния или иону марганца. Другой трансферазой является ацетаткиназа (из E. Coli). Другим примером служит пиридоксалкиназа из мозга, которая чувствительна к ионам цинка.Suitable enzymes
Suitable enzymes include (HJ Evans et al. Ann. Rev. Plant Physiol. 17, 47, 1966):
A transferase, for example a transferase carrying phosphorus-containing groups. Such transferase may be pyruvate kinase. Instead of pyruvate kinase, other kinases can also be used, such as adenylate kinase or hexokinase, which are sensitive to magnesium or manganese ions. Another transferase is acetate kinase (from E. Coli). Another example is pyridoxalkinase from the brain, which is sensitive to zinc ions.

Гидролазы, такие, как гликозидаза, например α- или β-D-галактозидаза (из E. coli), карбоксипептидаза A (из бычьей поджелудочной железы), коллагеназа (из Clostridium hystolicum), амилаза (из слюны или поджелудочной железы) или фосфогликоллятфосфотаза. Hydrolases, such as glycosidase, for example, α- or β-D-galactosidase (from E. coli), carboxypeptidase A (from bovine pancreas), collagenase (from Clostridium hystolicum), amylase (from saliva or pancreas) or phosphoglycolate phosphatase.

Такие пептидные гидролазы, как цистеин или тиолзависимые протеиназы, конкретные примеры которых Calpain I и II, называемые также активированными кальцием нейтральными протеазами, описанные Сасаки с сотрудниками в J. Biol. Chem. 259, 12489-12494 (1984). Последние ферменты можно выделить и очистить из различных тканей животных, например из печени и почек крысы, эритроцитов человека и свиньи, мозга быка и скелетного мускула кролика по способам Китахары с сотрудниками, описанным в J. Biochem. 95, 1759 1766 (1984). Еще одним примером может служить дипептидиламинопептидаза Е.С. 3.4.14.1, Cathepsin C/, J. Ken. Mc. Donald, Bioch. Biophys. Res. Communication, 24 /5/, 66, 77f. Другим источником ферментов являются протеины, полученные с помощью генной рекомбинантной методики. Peptide hydrolases such as cysteine or thiol-dependent proteinases, specific examples of which are Calpain I and II, also called calcium activated neutral proteases, are described by Sasaki et al. In J. Biol. Chem. 259, 12489-12494 (1984). The latter enzymes can be isolated and purified from various animal tissues, for example, from the liver and kidneys of rats, human and pig erythrocytes, the brain of a bull and the skeletal muscle of a rabbit according to the methods of Kitahara and colleagues described in J. Biochem. 95, 1759 1766 (1984). Another example is dipeptidyl aminopeptidase E.S. 3.4.14.1, Cathepsin C /, J. Ken. Mc. Donald, Bioch. Biophys. Res. Communication, 24/5 /, 66, 77f. Another source of enzymes are proteins obtained using a recombinant gene technique.

Оксидоредуктазы, такие, как глицериндегидрогеназа (из Enterobacter aerogenes), ацетальдегидрогеназа (из дрожжей) или тиросиназа (катехолоксидаза). Oxidoreductases, such as glycerine dehydrogenase (from Enterobacter aerogenes), acetaldehydrogenase (from yeast) or tyrosinase (catechol oxidase).

Лиазы, такие, как альдолаза (из дрожжей) или карбангидраза (из бычьих эритроцитов). Lyases, such as aldolase (from yeast) or carbanhydrase (from bovine red blood cells).

Другими подходящими ферментами являются различные ферменты из галофильных организмов, другим источником ферментов являются протеины, полученные методом генной рекомбинации. Other suitable enzymes are various enzymes from halophilic organisms, another source of enzymes are proteins obtained by gene recombination.

