RU2074191C1

RU2074191C1 - Method of synthesis of des-gly-10,/d-ley-6/-lh-rh-ethylamide

Info

Publication number: RU2074191C1
Application number: RU94021724A
Authority: RU
Inventors: А.Н. Семенов; Н.П. Макарова; М.Ф. Леонидов
Original assignee: Российско-германское совместное предприятие "Константа"
Priority date: 1994-06-08
Filing date: 1994-06-08
Publication date: 1997-02-27
Also published as: RU94021724A

Abstract

FIELD:organic chemistry, peptide synthesis. SUBSTANCE: synthesis is carried out by condensation of amino acid derivatives by method of series-parallel peptide chain splicing according the following scheme:

Description

Изобретение относится к органической химии, в частности к препаративному пептидному синтезу аналогов люлиберина в растворе. The invention relates to organic chemistry, in particular to preparative peptide synthesis of luliberin analogues in solution.

Аналоги люлиберина (лютеинизирующего гормона рилизинг-фактора LH-RH) широко используются в медицине и ветеринарии. В частности, аналог, содержащий d-лейцин в положении 6 и этиламид вместо С-концевого амида глицина (коммерческие названия leuprolide и lupron) Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ используется в виде уксуснокислой соли как эффективное лекарство для лечения рака предстательной железы на стадиях А, В, С и D [1, 2] В связи с этим разработка методов синтеза этого соединения представляет несомненный практический интерес.Analogues of luliberin (luteinizing hormone releasing factor LH-RH) are widely used in medicine and veterinary medicine. In particular, an analogue containing d-leucine at position 6 and ethylamide instead of the C-terminal glycine amide (trade names leuprolide and lupron) Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C ₂ H _{5 is} used in the form of acetic acid salt as an effective medicine for the treatment of prostate cancer in stages A, B, C and D [1, 2]. In this regard, the development of methods for the synthesis of this compound is of undoubted practical interest.

Известны способы синтеза дез-Гли¹⁰, [d-Лей⁶]-LH-RH-этиламида [3, 4] Наиболее близким к предлагаемому способу является способ синтеза, описанный в [4] Способ заключается в том, что синтез осуществляют конденсацией производных аминокислот методом последовательно-параллельного наращивания пептидной цепи по схеме I:

Недостатками известного способа синтеза являются: использование защищенного по гуанидиновой группе аргинина; использование С-концевых защит при синтезе фрагментов 1 3 и 4 5; использование раствора бромистого водорода в уксусной кислоте для деблокирования аминогрупп. Указанные недостатки удорожают способ и увеличивают количество стадий, что ограничивает технологичность способа.Known methods for the synthesis of des-Gly ¹⁰ , [d-Lei ⁶ ] -LH-RH-ethylamide [3, 4] Closest to the proposed method is the synthesis method described in [4] The method consists in the fact that the synthesis is carried out by condensation of derivatives of amino acids by the method of sequentially parallel peptide chain extension according to scheme I:

The disadvantages of the known synthesis method are: the use of guanidine-protected arginine; the use of C-terminal protections in the synthesis of fragments 1 3 and 4 5; the use of a solution of hydrogen bromide in acetic acid for the release of amino groups. These disadvantages increase the cost of the method and increase the number of stages, which limits the manufacturability of the method.

Цель изобретения удешевление и расширение технологических возможностей способа. The purpose of the invention the reduction and expansion of technological capabilities of the method.

Способ заключается в том, что синтез осуществляют конденсацией производных аминокислот методом последовательно-параллельного наращивания пептидной цепи по схеме 2:

Достоинствами предлагаемого способа являются: использование незащищенного по гуанидиновой группе аргинина; синтез фрагментов 1 2 и 3 4 с незащищенными С-концевыми карбоксильными функциями.The method consists in the fact that the synthesis is carried out by condensation of amino acid derivatives by the method of sequentially parallel peptide chain extension according to scheme 2:

The advantages of the proposed method are: the use of unprotected guanidine group of arginine; synthesis of fragments 1 2 and 3 4 with unprotected C-terminal carboxyl functions.

