RU2081170C1

RU2081170C1 - Compound based on styrene and divinylbenzene macroporous copolymer as immunosorbent for removing diphtheria toxin from organism biological fluids

Info

Publication number: RU2081170C1
Application number: RU9595105761A
Authority: RU
Original assignee: Российский химико-технологический университет им.Д.И.Менделеева
Priority date: 1995-04-13
Filing date: 1995-04-13
Publication date: 1997-06-10
Also published as: RU95105761A

Abstract

FIELD: medicine, sorbents. SUBSTANCE: invention relates to immunosorbent for removing diphtheria toxin from biological fluids of organism. Immunosorbent is based on styrene and divinylbenzene macroporous copolymer that exhibits capability for selective and effective removing diphtheria toxin antigens from organism. EFFECT: enhanced effectiveness of sorbent. 2 tbl

Description

Изобретение относится к области получения иммуносорбентов и может быть использовано для лечения дифтерии методом иммуносорбции, для проведения различных иммунологических исследований. В настоящее время единственным средством специфического лечения дифтерии является инъекция противодифтерийной сыворотки /1/. В то же время из-за высокой концентрации балластных белков и большой дозы вводимой сыворотки, наличия консерванта в препарате (хлороформа) у больных нередко наблюдаются анафилактический шок, развитие аллергических форм осложнений /2/. The invention relates to the field of production of immunosorbents and can be used for the treatment of diphtheria by immunosorption, for various immunological studies. Currently, the only means of specific treatment for diphtheria is the injection of antidiphtheria serum / 1 /. At the same time, anaphylactic shock and the development of allergic forms of complications are often observed in patients due to the high concentration of ballast proteins and a large dose of injected serum, the presence of a preservative in the drug (chloroform).

В этой связи наиболее перспективным представляется лечение данного заболевания сорбционными методами, в частности, иммуносорбцией антител дифтерийного токсина. Попытки использовать активированные угли для удаления дифтерийного токсина из плазмы продемонстрировали очень низкий уровень сорбционной емкости по дифтерийному токсину /3/. In this regard, the treatment of this disease with sorption methods, in particular, immunosorption of diphtheria toxin antibodies, seems to be the most promising. Attempts to use activated carbon to remove diphtheria toxin from plasma showed a very low level of sorption capacity for diphtheria toxin / 3 /.

Задачей изобретения является разработка иммуносорбента на основе макропористого сополимера стирола и дивинилбензола, обладающего свойством избирательно и эффективно удалять из биологических жидкостей организма антигены дифтерийного токсина. The objective of the invention is to develop an immunosorbent based on a macroporous copolymer of styrene and divinylbenzene, which is able to selectively and effectively remove diphtheria toxin antigens from biological fluids of the body.

Поставленная задача решается разработкой нового иммуносорбента - гидрофобно или ковалентно связанной белковой фракции сыворотки крови лошади, гипериммунизированной дифтерийным анатоксином на макропористом сополимере стирола и дивинилбензола общей формулы:

где m=0,087-0,02; n=0,255-0,255; k=0,003-0,012; l=0,655-0,713 с удельной поверхностью 87-102 м²/г, средним эффективным радиусом пор 100-198 нм, имеющего следующий элементный состав и характеристики ( на сухое вещество):
C 30-29%
H 30-28,5%
O 38-39,5%
N 1,84-2,4%
S 0,002-0,006%
Соединение представляет собой светло-коричневые гранулы размером в диаметре 0,05 0,07 см, не растворимые в воде, хлороформе, ацетоне, спирте, в растворах соляной, азотной, уксусной, серной кислот и щелочей.The problem is solved by the development of a new immunosorbent - a hydrophobic or covalently bound protein fraction of horse serum hyperimmunized with diphtheria toxoid on a macroporous copolymer of styrene and divinylbenzene of the general formula:

where m = 0.087-0.02; n = 0.255-0.255; k = 0.003-0.012; l = 0.655-0.713 with a specific surface area of 87-102 m ² / g, an average effective pore radius of 100-198 nm, having the following elemental composition and characteristics (dry matter):
C 30-29%
H 30-28.5%
O 38-39.5%
N 1.84-2.4%
S 0.002-0.006%
The compound is light brown granules with a diameter of 0.05 0.07 cm, insoluble in water, chloroform, acetone, alcohol, in solutions of hydrochloric, nitric, acetic, sulfuric acids and alkalis.

Способ получения этого соединения в качестве иммуносорбента основан на известной реакции связывания аминогрупп белка с функциональной группой твердофазного носителя /4/, в данном случае с -OH или -CHO, или

или P(CH₂OH)(O)OH, предпочтительно с -OH группами.The method for preparing this compound as an immunosorbent is based on the known reaction of binding of amino groups of a protein to a functional group of a solid phase carrier / 4 /, in this case, -OH or -CHO, or

or P (CH ₂ OH) (O) OH, preferably with —OH groups.