Селективные связывающие агенты
Для связывания аналитов или посторонних ионов можно использовать широкий круг связывающих агентов. Такими связывающими или маскирующими веществами являются криптанды, коронарды, краунэфиры, поданды, сферанды, гемисферанды, каликсарены и их сочетания, природные ионоформы, например антибиотики, циклические пептиды, подобные валиномицину, комплексоны и хелатирующие агенты, например иминодиуксусная кислота, ЕДТА, нитротриуксусная кислота и их производные. Такие соединения описаны в Kontakte (Merck), 1977, N 1, p. 11ff p. 29ff; Kontakte (Merck), 1977, N 2, p. 16ff; Kontakte (Merck), 1977, N 3, p. 36ff, Phase Transfer Catelysts, Properties and Applications (Merck-Schuchardt) 1987, Thermodynamic and Kinetic Data for Cation-Macrocycle Interaction; R. M. Izatf et al. Chemical Reviews, 85, 271 339 (1985); Data for Biochem. Research, 1986, R. M. C. Dawson et al. Eds. 3rd edit. 399 415 (Clarendon Press) Oxford; F. Vogtle et al. Chem. Macrocycles, Springer Verlay, New York, 1985; G. W. Gokel et al. Eds. Macrocyclic Polyether Synthesis, Springer Verlag, New York, 1982; M.Hiraoka, Ed. Crown Compounds, Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, 1982; J. M. Lehn et. al. J. Am. Chem. Soc. 97, 6700 6707 (1975); G. Schwarzenbach et al. Helv. Chim. Acta, 28.828 (1945); S F. A. Kettle, Koordinationsverbindungen, Taschen fext 3, Verlag Chemie, Weinheim/Wergstr. 1972; A.E. Marfell et al. Die Cremie der Metallchelatverbindungen, Verlag Chemie, Weinheim/Bergstr. 1958; M. Becke-boehring et al. Komplexchemie, Springer Verlag, 1970; F. Kober, Grundlagen der Komlexchemie, Otto Salle Verlag, Frankfurt/Main, 1979; G. Schwarzenbach et al. Helv. Chim. Acfa 31, 1029 (1948); R.G. Pearson et al. Scieuce, 151, 172/1966/.Selective Binding Agents
A wide variety of binding agents can be used to bind analytes or foreign ions. Such binders or masking agents are cryptands, coronards, crown ethers, podands, spherands, hemispheres, calixarenes and their combinations, natural ionoforms, for example antibiotics, cyclic peptides like valinomycin, complexones and chelating agents, for example iminodiacetic acid and EDTA derivatives. Such compounds are described in Kontakte (Merck), 1977, N 1, p. 11ff p. 29ff; Kontakte (Merck), 1977, N 2, p. 16ff; Kontakte (Merck), 1977, N 3, p. 36ff, Phase Transfer Catelysts, Properties and Applications (Merck-Schuchardt) 1987, Thermodynamic and Kinetic Data for Cation-Macrocycle Interaction; RM Izatf et al. Chemical Reviews, 85, 271 339 (1985); Data for Biochem. Research, 1986, RMC Dawson et al. Eds. 3rd edit. 399,415 (Clarendon Press) Oxford; F. Vogtle et al. Chem. Macrocycles, Springer Verlay, New York, 1985; GW Gokel et al. Eds. Macrocyclic Polyether Synthesis, Springer Verlag, New York, 1982; M. Hiraoka, Ed. Crown Compounds, Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, 1982; JM Lehn et. al. J. Am. Chem. Soc. 97, 6700 6707 (1975); G. Schwarzenbach et al. Helv. Chim. Acta, 28.828 (1945); S FA Kettle, Koordinationsverbindungen, Taschen fext 3, Verlag Chemie, Weinheim / Wergstr. 1972; AE Marfell et al. Die Cremie der Metallchelatverbindungen, Verlag Chemie, Weinheim / Bergstr. 1958; M. Becke-boehring et al. Komplexchemie, Springer Verlag, 1970; F. Kober, Grundlagen der Komlexchemie, Otto Salle Verlag, Frankfurt / Main, 1979; G. Schwarzenbach et al. Helv. Chim. Acfa 31, 1029 (1948); RG Pearson et al. Scieuce, 151, 172/1966 /.

Примерами хелаторов, способных связывать поливалентные ионы, в частности двухвалентные катионы, являются этиленгликоль-бис-(2-аминоэтиловый эфир)-N, N,N',N'-тетрауксусная кислота (называемая EGTA) и этилендинитрило/тетрауксусная кислота (ЕДТА). Хотя существует много связывающих агентов, которые могут связывать поливалентные ионы, например ЕДТА и его производные, агенты, которые способны связывать одновалентные ионы, встречаются реже. Тетрафенилбор связывает ионы калия. Однако группой соединений с более широкими возможностями являются криптаны, которые служат примерами реагентов, селективно связывающих моновалентные катионы в водных растворах (P.M. Izatt с сотрудниками. Chem. Reviews 85, 271 339). Специальными примерами криптандов являются Kryptofix^® соединения фирмы Merck-Schuchardt, например 4,7,13,16,21-пентаокса-1,10-диазабиикло 8.8.5-трикозан, Kryptofix^® 221, стр. 438, каталог Merck-Schuchardt 1987/1988, 810646 /K 221/, 4,7,13,16,21,24-гексаокса-1,10-диазабицикло 8.8.8 гексакозан, Kryptofix^® 222, стр. 438, каталог Merck-Schuchardt 1987/ 1988, 810647 /K 222/.Examples of chelators capable of binding polyvalent ions, in particular divalent cations, are ethylene glycol bis (2-aminoethyl ether) -N, N, N ', N'-tetraacetic acid (called EGTA) and ethylene dinitrile / tetraacetic acid (EDTA). Although there are many binding agents that can bind polyvalent ions, such as EDTA and its derivatives, agents that are able to bind monovalent ions are less common. Tetraphenylboron binds potassium ions. However, a group of compounds with greater capabilities are cryptans, which serve as examples of reagents that selectively bind monovalent cations in aqueous solutions (PM Izatt et al. Chem. Reviews 85, 271 339). Specific examples cryptands are the Kryptofix ^® Merck-Schuchardt firm connection, for example pentaoksa-4,7,13,16,21-1,10-8.8.5-diazabiiklo trikozan, Kryptofix ^® 221, pp. 438, Merck-Schuchardt catalog 1987 / 1988 810 646 / K 221 /, 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo 8.8.8 geksakozan, Kryptofix ^® 222, pp. 438, Merck-Schuchardt catalog 1987/1988, 810647 / K 222 /.