Предлагаемое техническое решение является промышленно применимым, т.к. настоящая схема синтеза позволяет осуществлять препаративный синтез дез-гли¹⁰,[d-лей⁶]-LH-RH-этиламида.The proposed technical solution is industrially applicable, because the present synthesis scheme allows for the preparative synthesis of des-gly ¹⁰ , [d-lei ⁶ ] -LH-RH-ethylamide.

П р и м е р 1. Синтез Z-Leu-Arg. PRI me R 1. Synthesis of Z-Leu-Arg.

19,32 г Z-Leu-ONp (50 ммоль) растворяют в 100 мл ДМФА, добавляют 10,45 г (60 ммоль) аргинина и смесь перемешивают на магнитной мешалке 48 ч. По окончании реакции реакционную смесь упаривают до густого масла, растворяют в хлороформе и наносят на колонку 3х30 см с силикагелем, уравновешенным хлороформом. Колонку промывают хлороформом до исчезновения желтого цвета и продукт элюируют смесью хлороформ/метанол 40:60. Раствор продукта в элюенте упаривают досуха, заливают эфиром и оставляют в холодильнике до окончания кристаллизации. Полученные кристаллы отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат на воздухе. Выход 18,116 г, 43 ммоль, 86
П р и м е р 2. Синтез Z-d-Leu-Leu-Arg.19.32 g of Z-Leu-ONp (50 mmol) are dissolved in 100 ml of DMF, 10.45 g (60 mmol) of arginine are added and the mixture is stirred on a magnetic stirrer for 48 hours. After the completion of the reaction, the reaction mixture is evaporated to a thick oil, dissolved in chloroform and applied to a 3x30 cm column with silica gel equilibrated with chloroform. The column was washed with chloroform until the yellow color disappeared and the product was eluted with a 40:60 chloroform / methanol mixture. The product solution in the eluent is evaporated to dryness, poured with ether and left in the refrigerator until crystallization is complete. The obtained crystals are filtered off, washed with ether and dried in air. Yield 18.116 g, 43 mmol, 86
PRI me R 2. Synthesis of Zd-Leu-Leu-Arg.

30,33 г Z-Leu-Arg (72 ммоль) гидрируют в метаноле с Рd/C в качестве катализатора. По окончании гидрирования катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха и остаток растворяют в 100 мл ДМФА. К полученному раствору добавляют раствор 27,82 г (72 ммоль) Z-d-Leu-ONp в 50 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивают сутки, упаривают до густого масла, растворяют в 100 мл метанола, добавляют 200 мл воды и метанол отгоняют на роторном испарителе. Смесь выдерживают в холодильнике сутки, воду сливают, остаток растворяют в смеси 100 мл метанола и 100 мл диоксана, упаривают досуха, растворяют в 100 мл метанола и высаживают 300 мл эфира. Полученные кристаллы отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат на воздухе. При неполном отделении пара-нитрофенола кристаллизацию эфиром из метанола следует повторить. Выход 34,22 г (64 ммоль), 88.9
П р и м е р 3. Синтез BOC-Tyr(Bzl)-d-Leu-Leu-Arg.30.33 g of Z-Leu-Arg (72 mmol) are hydrogenated in methanol with Pd / C as a catalyst. After hydrogenation, the catalyst was filtered off, the filtrate was evaporated to dryness and the residue was dissolved in 100 ml of DMF. To the resulting solution was added a solution of 27.82 g (72 mmol) of Zd-Leu-ONp in 50 ml of DMF. The reaction mixture is stirred for a day, evaporated to a thick oil, dissolved in 100 ml of methanol, 200 ml of water are added and the methanol is distilled off on a rotary evaporator. The mixture is kept in the refrigerator for 24 hours, the water is drained, the residue is dissolved in a mixture of 100 ml of methanol and 100 ml of dioxane, evaporated to dryness, dissolved in 100 ml of methanol and 300 ml of ether are precipitated. The obtained crystals are filtered off, washed with ether and dried in air. In case of incomplete separation of para-nitrophenol, crystallization with ether from methanol should be repeated. Yield 34.22 g (64 mmol), 88.9
PRI me R 3. Synthesis of BOC-Tyr (Bzl) -d-Leu-Leu-Arg.

