RU2071334C1

RU2071334C1 - Method of chorionic gonadotropin raw preparing

Info

Publication number: RU2071334C1
Application number: RU93002009A
Authority: RU
Inventors: А.В. Карякин; Е.В. Гамазина; В.Г. Юсупов; Г.Б. Кудашева; В.Ф. Кулагин
Original assignee: Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат"
Priority date: 1993-01-11
Filing date: 1993-01-11
Publication date: 1997-01-10

Abstract

FIELD: medicinal industry. SUBSTANCE: urine from pregnant women (8-12 weeks of gestation) is cleared passing through microfiltration diaphragms at pore size 0.22-0.5 mcm. The cleared raw is concentrated in ultrafiltration modulus with hollow fibers at cutting off limit 10-40 kDa. The obtained concentrate is washed off urea and salts with distillated water at pH = 5.8-7.0. Value pH of concentrate is brought about to 3.8-4.2 and precipitate containing chorionic gonadotropin is isolated by acetone excess addition. For reprecipitation of active deposit containing chorionic gonadotropin the deposit is dissolved in 5-10% ammonium-acetate buffer containing 50-70% ethanol. Precipitation of the end product is carried out by increase of ethanol concentration up to 90-92%. Activity of the obtained product is 1500-2000 U/mg, yield is 85.7-90%. EFFECT: improved method of preparing, increased yield and activity.

Description

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается способа получения сырца гонадотропина хорионического (ХГ). The invention relates to the medical industry and relates to a method for producing raw chorionic gonadotropin (CH).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ получения гонадотропина хорионического, осуществляемый в соответствии с авторским свидетельством СССР N 1504845, кл. А 61 К 37/38, 1987 г. Closest to the technical nature of the present invention is a method for producing chorionic gonadotropin, carried out in accordance with the author's certificate of the USSR N 1504845, class. A 61 K 37/38, 1987

Согласно этому способу мочу беременных женщин подкисляют до рН 4,2-4,5, осветляют, пропускают через ультрафильтрационный модуль с пределом отсечения 50-100 кД. Концентрат мочи промывают аммонийно-ацетатным буфером, рН 4,2-4,5, пропускают через ультрафильтрационный модуль с пределом отсечения 15-30 кД. Полученный концентрат промывают аммонийно-ацетатным буфером, рН 4,2-4,5, доводят рН концентрата до 5,2-5,5 и осаждают сырец добавлением этанола до конечной концентрации 75-80% Осадок отделяют центрифугированием, промывают этанолом, ацетоном и досушивают на воздухе. Выход сырца гонадотропина хорионического составляет 45-50 мг из 1 л сырья, удельная активность 820-850 ед/мг. According to this method, the urine of pregnant women is acidified to a pH of 4.2-4.5, clarified, passed through an ultrafiltration module with a cut-off limit of 50-100 kD. The urine concentrate is washed with ammonium acetate buffer, pH 4.2-4.5, passed through an ultrafiltration module with a cutoff limit of 15-30 kD. The resulting concentrate is washed with ammonium acetate buffer, pH 4.2-4.5, the pH of the concentrate is adjusted to 5.2-5.5 and the crude precipitated by adding ethanol to a final concentration of 75-80%. The precipitate is separated by centrifugation, washed with ethanol, acetone and dried. on air. The yield of raw chorionic gonadotropin is 45-50 mg from 1 liter of raw material, the specific activity is 820-850 u / mg.

Способ характеризуется низкой удельной активностью получаемого сырца, большим расходом материалов (аммонийно-ацетатного буфера). Потери гормона происходят на начальном этапе получения при подкислении сырья, которое сопровождается выпадением осадка, при этом теряется и ХГ, а также на этапе концентрирования при промывании концентрата большими объемами буфера с кислым значением рН (4,2-4,5) за счет диссоциации в этих условиях гормона на субъединицы с молекулярной массой 15-24 кД. The method is characterized by low specific activity of the obtained raw material, high consumption of materials (ammonium acetate buffer). Losses of the hormone occur at the initial stage of production during acidification of raw materials, which is accompanied by precipitation, and CG is also lost, as well as at the stage of concentration during washing of the concentrate with large volumes of buffer with an acidic pH value (4.2–4.5) due to dissociation in under these hormone conditions, subunits with a molecular weight of 15-24 kD.