В качестве маскирующих соединений для исключения посторонних анионов потенциально можно использовать следующие классы соединений: анионкриптанды, гетероциклофаны, катапинанды и неорганические комплексы металлов или нерастворимые соли. Конкретные примеры соединений, комплексующих анионы, описаны в литературе: например, азамоно- или азополициклы, макроциклические четвертичные тетраэдронные соединения, макроциклические бисметаллкомплексы, макроциклы с ковалентно внедренными центрами льюисовых кислот, протонированные или алкилированные четвертичные криптанды или катапинанды (F.P. Schmidtchem Nachrichen Chem. Techn. lab. 36 /1/, p. 1988, S8f E, Craf. J. AMer. chem. Soc. 98 /20/, 1976, 6403; C.H. Park, J. Amer. chem. Soc. 90 /9/, 1968, 2431), также как, например, гексахлорный комплекс Fe /III/ или нитрат серебра. The following classes of compounds can potentially be used as masking compounds to exclude extraneous anions: anioncryptands, heterocyclophanes, catapinands and inorganic metal complexes or insoluble salts. Specific examples of anion-complexing compounds are described in the literature: for example, azamon or azopolicycles, macrocyclic quaternary tetrahedron compounds, macrocyclic bismetallic complexes, macrocycles with covalently inserted Lewis acid centers, protonated or alkylated quaternary cryptands, or Chem Nach Schmachin Lab Techn. 36/1 /, p. 1988, S8f E, Craf. J. AMer. Chem. Soc. 98/20 /, 1976, 6403; CH Park, J. Amer. Chem. Soc. 90/9 /, 1968, 2431), as well as, for example, the hexachlorine complex Fe / III / or silver nitrate.

Функция связывающих агентов
Эти связывающие агенты используют для следующих целей:
1. Для селективного связывания мешающих ионов.The function of binding agents
These binding agents are used for the following purposes:
1. For the selective binding of interfering ions.

2. Для снижения концентрации аналитов до оптимально измеряемых уровней, если невозможно разбавление образца. 2. To reduce analyte concentration to optimally measured levels if sample dilution is not possible.

3. Одним из вариантов изобретения является способ, в котором присутствующий связывающий агент образует комплекс с "индикаторными" ионами, причем из этих комплексов индикаторные ионы стехиометрически заменяются аналитическими ионами, и где определяется влияние замещенных индикаторных ионов на активность фермента, за счет чего получают косвенное определение величины концентрации аналитических ионов. Так, например, в таком способе ферментом служит пируваткиназа, индикаторными ионами являются ионы калия, связывающим агентом служит Kryptofix^® 221, а нужно определить ион натрия.3. One of the variants of the invention is a method in which the present binding agent forms a complex with "indicator" ions, moreover, from these complexes the indicator ions are stoichiometrically replaced by analytical ions, and where the effect of substituted indicator ions on the enzyme activity is determined, thereby obtaining an indirect determination the concentration of analytical ions. For example, in this process the enzyme is pyruvate kinase, the indicator ions are potassium ions, the binding agent is Kryptofix ^® 221, and it is necessary to determine the sodium ion.

Жидкости для анализа
Биологическими жидкостями, в которых проводят определение аналитов, являются кровь, сыворотка, плазма, пот, транссудаты или экструдаты или, например, моча. Другими примерами жидкостей могут служить водопроводная вода или экстракты пищевых продуктов или фруктов или такие ферментированные жидкости, как вино.Analysis liquids
The biological fluids in which the analytes are determined are blood, serum, plasma, sweat, transudates or extrudates, or, for example, urine. Other examples of liquids include tap water or food or fruit extracts or fermented liquids such as wine.

Применение общих принципов к определению ионов калия и натрия
Существенным требованием для удовлетворительного способа определения ионов калия в сыворотке или плазме, на основании чувствительности пируваткиназы к ионам калия, является исключение помех, создаваемых ионами натрия и аммония. В соответствии с общими принципами изобретения этого можно достичь одним или более из следующих способов:
1. Селективным связыванием ионов натрия подходящим связывающим агентом, например Kryptofix^® 221.Application of general principles to the determination of potassium and sodium ions
An essential requirement for a satisfactory method for determining potassium ions in serum or plasma, based on the sensitivity of pyruvate kinase to potassium ions, is the elimination of interference caused by sodium and ammonium ions. In accordance with the general principles of the invention, this can be achieved in one or more of the following ways:
1. The selective binding of sodium ions of a suitable coupling agent such as Kryptofix ^® 221.

2. Выбор Bacillus stearofhermophilus, а не мускул кролика в качестве источника пируваткиназы, так как бактериальный фермент обладает чувствительностью к ионам калия по отношению к ионам натрия, в два раза более высокой, нежели фермент мускула. 2. The choice of Bacillus stearofhermophilus rather than rabbit muscle as the source of pyruvate kinase, since the bacterial enzyme is sensitive to potassium ions in relation to sodium ions, twice as high as the muscle enzyme.

3. Включением в анализ ионов, которые являются конкурирующими ингибиторами чувствительного индикаторного фермента, например использование ионов лития для конкуренции с ионами натрия и ионами калия. 3. The inclusion in the analysis of ions that are competing inhibitors of a sensitive indicator enzyme, for example, the use of lithium ions to compete with sodium ions and potassium ions.