30,48 г (57 ммоль) Z-d-Leu-Leu-Arg растворяют в 100 мл ДМФА. добавляют 350 мл МеОН и гидрируют с Рd/C в качестве катализатора. По окончании реакции метанол и воду отгоняют на роторном испарителе, к остатку добавляют 26,7 г ВОС-Тyr(Bzl)-OSu в 300 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивают сутки, упаривают досуха на роторном испарителе, растворяют остаток в 100 мл метанола, добавляют 300 мл воды и метанол упаривают на роторном испарителе. Реакционную массу выдерживают ночь в холодильнике, водный раствор над маслянистым осадком сливают, операцию повторяют и осадок кристаллизуют под гексаном. Выход 39,8 г, 52,79 ммоль, 92,6
П р и м е р 4. Синтез Z-Pro-NH-C₂H₅.30.48 g (57 mmol) of Zd-Leu-Leu-Arg are dissolved in 100 ml of DMF. 350 ml of MeOH are added and hydrogenated with Pd / C as a catalyst. At the end of the reaction, methanol and water are distilled off on a rotary evaporator, 26.7 g of BOC-Tyr (Bzl) -OSu in 300 ml of DMF are added to the residue. The reaction mixture was stirred for 24 hours, evaporated to dryness on a rotary evaporator, the residue was dissolved in 100 ml of methanol, 300 ml of water was added, and methanol was evaporated on a rotary evaporator. The reaction mixture is allowed to stand overnight in a refrigerator, the aqueous solution is drained over an oily precipitate, the operation is repeated and the precipitate is crystallized under hexane. Yield 39.8 g, 52.79 mmol, 92.6
PRI me R 4. Synthesis of Z-Pro-NH-C ₂ H ₅ .

49,85 г Z-Pro-OH (200 ммоль) и 25,6 мл N-этилморфолина (200 ммоль) растворяют в 400 мл ДИФА. Смесь охлаждают до -30^oC и небольшими порциями в течение 2 мин добавляют 27,3 мл (210 ммоль) изобутилхлорформиата. Через 2 мин при энергичном перемешивании к смеси добавляют порциями в течение 5 мин 30 мл 50-ного раствора этиламина в диоксане. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при охлаждении и ночь при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают досуха, растворяют в хлороформе и промывают последовательно 1 н. серной кислотой в насыщенном растворе хлористого натрия, насыщенным раствором хлористого натрия, карбонатом натрия в насыщенном растворе хлористого натрия, насыщенным раствором хлористого натрия и водой, упаривают и остаток кристаллизуют из изопропанола гексаном. Выход 43,4 г, 157,2 ммоль, 78,6
П р и м е р 5. Синтез ВОС-Тyr(Bzl)-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅.49.85 g of Z-Pro-OH (200 mmol) and 25.6 ml of N-ethylmorpholine (200 mmol) are dissolved in 400 ml of DIPA. The mixture was cooled to -30 ^° C and 27.3 ml (210 mmol) of isobutyl chloroformate were added in small portions over 2 minutes. After 2 minutes, with vigorous stirring, 30 ml of a 50% solution of ethylamine in dioxane are added portionwise over 5 minutes. The reaction mixture was stirred for 30 minutes while cooling and overnight at room temperature. The reaction mixture was evaporated to dryness, dissolved in chloroform and washed successively with 1N. sulfuric acid in a saturated solution of sodium chloride, a saturated solution of sodium chloride, sodium carbonate in a saturated solution of sodium chloride, a saturated solution of sodium chloride and water, evaporated and the residue was crystallized from isopropanol with hexane. Yield 43.4 g, 157.2 mmol, 78.6
PRI me R 5. Synthesis of BOC-Tyr (Bzl) -d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C ₂ H ₅ .