Целью настоящего изобретения является повышение удельной активности целевого продукта. The aim of the present invention is to increase the specific activity of the target product.

С этой целью получение сырца гонадотпропина хорионического включает осветление исходного сырья микрофильтрацией на мембранах 0,22-0,5 мкм при рН 5,6-8,5, концентрирование гормона ультрафильтрацией при тех же значениях рН с последующим промыванием концентрата дистиллированной водой при рН 5,8-7,0, осаждение целевого продукта органическим растворителем и его выделение из осадка путем экстракции аммонийно-ацетатным буфером с последующим переосаждением целевого продукта органическим растворителем. To this end, obtaining raw goronadotropin chorionic involves clarification of the feedstock by microfiltration on 0.22-0.5 μm membranes at pH 5.6-8.5, concentration of the hormone by ultrafiltration at the same pH values, followed by washing the concentrate with distilled water at pH 5, 8-7.0, precipitation of the target product with an organic solvent and its isolation from the precipitate by extraction with ammonium acetate buffer, followed by reprecipitation of the target product with an organic solvent.

Сравнение предлагаемого способа с известным показывает, что общими существенными признаками у них являются: осветление исходного сырья, концентрирование гормона с помощью ультрафильтрации с последующей промывкой, осаждение органическим растворителем и выделение конечного продукта. Однако в отличие от прототипа в заявляемом способе исходное сырье осветляют микрофильтрацией на мембранах с размером пор 0,22-0,5 мкм при рН 5,6-8,5, концентрирование ультрафильтрацией проводят при тех же значениях рН, концентрат промывают дистиллированной водой при рН 5,8-7,0, а выделение гормона из осадка осуществляют экстракцией аммонийно-ацетатным буфером с последующим переосаждением продукта органическим растворителем. Comparison of the proposed method with the known one shows that they have common essential features: clarification of the feedstock, concentration of the hormone by ultrafiltration, followed by washing, precipitation with an organic solvent and isolation of the final product. However, unlike the prototype in the present method, the feedstock is clarified by microfiltration on membranes with pore size 0.22-0.5 μm at pH 5.6-8.5, concentration by ultrafiltration is carried out at the same pH values, the concentrate is washed with distilled water at pH 5.8-7.0, and the release of the hormone from the precipitate is carried out by extraction with ammonium acetate buffer, followed by reprecipitation of the product with an organic solvent.

Отсутствие подкисления на этапах осветления, концентрирования и промывания концентрата уменьшает инактивацию гормона и его диссоциацию на субъединицы, что способствует повышению удельной активности препарата. Проведение осветления с помощью микрофильтрации без изменения рН снижает потери за счет предотвращения соосаждения ХГ. Кроме того, если в прототипе экстракцию гормона аммонийно-ацетатным буфером проводят в процессе 2-х этапной ультрафильтрации, что, как уже было сказано выше, сопровождается потерями гормона, то в заявляемом способе за счет разделения стадий концентрирования и экстракции гормона аммонийно-ацетатным буфером (экстракция проводится после осаждения ХГ органическим растворителем) повышается удельная активность продукта и значительно уменьшается расход реактивов (аммонийно-ацетатного буфера в 25 раз). The absence of acidification at the stages of clarification, concentration and washing of the concentrate reduces the inactivation of the hormone and its dissociation into subunits, which contributes to an increase in the specific activity of the drug. Carrying out clarification using microfiltration without changing the pH reduces losses due to the prevention of co-precipitation of CG. In addition, if in the prototype the extraction of the hormone with ammonium acetate buffer is carried out in the process of 2-stage ultrafiltration, which, as mentioned above, is accompanied by loss of the hormone, then in the inventive method by separating the stages of concentration and extraction of the hormone with ammonium acetate buffer ( extraction is carried out after precipitation of CG with an organic solvent) the specific activity of the product increases and the consumption of reagents (ammonium acetate buffer is reduced by a factor of 25).

Приведенная совокупность отличительных признаков заявляемого способа в литературе не описана и влияние их на достижение технического результата не следует из известного уровня техники, что свидетельствует о соответствии заявляемого способа критериям "новизна" и "изобретательский уровень". The above set of distinctive features of the proposed method is not described in the literature and their influence on the achievement of the technical result does not follow from the prior art, which indicates the compliance of the proposed method with the criteria of "novelty" and "inventive step".