4. Ферментативным удалением ионов аммония. 4. Enzymatic removal of ammonium ions.

Так как ионы лития менее эффективны в качестве конкурирующих по сравнению с ионами калия, чистый эффект состоит в повышении относительной чувствительности пируваткиназы к ионам калия еще на 50% по сравнению с ионами натрия. Более того, в присутствии ионов лития действие ионов калия и ионов натрия на активность пируваткиназы становится скорее аддитивным, нежели кооперативным. Это представляет возможность измерения концентрации любого из ионов калия или натрия при условии, что концентрация другого иона известна. Since lithium ions are less effective as competing compared to potassium ions, the net effect is to increase the relative sensitivity of pyruvate kinase to potassium ions by another 50% compared with sodium ions. Moreover, in the presence of lithium ions, the effect of potassium ions and sodium ions on the activity of pyruvate kinase becomes more additive than cooperative. This makes it possible to measure the concentration of any of the potassium or sodium ions, provided that the concentration of the other ion is known.

По способам 2 и 3 в отсутствии связывающего агента можно получить относительную чувствительность пируваткиназы для калия по сравнению с ионами натрия порядка 100:1. Это означает, что даже при чрезвычайно аномальных концентрациях иона натрия либо 110 либо 170 ммоль/л, ошибка в измерении концентрации ионов калия не превысит 0,3 ммоля/л относительно нормальной концентрации иона натрия в плазме 140 ммолей/л (пример А). Это не считается достаточно точным для многих клинических целей. Однако, если истинная концентрация ионов натрия в плазме известна, достижима точность измерения ионов калия вплоть до ± 0,05 ммоля/л (пример B). Если объединить способы 1 3 и включить связывающий агент, например Kryptofix^® 221, относительную чувствительность пируваткиназы к ионам калия по сравнению с ионами натрия можно повысить до величины более чем 500:1. В этих условиях нет необходимости знать концентрацию ионов натрия для определения концентрации ионов калия в плазме вплоть до 0,05 ммоля/л (пример C).According to methods 2 and 3 in the absence of a binding agent, it is possible to obtain the relative sensitivity of pyruvate kinase to potassium compared with sodium ions of the order of 100: 1. This means that even with extremely abnormal concentrations of sodium ion, either 110 or 170 mmol / L, the error in measuring the concentration of potassium ions will not exceed 0.3 mmol / L relative to the normal concentration of sodium ion in plasma 140 mmol / L (example A). This is not considered accurate enough for many clinical purposes. However, if the true concentration of sodium ions in the plasma is known, the accuracy of measuring potassium ions up to ± 0.05 mmol / L is achievable (Example B). If we combine methods 1, 3 and include a binding agent such as Kryptofix ^® 221, the relative sensitivity of pyruvate kinase to potassium ions compared to sodium ions can be increased to greater than 500: 1. Under these conditions, it is not necessary to know the concentration of sodium ions to determine the concentration of potassium ions in plasma up to 0.05 mmol / L (example C).

Эти способы определения иона калия демонстрируют применимость общих принципов, разработанных в изобретении в плане снижения посторонних влияний. С другой стороны, измерение ионов натрия в сыворотке или плазме лучше иллюстрирует применение этих принципов для регулирования эффективной концентрации аналита. Одним из средств измерения ионов натрия, как вариант изобретения, является использование фермента, активность которого чувствительна к ионам натрия. Примером такого фермента может служить β-галактозидаза (Kuby et al. J. Amer. Chem. Soc. 75, 890, 1953). Однако интервал концентраций ионов натрия, к которому наиболее чувствителен этот фермент, гораздо ниже, чем обычно наблюдаемый в образцах плазмы, без стадии разбавления. These methods for determining potassium ion demonstrate the applicability of the general principles developed in the invention in terms of reducing extraneous influences. On the other hand, measuring sodium ions in serum or plasma better illustrates the application of these principles to regulate the effective concentration of analyte. One of the means of measuring sodium ions, as an embodiment of the invention, is the use of an enzyme whose activity is sensitive to sodium ions. An example of such an enzyme is β-galactosidase (Kuby et al. J. Amer. Chem. Soc. 75, 890, 1953). However, the range of concentrations of sodium ions, to which this enzyme is most sensitive, is much lower than usually observed in plasma samples, without a dilution step.

В соответствии с основными принципами изобретения для снижения эффективной концентрации ионов натрия до оптимального уровня используют следующую процедуру (в том случае, если разбавление образца невозможно). In accordance with the basic principles of the invention, the following procedure is used to reduce the effective concentration of sodium ions to an optimal level (in the event that sample dilution is not possible).

1. Используют агент, связывающий ион натрия, например Kryptofix^® 221.1. Use a binding agent sodium ion, e.g. Kryptofix ^® 221.

2. Используют ионы лития в качестве конкурирующего ингибитора β-галактозидазы, за счет чего снижают чувствительность фермента к ионам натрия. 2. Use lithium ions as a competing inhibitor of β-galactosidase, thereby reducing the sensitivity of the enzyme to sodium ions.