Такие полимерные носители выпускают на НПО "Биолар" государства Латвия (Т 6-09-10-1494-80, ТУ 6-09-23-16-88, ТУ 6-09-23-17-88, ТУ 6-09-10-1785-86). При иммобилизации сыворотки на носителях на основе макропористого сополимера стирола и дивинилбензола с удельной поверхностью 90-130 м²/г, среднем эффективном радиусе пор 66-100 нм наблюдали фракционирование белков и низкую степень превращения.Such polymer carriers are produced at the Biolar NGO of the State of Latvia (T 6-09-10-1494-80, TU 6-09-23-16-88, TU 6-09-23-17-88, TU 6-09- 10-1785-86). When whey was immobilized on supports based on a macroporous copolymer of styrene and divinylbenzene with a specific surface area of 90-130 m ² / g, an average effective pore radius of 66-100 nm, protein fractionation and a low degree of conversion were observed.

Источником антител для приготовления иммуносорбента являлась коммерческая противодифтерийная сыворотка производства НПО "Биомед" г.Уфы. The source of antibodies for the preparation of the immunosorbent was commercial anti-diphtheria serum produced by the NGO Biomed in Ufa.

Способ получения предлагаемого соединения осуществляется обработкой белковой фракцией сыворотки крови лошади, гипериммунизированной дифтерийным анатоксином, макропористого сополимера стирола и дивинилбензола, содержащего в своей структуре функциональную группу, например -OH. Сополимер предварительно выдерживает в фосфатном буфере с pH=7,25-7,35 и иммобилизацию белковой фракции проводят при 22-27^oC в течение 2-4 ч, после чего сорбент промывают пятикратным объемом фосфатного буфера.A method of obtaining the proposed compound is carried out by treating a protein fraction of horse serum hyperimmunized with diphtheria toxoid, a macroporous copolymer of styrene and divinylbenzene containing in its structure a functional group, for example, -OH. The copolymer is preliminarily held in phosphate buffer with pH = 7.25-7.35 and the protein fraction is immobilized at 22-27 ^° C for 2-4 hours, after which the sorbent is washed with a five-fold volume of phosphate buffer.

Полученный сорбент проявляет свойства иммуносорбента, обладает высокой по сравнению с углями сорбционной емкостью по дифтерийному токсину (ДТ), высокой скоростью извлечения. Емкость иммуносорбента по ДТ составляет 7 DLM/г из плазмы, в отличие от углей, для которых она в этих условиях составляет 0,3-0,6 DLM/г. Увеличение емкости по ДТ на полимерном иммуносорбенте можно объяснить созданием благоприятных условий стерического взаимодействия при образовании иммунного комплекса. Ниже приведены примеры получения и испытания иммуносорбента в эксперименте на животных. The resulting sorbent exhibits the properties of an immunosorbent, has a high sorption capacity for diphtheria toxin (DT) compared to coals, and a high extraction rate. The capacity of the immunosorbent for DT is 7 DLM / g from plasma, in contrast to coal, for which it is under these conditions 0.3-0.6 DLM / g. The increase in DT capacity on a polymer immunosorbent can be explained by the creation of favorable conditions for steric interaction during the formation of the immune complex. Below are examples of the preparation and testing of an immunosorbent in an animal experiment.

Пример 1. В реактор загружают 20 г макропористого сополимера стирола и дивинилбензола (S_уд= 102 м²/г, r=198 нм, плотность 0,5 см³/г), содержащего в своей структуре 2 мМ/г оксигрупп, предварительно в течение 1 ч набухшего в фосфатном буфере. Вводят 150 мл раствора сыворотки крови лошади, гипериммунизированной дифтерийным анатоксином (с активностью 1700 МЕ/мл), в фосфатном буфере. Реакционную смесь перемешивают и выдерживают при 22^oC в течение 4 ч. По окончании отделяют фильтрованием твердую фазу и промывают последовательно пятикратным объемом фосфатного буфера, избытком 1 М раствора глицина и пятикратным избытком фосфатного буфера. Получают иммуносорбент со степенью превращения по белку 86% Состав сухого вещества следующий: C=30% H= 30% O= 38% N=1,84% S=0,002% При продолжительности процесса больше 4 ч заметного увеличения степени превращения не наблюдали.Example 1. In the reactor load 20 g of a macroporous copolymer of styrene and divinylbenzene (S _beats = 102 m ² / g, r = 198 nm, density 0.5 cm ³ / g) containing in its structure 2 mm / g of hydroxy groups, previously in for 1 h swollen in phosphate buffer. Enter 150 ml of a solution of horse serum hyperimmunized with diphtheria toxoid (with an activity of 1700 IU / ml) in phosphate buffer. The reaction mixture was stirred and kept at 22 ^° C. for 4 hours. At the end, the solid phase was separated by filtration and washed successively with a five-fold volume of phosphate buffer, an excess of 1 M glycine solution and a five-fold excess of phosphate buffer. An immunosorbent is obtained with a protein conversion of 86%. The dry matter composition is as follows: C = 30% H = 30% O = 38% N = 1.84% S = 0.002%. With a process duration of more than 4 hours, no significant increase in the degree of conversion was observed.