5,713 г (20,7 ммоль) Z-Pro-NH-C₂H₅ гидрируют в метаноле с Рd/C в качестве катализатора. По окончании гидрирования катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха, добавляют 10,41 г (13,8 ммоль) ВОС-Тyr(Bzl)-d-Leu-Leu-Arg, 4,3 г НОВt, охлаждают и добавляют 4,35 г DCC. Реакционную смесь перемешивают 48 ч, отфильтровывают дициклогексилмочевину, фильтрат упаривают досуха, добавляют 200 мл эфира и охлаждают. Выдерживают ночь в холодильнике, эфир сливают, остаток растворяют в смеси 400 мл хлороформа и 100 мл бутанола и промывают последовательно 1 н NaOH в насыщенном растворе хлористого натрия, насыщенным раствором хлористого натрия, 1 н. НСl в насыщенном растворе хлористого натрия, насыщенным раствором хлористого натрия до нейтральной реакции и водой. Органическую фазу упаривают досуха на роторном испарителе во взвешенной колбе. Выход 11,81 г, 13,46 ммоль, 97,6
П р и м е р 6. ВОС-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅.5.713 g (20.7 mmol) of Z-Pro-NH-C ₂ H _{5 are} hydrogenated in methanol with Pd / C as a catalyst. After hydrogenation, the catalyst is filtered off, the filtrate is evaporated to dryness, 10.41 g (13.8 mmol) of BOC-Tyr (Bzl) -d-Leu-Leu-Arg, 4.3 g of HOBt are added, cooled and 4.35 g of DCC are added . The reaction mixture was stirred for 48 hours, dicyclohexylurea was filtered off, the filtrate was evaporated to dryness, 200 ml of ether was added and cooled. They stand the night in the refrigerator, the ether is drained, the residue is dissolved in a mixture of 400 ml of chloroform and 100 ml of butanol and washed successively with 1 N NaOH in a saturated solution of sodium chloride, saturated solution of sodium chloride, 1 N. Hcl in a saturated solution of sodium chloride, saturated solution of sodium chloride to a neutral reaction and water. The organic phase is evaporated to dryness on a rotary evaporator in a suspended flask. Yield 11.81 g, 13.46 mmol, 97.6
PRI me R 6. BOC-Trp-Ser-Tyr (Bzl) -d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C ₂ H ₅ .

7,017 г (8 ммоль) ВОС-Тyr(Bzl)-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ растворяют в 50 мл ТFA и 10 мл анизола. Реакционную смесь перемешивают 30 мин, упаривают, растворяют в 400 мл хлороформа и 100 мл бутанола, промывают 1 н. NaOH в насыщенном растворе хлористого натрия, 5 -ным раствором соды в насыщенном растворе хлористого натрия, упаривают досуха, растворяют в 50 мл ДМФА, добавляют 8 ммоль ВОС-Trp-Ser-OH, полученного разложением 4,582 г (8 ммоль) дициклогексиламмонийной соли ВОС-Trp-Ser-OH^*, и 1,08 г НОВt. Реакционную смесь охлаждают и добавляют 1,68 г DCC. Реакционную смесь перемешивают 48 ч, отфильтровывают дициклогексилмочевину, фильтрат упаривают досуха, добавляют 200 мл эфира и охлаждают. Выдерживают ночь в холодильнике, эфир сливают, остаток растворяют в смеси 400 мл хлороформа и 100 мл бутанола и промывают последовательно 1 н. NaOH в насыщенном растворе хлористого натрия, насыщенным раствором хлористого натрия, 1 н. НСl в насыщенном растворе хлористого натрия, насыщенным раствором хлористого натрия до нейтральной реакции и водой. Органическую фазу упаривают до густого масла и остаток кристаллизуют из метанола эфиром. Выход 6,457, 5,44 ммоль, 68
^*Примечание: Дициклогексиламмониевую соль ВОС-Тrp-Ser-OH синтезируют любым из известных описанных в литературе способов.7.017 g (8 mmol) of BOC-Tyr (Bzl) -d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C ₂ H _{5 was} dissolved in 50 ml of TFA and 10 ml of anisole. The reaction mixture is stirred for 30 minutes, evaporated, dissolved in 400 ml of chloroform and 100 ml of butanol, washed with 1 N. NaOH in a saturated solution of sodium chloride, 5% soda solution in a saturated solution of sodium chloride, evaporated to dryness, dissolved in 50 ml of DMF, add 8 mmol of BOC-Trp-Ser-OH obtained by decomposition of 4.582 g (8 mmol) of BOC- dicyclohexylammonium salt Trp-Ser-OH ^* , and 1.08 g of HOBt. The reaction mixture was cooled and 1.68 g of DCC was added. The reaction mixture was stirred for 48 hours, dicyclohexylurea was filtered off, the filtrate was evaporated to dryness, 200 ml of ether was added and cooled. They stand the night in the refrigerator, the ether is drained, the residue is dissolved in a mixture of 400 ml of chloroform and 100 ml of butanol and washed successively with 1 N. NaOH in a saturated solution of sodium chloride, saturated solution of sodium chloride, 1 N. Hcl in a saturated solution of sodium chloride, saturated solution of sodium chloride to a neutral reaction and water. The organic phase is evaporated to a thick oil and the residue is crystallized from methanol with ether. Yield 6.457, 5.44 mmol, 68
^* Note: BOC-Trp-Ser-OH dicyclohexylammonium salt is synthesized by any of the methods described in the literature.