Объединение процедур 1 и 2 позволяет легко определять ионы натрия в плазме или сыворотке, используя b-галактозидазу, а количество связывающего агента можно изменить таким образом, чтобы свести к минимуму сигнал для концентраций ионов натрия ниже 110 ммоль/л, при этом сохраняя этот сигнал в обычном аналитическом интервале (110 170 ммоль/л) (пример D). The combination of procedures 1 and 2 makes it easy to determine sodium ions in plasma or serum using b-galactosidase, and the amount of binding agent can be changed so as to minimize the signal for sodium ion concentrations below 110 mmol / L, while maintaining this signal in the usual analytical interval (110 170 mmol / l) (example D).

Ионы натрия можно также измерять, используя пируваткиназу, при условии, что выбирают такие условия, при которых снижается стимуляция активности фермента ионами калия, а в реакционную смесь вводят агент, связывающий ион калия, например Kryptofix^® 222 (пример E).Sodium ions may also be measured, using pyruvate kinase, provided that conditions are chosen such, that reduce the stimulation of enzyme activity by potassium ions and the reaction mixture was introduced an agent that binds a potassium ion, such as Kryptofix ^® 222 (Example E).

В другом способе определения концентрации ионов натрия в плазме ионам натрия дают возможность вытеснить ионы калия из Kryptofix^® 221, а высвобожденные ионы калия стимулируют активность пируваткиназы пропорционально концентрации ионов натрия в плазме (пример F).In another method of determining the concentration of sodium ions in plasma sodium ions allowed to displace potassium ions from Kryptofix ^® 221, and the released potassium ions stimulating the activity of pyruvate kinase in proportion to the concentration of sodium ions in the plasma (Example F).

Другим вариантом изобретения являются композиции и реагенты для определения ионов в биологических и небиологических жидкостях. Another embodiment of the invention are compositions and reagents for determining ions in biological and non-biological fluids.

Реагент по способу изобретения может присутствовать в сухом виде или в виде раствора. Он может присутствовать как пропитка на соответствующем носителе. Диагностический агент в виде тестовой полости можно получить, пропитывая материал носителя, предпочтительно фильтровальную бумагу, целлюлозу или синтетическое волокно, растворами нужных реагентов, обычно используемых для получения тестовых полосок в легко испаряющихся растворителях, таких, как ацетон. Это занимает одну или более стадии пропитки. Полученные тестовые бумажки можно использовать как есть или предпочтительно закрепить между синтетической смолой и тонкой сеткой. The reagent according to the method of the invention may be present in dry form or in the form of a solution. It may be present as an impregnation on an appropriate carrier. A diagnostic agent in the form of a test cavity can be obtained by impregnating the carrier material, preferably filter paper, cellulose or synthetic fiber, with solutions of the desired reagents commonly used to prepare test strips in easily evaporating solvents such as acetone. This takes up one or more impregnation steps. The obtained test papers can be used as is, or preferably fixed between a synthetic resin and a fine mesh.

Далее варианты изобретения будут описаны более подробно, но следует учитывать, что изобретение не должно быть ограничено ни одной из комбинаций описанных деталей, в частности, могут быть использованы различные механические или химические варианты помимо описанных в предпочтительном варианте. Embodiments of the invention will now be described in more detail, but it should be borne in mind that the invention should not be limited to any of the combinations of the described parts, in particular, various mechanical or chemical variants besides those described in a preferred embodiment can be used.

Определение ионов натрия
В принципе определение ионов натрия с применением РК аналогично определению ионов калия. Однако существуют некоторые существенные отличия. Во-первых, РК примерно в 40 100 раз более чувствителен к иону калия, нежели к иону натрия, в зависимости от условий инкубирования, как было указано ранее. Поэтому даже если ионы натрия встречаются в плазме в концентрации, в 30 раз превышающей концентрацию ионов калия, последние будут мешать при определении ионов натрия.Determination of sodium ions
In principle, the determination of sodium ions using RK is similar to the determination of potassium ions. However, there are some significant differences. First, RK is about 40 to 100 times more sensitive to potassium ion than to sodium ion, depending on the incubation conditions, as indicated earlier. Therefore, even if sodium ions are found in plasma at a concentration 30 times higher than the concentration of potassium ions, the latter will interfere with the determination of sodium ions.

В соответствии с основными принципами изобретения ионы лития опускают. РК из мускула кролика предпочитают бактериальному ферменту, а ионы магния могут заменить ионы марганца. В одном из способов ионы калия специфически связывают Kryptofix^® 222 и влияние ионов натрия на РК-активность измеряют непосредственно (пример E).In accordance with the basic principles of the invention, lithium ions are omitted. RK from a rabbit muscle is preferred to a bacterial enzyme, and magnesium ions can replace manganese ions. In one method the potassium ions are specifically bind Kryptofix ^® 222 and the influence of sodium ions on PK-activity measured directly (Example E).

Типичные интервалы концентраций основных реагентов для ферментативного определения ионов натрия при 37^oC с использованием пируваткиназы см. в табл. 1.Typical ranges of concentrations of the main reagents for the enzymatic determination of sodium ions at 37 ^o C using pyruvate kinase, see table. one.

В другом способе иону натрия дают возможность вытеснить ионы калия из Kryptofix^® 221, а высвобожденные ионы калия стимулируют активность РК в степени, находящейся в зависимости от концентрации ионов натрия (пример F).In another method, the sodium ion was allowed to displace potassium ions from Kryptofix ^® 221, and the released potassium ions stimulating the activity of a RC extent located as a function of sodium ion concentration (Example F).