Пример 2. В реактор загружают 20 г. макропористого сополимера стирола и дивинилбензола, сыворотку крови лошади, как описано в примере 1. Реакционную смесь перемешивают и выдерживают при 27^oC в течение 4 ч. По окончании процесса проводят обработку твердой фазы, как описано выше. Получают иммуносорбент со степенью превращения по белку 98% Состав сухого вещества следующий: C=29% H=28,5% O=39,5% N=2,4% S=0,006% При увеличении температуры на 5^o или 10^oC степень превращения по белку заметно снижается.Example 2. The reactor is loaded with 20 g of a macroporous copolymer of styrene and divinylbenzene, horse blood serum, as described in example 1. The reaction mixture is stirred and maintained at 27 ^o C for 4 hours. At the end of the process, the solid phase is treated as described above . An immunosorbent is obtained with a protein conversion of 98%. The dry matter composition is as follows: C = 29% H = 28.5% O = 39.5% N = 2.4% S = 0.006% With a temperature increase of 5 ^o or 10 ^o C the degree of protein conversion is markedly reduced.

Пример 3. (Испытание иммуносорбента). Навеску сорбента (иммуносорбента и углей для сравнения) порядка 0,5 г или 1 г помещают в бюксы, заливают 2,5 мл плазмы крови человека или фосфатно-солевого буфера (концентрация ДТ в исходной плазме 0,964 DLM/мл, в фосфатно-солевом буфере 0,982 DLM/мл. Чувствительность реакции по контрольному анатоксину составляла 1:16000, по рабочему раствору отстандартизованного дифтерийного токсина также 16000) и проводят инкубацию при 37^oC на встряхивателе в течение 3 ч. Емкость по ДТ для углей была приблизительно одинакова и составляла 0,8-1,3 DLM/г из фосфатно-солевого буфера и 0,3-0,6 DLM/г из плазмы. Емкость иммуносорбента из плазмы составляла 7 DLM/г.Example 3. (Test immunosorbent). A weighed portion of the sorbent (immunosorbent and charcoal for comparison) of the order of 0.5 g or 1 g is placed in bottles, 2.5 ml of human blood plasma or phosphate-saline buffer is poured (concentration of DT in the initial plasma is 0.964 DLM / ml, in phosphate-buffered saline 0.982 DLM / ml, the Sensitivity of the reaction to the control toxoid was 1: 16000, the working solution of standardized diphtheria toxin is also 16000) and incubated at 37 ^o C on a shaker for 3 hours the DT capacity for coal was approximately the same and was 0, 8-1.3 DLM / g from phosphate-buffered saline and 0.3-0.6 DLM / g from plasma. The plasma immunosorbent capacity was 7 DLM / g.

Пример 4. Антигенсодержащий раствор после инкубации (по описанию в примере 1) вводили подкожно в дозе 1,5 DLM морским свинкам. Результаты опыта приведены в табл. 1. Example 4. Antigen-containing solution after incubation (as described in example 1) was administered subcutaneously at a dose of 1.5 DLM to guinea pigs. The results of the experiment are given in table. one.

Как видно из табл. 1, животные, получившие вытяжку ДТ, защищенную иммуносорбентом, не погибали в течение 3 мес от начала опыта. В то время как контрольные, без защиты вытяжки сорбентом, погибали на вторые сутки. As can be seen from the table. 1, animals that received an extract of DT protected by an immunosorbent did not die within 3 months from the start of the experiment. While the control, without the protection of the hood by the sorbent, died on the second day.

В табл. 2 приведены результаты испытаний иммуносорбента в эксперименте на кроликах после введения им внутривенно и внутримышечно ДТ. In the table. 2 shows the results of tests of an immunosorbent in an experiment on rabbits after administering to them intravenously and intramuscularly DT.

Как видно, при внутривенном введении ДТ продолжительность жизни животных после гемосорбции наиболее высока и стабильна после иммуносорбента и при дозе ДТ 2 DLM и при 4 DLM. При внутримышечном введении ДТ результаты эксперимента также в пользу иммуносорбента. As can be seen, with the intravenous administration of DT, the life expectancy of animals after hemosorption is the highest and stable after immunosorbent at a dose of DT 2 DLM and 4 DLM. With intramuscular administration of DT, the experimental results are also in favor of an immunosorbent.

Claims

The compound of General formula I

where m 0,087 0,02;
n 0.255 0.255;
k 0.003 0.012;
l 0.655 0.713
based on a macroporous copolymer of styrene and divinylbenzene with a specific surface area of 87 102 m ² / g, an average effective pore radius of 108 198 nm, a density of 0.4 0.5 g / cm ³ as an immunosorbent to remove diphtheria toxin from body fluids.