П р и м е р 7. Синтез Z-Pyr-His. PRI me R 7. Synthesis of Z-Pyr-His.

1,862 г (12 ммоль) L-гистидина, растворяют в 6 мл 2 н. NaOH и при перемешивании добавляют 3,843 г (10 ммоль) Z-Pyr-ONp в 20 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивают сутки, упаривают досуха, растворяют в 50 мл 1 н. НСl и экстрагируют 100 мл эфира. Водную фазу отделяют, подщелачивают до рН 4,5 5,5 и оставляют на сутки в холодильнике. Осадок отфильтровывают и сушат на воздухе. Выход 1,473 г, 3,68 ммоль, 36,8
П р и м е р 8. Синтез Z-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅.1.862 g (12 mmol) of L-histidine, dissolved in 6 ml of 2 N. NaOH and 3.843 g (10 mmol) of Z-Pyr-ONp in 20 ml of DMF are added with stirring. The reaction mixture is stirred for a day, evaporated to dryness, dissolved in 50 ml of 1 N. Hcl and extracted with 100 ml of ether. The aqueous phase is separated, alkalinized to pH 4.5 5.5 and left in the refrigerator for a day. The precipitate was filtered off and dried in air. Yield 1.473 g, 3.68 mmol, 36.8
PRI me R 8. Synthesis of Z-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr (Bzl) -d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C ₂ H ₅ .

5,104 г (4,3 ммоль) ВОС-Тrp-Ser-Tyr(Bzl)-d-Leu-Leu-Arg-Pro-C₂H₅ растворяют в 50 мл ТFA и 10 мл анизола. Реакционную смесь перемешивают 30 мин, упаривают, растворяют в 400 мл хлороформа и 100 мл бутанола, промывают 1 н. NaOH в насыщенном растворе хлористого натрия, 5% -ным раствором соды в насыщенном растворе хлористого натрия, упаривают досуха, растворяют в 50 мл ДМФА, добавляют 1,722 г (4,3 ммоль) Z-Pyr-His, 0,581 г НОВt, охлаждают и добавляют 1,26 г DCC. Реакционную смесь перемешивают 48 ч, отфильтровывают дициклогексилмочевину, фильтрат упаривают досуха, добавляют 200 мл эфира и охлаждают. Выдерживают ночь в холодильнике, эфир сливают, и остаток дважды кристаллизуют из метанола эфиром и один раз из спирта водой с добавлением слабого раствора хлористого натрия. Выход 4,53 г, 3,08 ммоль, 71,7
П р и м е р 9. Синтез Рyr-His-Trp-Ser-Tyr-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ (вариант 1).5.104 g (4.3 mmol) of BOC-Trp-Ser-Tyr (Bzl) -d-Leu-Leu-Arg-Pro-C ₂ H _{5 was} dissolved in 50 ml of TFA and 10 ml of anisole. The reaction mixture is stirred for 30 minutes, evaporated, dissolved in 400 ml of chloroform and 100 ml of butanol, washed with 1 N. NaOH in a saturated solution of sodium chloride, 5% soda solution in a saturated solution of sodium chloride, evaporated to dryness, dissolved in 50 ml of DMF, 1.722 g (4.3 mmol) of Z-Pyr-His, 0.581 g of HOBt were added, cooled and added 1.26 g of DCC. The reaction mixture was stirred for 48 hours, dicyclohexylurea was filtered off, the filtrate was evaporated to dryness, 200 ml of ether was added and cooled. They stand the night in the refrigerator, the ether is drained, and the residue is crystallized twice from methanol with ether and once from alcohol with water with the addition of a weak solution of sodium chloride. Yield 4.53 g, 3.08 mmol, 71.7
PRI me R 9. Synthesis of Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C ₂ H ₅ (option 1).