Типичные интервалы концентраций основных реагентов для ферментативного определения ионов натрия при 37^oC с применением пируваткиназы для определения замещения ионов калия из Kryptofix^® 221 см. в табл. 2.Typical ranges of concentrations of the main reagents for the enzymatic determination of sodium ions at 37 ^o C using pyruvate kinase to determine the substitution of potassium ions from Kryptofix ^® 221 see table. 2.

В более прецизионном варианте для определения используют такой зависящий от ионов натрия фермент, как β-галактозидазу (пример D). In a more precise embodiment, a sodium ion-dependent enzyme such as β-galactosidase (Example D) is used for determination.

Плазму крови инкубируют с буферированной смесью, содержащей 2-нитрофенил-b-D-галактопиранозид (NPG) и фермент b-D-галактозидазу. Реакция катализируется b-D-галактозидазой и зависит от наличия ионов натрия, степени активности и является мерой концентрирования ионов натрия. Ключевым признаком этого способа является использование соответствующего количества селективного для иона натрия связывающего агента (например, Kryptofix^® 221) для измерений в сыворотке или других биологических жидкостей, где концентрация ионов натрия может превышать 100 ммоль/л, для снижения концентрации ионов натрия, так как этот фермент наиболее чувствителен к небольшим изменениям концентрации ионов натрия в обычном аналитическом интервале (110-170 ммоль/л). В выбранных условиях для анализа, которые включают наличие умеренных концентраций ионов магния и лития, скорость образования 2-нитрофенола и галактозы на деле пропорциональна концентрации измеряемых ионов натрия. Ионы магния необходимы для оптимальной активности β-галактозидазы. Ионы лития конкурируют с ионами нария, и поэтому возникает Км фермента для ионов натрия.Blood plasma is incubated with a buffered mixture containing 2-nitrophenyl-bD-galactopyranoside (NPG) and the enzyme bD-galactosidase. The reaction is catalyzed by bD-galactosidase and depends on the presence of sodium ions, the degree of activity and is a measure of the concentration of sodium ions. A key feature of this method is the use of an appropriate amount of a selective for sodium ion binding agent (e.g., Kryptofix ^® 221) for measurements in serum or other biological fluids where the sodium ion concentration may exceed 100 mmol / l, to reduce sodium ion concentration, as this the enzyme is most sensitive to small changes in the concentration of sodium ions in the usual analytical range (110-170 mmol / l). Under the selected conditions for analysis, which include the presence of moderate concentrations of magnesium and lithium ions, the rate of formation of 2-nitrophenol and galactose is actually proportional to the concentration of the measured sodium ions. Magnesium ions are necessary for the optimal activity of β-galactosidase. Lithium ions compete with narya ions, and therefore Km of the enzyme for sodium ions occurs.

В качестве субстрата для b-D-галактозидазы подходят многие другие соединения. Чаще всего образец, содержащий галактозидазу, смешивают с соответствующим b-D-галактозидазным субстратом, причем субстрат расщеплен ферментом, а один из продуктов расщепления определяют затем соответствующим образом. Можно измерить либо гликон, высвобожденный под действием фермента, либо агликон. Как правило, определяют последний. В качестве субстрата можно использовать природный субстрат лактозы, но особенно выгодно использовать хромогенный галактозид. Так, в Biochem. Z. 333, 209 (1960) описаны фенил b-D-галактозид, также как и некоторые другие производные замещенные по ароматическому кольцу, например, 2-нитрофенил-b-D-галактозид (NPG) и 3-нитрофенил-b-D-галактозид, в качестве субстрата b-D-галактозидазы. Фенолы, высвобожденные в результате гидролиза, определяют фотометрически в интервале УФ или в случае нитрофенолов в коротковолновом видимом диапазоне. Окислительное присоединение к аминоантипирину также может служить индикаторной реакцией (см. Analytical Biochem. /40, 281 (1971). Другие субстраты описаны в западногерманской открытой патентной выкладке N 3345748 и западногерманской открытой патентной выкладке 3411574. Many other compounds are suitable as a substrate for b-D-galactosidase. Most often, a sample containing galactosidase is mixed with the corresponding b-D-galactosidase substrate, the substrate being cleaved by an enzyme and one of the cleavage products then determined accordingly. Either glycon released by the enzyme or aglycon can be measured. As a rule, determine the latter. A natural lactose substrate can be used as a substrate, but chromogenic galactoside is especially beneficial. So, in Biochem. Z. 333, 209 (1960) describes phenyl bD-galactoside, as well as some other derivatives substituted on the aromatic ring, for example, 2-nitrophenyl-bD-galactoside (NPG) and 3-nitrophenyl-bD-galactoside, as a substrate bD -galactosidase. Phenols released by hydrolysis are determined photometrically in the UV range or, in the case of nitrophenols, in the short-wavelength visible range. The oxidative addition to aminoantipyrine can also serve as an indicator reaction (see Analytical Biochem. / 40, 281 (1971). Other substrates are described in West German Open Patent Layout No. 3345748 and West German Open Patent Layout 3411574.

Типичные концентрированные интервалы основных реагентов для ферментативного определения ионов натрия при 37^oC с использованием 10 мкл образцов плазмы или сыворотки см. в табл. 3.Typical concentrated intervals of the main reagents for the enzymatic determination of sodium ions at 37 ^o C using 10 μl of plasma or serum samples, see table. 3.

EGTA означает этиленбис(оксиэтиленнитрило)-тетрауксусная кислота. EGTA means ethylene bis (hydroxyethylene nitrile) -tetraacetic acid.

Имеется также возможность проводить анализ ионов натрия и калия ферментативно в одной и той же кювете в виде сведенного теста (пример G). It is also possible to analyze the sodium and potassium ions enzymatically in the same cuvette in the form of a reduced test (Example G).

Пример D. Определение концентрации ионов натрия с использованием b-D-галактозидазы
Вариант а
Окончательная инкубируемая смесь содержит:
300 ммоль/л Трис HCl, pH 8,7 (37^oC)
4 ммоль/л дитиотреитола
7,5 ммоль/л сульфата магния
16 ммоль/л литийхлорида
0,44 ммоль/л EGTA (литиевая соль)
460 мг/л альбумина сыворотки человека.Example D. Determination of the concentration of sodium ions using bD-galactosidase
Option a
The final incubated mixture contains:
300 mmol / L Tris HCl, pH 8.7 (37 ^° C)
4 mmol / l dithiothreitol
7.5 mmol / L magnesium sulfate
16 mmol / L lithium chloride
0.44 mmol / L EGTA (lithium salt)
460 mg / l of human serum albumin.

760 ед/л b-галактозидазы
1,5 ммоль/л NPQ
1,25 мкмоль/анализ Kryptofix^® 221
За ходом реакции следят при длине волны 420 нм (или около этого значения) для определения скорости образования свободного 2-нитрофенола и, следовательно, концентрации ионов натрия в органическом образце.760 units / l b-galactosidase
1.5 mmol / L NPQ
1.25 .mu.mol / Kryptofix ^® 221 Analysis
The progress of the reaction is monitored at a wavelength of 420 nm (or near this value) to determine the rate of formation of free 2-nitrophenol and, consequently, the concentration of sodium ions in the organic sample.

Вариант b
В альтернативном варианте по сравнению с вариантом а снижают концентрацию образца путем десятикратного предварительного разбавления или используют маленький объем образца, и в этом случае криптанд можно не добавлять.Option b
Alternatively, compared with option a, the concentration of the sample is reduced by ten-fold preliminary dilution or a small volume of the sample is used, in which case cryptand can be omitted.

Вариант c
Измерения проводят в жидкости с низким содержанием иона натрия, например, менее 20 ммоль/л, и в этом случае криптанд можно не добавлять.Option c
Measurements are carried out in liquids with a low sodium ion content, for example, less than 20 mmol / L, in which case cryptand can be omitted.

Пример E. Определение ионов натрия с использованием пируваткиназы, непосредственная стимуляция активности фермента ионами натрия, в условиях, когда понижена чувствительность ионов калия. Example E. Determination of sodium ions using pyruvate kinase, direct stimulation of the enzyme activity by sodium ions, in conditions when the sensitivity of potassium ions is reduced.

Вариант a
Инкубируемая смесь содержит на 10 мкл плазмы:
300 ммоль/л Трис HCl, pH 8,7 (37^oC)
5 ммоль/л MgCl₂
2,6 ммоль/л АDР (свободная кислота)
2,9 ммоль/л РЕР (нейтрализованная Трис соль)
0,34 ммоль/л NADH
17 000 ед/л LDH (определено при 25^oC)
2000 ед/л РК (из мускула кролика, определено при 37^oC)
4 ммоль/л KG
8600 ед/л CDH в глицерине (определено при 25^oC)
1,25 мкмоль/анализ Kryptofix^® 222
Калибровочные для ионов натрия растворы содержат 4 ммоль/л калия для компенсации активирующего действия калия в виде ионов калия в сыворотке на пируваткиназу.Option a
The incubated mixture contains 10 μl of plasma:
300 mmol / L Tris HCl, pH 8.7 (37 ^° C)
5 mmol / L MgCl ₂
2.6 mmol / L ADP (free acid)
2.9 mmol / L PEP (neutralized Tris salt)
0.34 mmol / L NADH
17,000 units / l LDH (determined at 25 ^o C)
2000 u / l RK (from rabbit muscle, determined at 37 ^o C)
4 mmol / L KG
8600 u / l CDH in glycerol (determined at 25 ^o C)
1.25 .mu.mol / Kryptofix ^® 222 Analysis
Calibration solutions for sodium ions contain 4 mmol / L potassium to compensate for the activating effect of potassium in the form of serum potassium ions on pyruvate kinase.