4,53 г Z-Pyr-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ (3,08 ммоль) гидрируют в водном этаноле, содержащем 5 уксусной кислоты с Pd/C в качестве катализатора. По окончании гидрирования катализатор отфильтровывают и фильтрат наносят на колонку 2,6х40 см с сульфопропил-сефадексом С-25, уравновешенную 0,2 М пиридиний-ацетатным буфером, рН 5,0. Колонку промывают стартовым буфером и продукт элюируют в градиенте ионной силы 0,2 0,6 М (по 1 л). Фракции, содержащие продукт с чистотой выше 85 объединяют, упаривают и рехроматографируют на колонке 2,5х90 см с сульфопропил-сефадексом в градиенте ионной силы 0,3 0,5 М (по 2 л). После повторной хроматографии объединяют фракции, содержащие продукт требуемой чистоты и объединенные фракции лиофилизуют. Выход продукта с чистотой 98 (по данным ВЭЖХ) 2,385 г, 1,88 ммоль, 61
П р и м е р 10. Синтез Рyr-His-Trp-Ser-Tyr-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ (вариант 2).4.53 g of Z-Pyr-Trp-Ser-Tyr (Bzl) -d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C ₂ H ₅ (3.08 mmol) is hydrogenated in aqueous ethanol containing 5 acetic acid with Pd A / C as a catalyst. After hydrogenation, the catalyst is filtered off and the filtrate is applied to a 2.6 x 40 cm column with sulfopropyl-Sephadex C-25, balanced with 0.2 M pyridinium acetate buffer, pH 5.0. The column is washed with start buffer and the product is eluted in a gradient of ionic strength of 0.2 to 0.6 M (1 L each). Fractions containing a product with a purity higher than 85 are combined, evaporated and rechromatographed on a 2.5 x 90 cm column with sulfopropyl-Sephadex in an ionic strength gradient of 0.3 0.5 M (2 L each). After repeated chromatography, the fractions containing the product of the desired purity are combined and the combined fractions are lyophilized. The yield of product with a purity of 98 (according to HPLC) 2,385 g, 1.88 mmol, 61
PRI me R 10. Synthesis of Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C ₂ H ₅ (option 2).