Пример F. Определение ионов натрия с помощью пируваткиназы (конкурирующий связывающий анализ) концентрация ионов калия известна
Инкубируемая смесь содержит на образец плазмы в 10 мкл:
300 ммоль/л глицерина, pH 9,8
5 ммоль/л MgCl₂
2,6 ммоль/л АDР (свободная кислота)
2,9 ммоль/л РЕР (нейтрализованная Трис соль)
0,34 ммоль/л NADH
17 000 ед/л LDH (определено при 25^oC)
890 ед/л РК из мускула кролика (определено при 37^oC)
4 ммоль/л KG
8500 ед/л СDН (определено при 25^oC)
2,5 мкмоль/анализ Kryptofix^® 221
5 ммоль/л KCl
К реагенту добавляют калийхлорид и он, вытесняя стехиометрически из Kryptofix^® 221 ионы натрия, позволяет количественно определять концентрацию ионов натрия в образце.Example F. Determination of sodium ions using pyruvate kinase (competing binding analysis) the concentration of potassium ions is known
The incubated mixture contains on a plasma sample in 10 μl:
300 mmol / L glycerol, pH 9.8
5 mmol / L MgCl ₂
2.6 mmol / L ADP (free acid)
2.9 mmol / L PEP (neutralized Tris salt)
0.34 mmol / L NADH
17,000 units / l LDH (determined at 25 ^o C)
890 U / L of the RK from the muscle of the rabbit (determined at 37 ^o C)
4 mmol / L KG
8500 U / L CDH (determined at 25 ^o C)
2.5 .mu.mol / Kryptofix ^® 221 Analysis
5 mmol / L KCl
Potassium chloride is added to the reagent, and it, displacing sodium ions stoichiometrically from Kryptofix ^® 221, allows the quantification of the concentration of sodium ions in the sample.

Пример G. Определение концентрации ионов калия и ионов натрия в одной и той же кювете (двойной тест)
Вначале определяют, как и в примере D, концентрацию ионов натрия, за исключением того, что комплекс содержит также:
2,6 ммоль/л АDР (свободная кислота)
2,9 ммоль/л РЕР (нейтрализованная Трис соль)
0,4 ммоль/л NADH
4,0 ммоль/л KG
8600 ед/л GDH
После определения ионов натрия с помощью определения скорости реакции pH инкубируемой смеси понижают до pH 7,4 аликвотными порциями соляной кислоты.Example G. Determination of the concentration of potassium ions and sodium ions in the same cuvette (double test)
First, as in Example D, the concentration of sodium ions is determined, except that the complex also contains:
2.6 mmol / L ADP (free acid)
2.9 mmol / L PEP (neutralized Tris salt)
0.4 mmol / L NADH
4.0 mmol / L KG
8600 units / l GDH
After the determination of sodium ions by determining the reaction rate, the pH of the incubated mixture is reduced to pH 7.4 in aliquots of hydrochloric acid.

Затем добавляют следующие ингредиенты для достижения окончательных концентраций:
1700 ед/л LDH
890 ед/л РК из Bacillus stearothermophilus
3,0 ммоль/л MgCl₂
20,0 ммоль/л LiCl
Затем скорость реакции контролируют на длине волны 340 нм, но ее можно также измерять и на несколько более высоком значении длины волны для того, чтобы минимизировать возможные помехи из-за 2-нитрофенола, который высвобождается в индикаторной реакции на ионы натрия.The following ingredients are then added to achieve final concentrations:
1700 units / l LDH
890 U / L RK from Bacillus stearothermophilus
3.0 mmol / L MgCl ₂
20.0 mmol / L LiCl
Then, the reaction rate is controlled at a wavelength of 340 nm, but it can also be measured at a slightly higher wavelength in order to minimize possible interference due to 2-nitrophenol, which is released in the indicator reaction to sodium ions.

Claims

1. Composition for determining sodium ions, characterized in that it includes
β-D-galactosidase, units / l 25 7500
NPG, mmol / L 0.25 5.0
Kryptofix ^® 221, mmol / l Not more than 10
Buffer, pH 7 9.5, mmol / L 200 500
Mg ²⁺ , mmol 0.01 10.0
EGTA (lithium salt), mmol / l Not more than 20
Serum Albumin, g / l Not more than 5
2. Composition for determining sodium ions, characterized in that it is preferably used at 37 ^o C and it includes
RK (rabbit muscle), units / l 50 10000
PEP (neutralized Tris-salt), mmol / L 0.3 30
Kryptofix ^® 221, mmol / L 1 10
NADH, mmol / L 0.01 0.8
Buffer, pH 9 10, mmol / L 50 500
Md ²⁺ , mmol / L 1 10
ADP (free acid), mmol / L 0.5 10.0
LDH (determined at 25 ^o C), mmol / l u / l 5000 100000
KCl, mmol / L 2 10
Serum Albumin, g / l Not more than 5
GDH (determined at 25 ^o C), units / l 2500 20000
KG (free acid), mmol / l 1 10
3. Composition for determining sodium ions, characterized in that it is preferably used at 37 ^o C and it includes
RK (rabbit muscle), units / l 50 10000
PEP (neutralized Tris-salt), mmol / L 0.3 30
Kryptofix ^® 221, mmol / L 0.4 4.0
NADH, mmol / L 0.01 0.8
Buffer, pH 9 10, mmol / L 50 500
Md ²⁺ , mmol / L 1 10
ADP (free acid), mmol / L 0.5 10.0
LDH (determined at 25 ^o C), mmol / l u / l 5000 100000
KCl, mmol / L 2 10
Serum Albumin, g / l Not more than 5
GDH (determined at 25 ^o C), units / l 2500 20000
KG (free acid), mmol / l 1 10