4,53 г Z-Рyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ (3,08 ммоль) гидрируют в водном этаноле, содержащем 2 уксусной кислоты с Рd/C в качестве катализатора. По окончании гидрирования катализатор отфильтровывают и фильтрат наносят на колонку 2,6х40 см с сульфопропил-сефадексом С-25, уравновешенную 0,2 М ацетатно-аммиачным буфером, рН 5,0. Колонку промывают стартовым буфером и продукт элюируют в градиенте ионной силы 0,2 0,6 М (по 1 л). Фракции, содержащие продукт с чистотой выше 85 объединяют, упаривают и рехроматографируют на колонке 2,5х90 см с сульфопропил-сефадексом, уравновешенным 0,3 М аммоний-ацетатным буфером, рН 5,0, в градиенте ионной силы 0,3 0,5 М. После повторной хроматографии объединяют фракции, содержащие продукт требуемой чистоты, объединенные фракции упаривают до небольшого объема и наносят на колонку (2,5х100 см) с Toyopearl HW-40F, уравновешенную 2-ной уксусной кислотой. Элюируют продукт тем же элюентом, объединяют фракции, содержащие продукт требуемой чистоты и объединенные фракции лиофилизуют. Выход продукта с чистотой 99 + (по данным ВЭЖХ) 2,111 г, 1,66 ммоль, 54
Список используемых сокращений: ДМФА диметилформамид, DCC - дициклогексилкарбодиимид, ТFA трифторуксусная кислота, НОВt - 1-гидроксибензотриазол, НОNB N-гидрокси-5-норбонен-2,3-дикарбимид, DNP - динитрофенил, Z бензилоксикарбонил, Bzl бензил, ВОС - трет-бутоксикарбонил.4.53 g of Z-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr (Bzl) -d-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C ₂ H ₅ (3.08 mmol) is hydrogenated in aqueous ethanol containing 2 acetic acid with Pd / C as a catalyst. At the end of hydrogenation, the catalyst is filtered off and the filtrate is applied to a 2.6 x 40 cm column with sulfopropyl-Sephadex C-25, balanced with 0.2 M ammonium acetate buffer, pH 5.0. The column is washed with start buffer and the product is eluted in a gradient of ionic strength of 0.2 to 0.6 M (1 L each). Fractions containing a product with a purity higher than 85 are combined, evaporated and rechromatographed on a 2.5 x 90 cm column with sulfopropyl-Sephadex balanced with 0.3 M ammonium acetate buffer, pH 5.0, in an ionic strength gradient of 0.3 0.5 M After repeated chromatography, the fractions containing the product of the desired purity are combined, the combined fractions are evaporated to a small volume and applied to a column (2.5 x 100 cm) with Toyopearl HW-40F, balanced with 2-acetic acid. The product is eluted with the same eluent, fractions containing the product of the desired purity are combined and the combined fractions are lyophilized. Yield 99 + purity (HPLC) 2.111 g, 1.66 mmol, 54
List of abbreviations used: DMF dimethylformamide, DCC - dicyclohexylcarbodiimide, TFA trifluoroacetic acid, НOBt - 1-hydroxybenzotriazole, НОNB N-hydroxy-5-norbonen-2,3-dicarbimide, DNP - dinitrophenyl, Z benzyloxycarbonyl, Bz, Bz butoxycarbonyl.

Claims

1. The method of synthesis of des-gli ¹ ⁰ , [D-Lei ⁶ ] -LH-RH-ethylamide: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-d-Leu-Leu-Arg-ProNHC ₂ H ₅ , including serial-parallel peptide chain growth using active esters of protected amino acids and dicyclohexylcarbodiimide in the presence of nucleophilic additives, and carbobenzoxy and tert-butyloxycarbonyl - are used as protective groups for the α-amino groups of amino acids; serine and histidine are used with unprotected lateral functions, followed by multistage chromatographic purification of the final product, characterized in that the synthesis of the fragments and their condensation is carried out according to the 2+ scheme [2+ (4 + 1)] N-hydroxybenzotriazole, arginine is used as the nucleophilic additive used in the synthesis with unprotected lateral function, the tyrosine hydroxyl group is protected by a benzyl protecting group, the a-carboxyl groups of amino acids are not protected, and multistage chromatographic purification of the final The product is carried out by double ion exchange chromatography on SP-Sephadex in a gradient of pyridinium acetate buffer.

2. The method according to p. 1, characterized in that multistage chromatographic purification of the final product is carried out by ion exchange chromatography on SP-Sephadex in a gradient of pyridinium acetate buffer, followed by ion-exchange rechromatography on SP-Sephadex in a gradient of ammonium acetate buffer and chromatography on W-Toyopearl 40 in a medium of 2% acetic acid.