Способ получения сырца гонадотропина хорионического в соответствии с предлагаемым изобретением осуществляется следующим образом. A method of obtaining raw chorionic gonadotropin in accordance with the invention is as follows.

Мочу беременных женщин со сроком беременности 8-12 недель осветляют, пропуская через микрофильтрационные мембраны с размером пор 0,22-0,5 мкм. Осветленное сырье концентрируют на ультрафильтрационном модуле с полыми волокнами с пределом отсечения 10-40 килоДальтон. Полученный концентрат отмывают от мочевины и солей дистиллированной водой при рН 6,8-7,0. В концентрате доводят рН до 3,8-4,2 и выделяют осадок, содержащий гонадотропин хорионический, добавлением избытка ацетона. Для переосаждения активного осадка, содержащего гонадотропин хорионический, осадок растворяют в 5-10% аммонийно-ацетатном буфере, содержащем 50-70% этилового спирта. В этих условиях растворяются исключительно белки гликопротеиновой природы. Осаждение целевого продукта осуществляется повышением концентрации этанола до 90-92%
Пример 1. Мочу беременных женщин с содержанием ХГ 70 ед/мг, рН 6,0 в количестве 60 л пропускают через микрофильтрационный модуль, заправленный мембранами 0,22 мкм. Осветленное сырье подают на ультрафильтрационный модуль с пределом отсечения 30 килоДальтон и концентрируют до 0,6 л. Концентрат промывают 4-мя объемами дистиллированной воды при постоянном объеме до значения рН 6,5. Затем в концентрате с помощью раствора соляной кислоты (1:1) устанавливают рН 3,8, добавляют 1,8 л ацетона, смесь выдерживают при температуре 4-6^oC 12-14 часов. После этого осадок отделяют центрифугированием, промывают ацетоном и досушивают на воздухе. Для экстракции гормона 6 г получившегося осадка обрабатывают 120 мл 10% аммонийно-ацетатного буфера, содержащего 70% этанола, и осаждают сырец гонадотропина хорионического добавлением этанола до концентрации 90-92% Смесь выдерживают при температуре 4-6^oC 12-14 часов, осадок отделяют центрифугированием, промывают этанолом, ацетоном и досушивают на воздухе. Вес сырца гонадотропина хорионического 1,8 г, активность 2000 ед/мг. Выход гормона 85,7%
Пример 2. Мочу беременных женщин с содержанием ХГ 50 ед/мг, рН 8,0 в количестве 60 л пропускают через микрофильтрационный модуль с мембранами 0,45 мкм, а затем через ультрафильтрационный модуль с пределом отсечения 10 кД и концентрируют до 0,6 л. Концентрат промывают дистиллированной водой до значения рН 6,0. Затем в концентрате с помощью раствора соляной кислоты (1:1) устанавливают рН 4,2, добавляют 1,8 л ацетона, смесь выдерживают при температуре 4-6^oC 12-14 часов. После этого осадок отделяют центрифугированием, промывают ацетоном и досушивают на воздухе. Для экстракции гормона 6 г получившегося осадка обрабатывают 120 мл 10% аммонийно-ацетатного буфера, содержащего 70% этанола, и осаждают сырец гонадотропина хорионического добавлением этанола до концентрации 90-92% Смесь выдерживают при температуре 4-6^oC 12-14 часов, осадок отделяют центрифугированием, промывают этанолом, ацетатом и досушивают на воздухе. Вес сырца гонадотропина хорионического 1,8 г, активность 1500 ед/мг. Выход гормона 90%
Заявляемый способ позволяет в 2-3 раза повысить удельную активность сырца гонадотропина хорионического по сравнению с прототипом. Способ технологичен и не требует большого расхода реактивов.The urine of pregnant women with a gestational age of 8-12 weeks is clarified by passing through microfiltration membranes with a pore size of 0.22-0.5 microns. The clarified feed is concentrated on an ultrafiltration module with hollow fibers with a cut-off limit of 10-40 kiloDaltons. The resulting concentrate is washed from urea and salts with distilled water at a pH of 6.8-7.0. The concentrate is adjusted to pH 3.8-4.2 and a precipitate containing chorionic gonadotropin is isolated by adding an excess of acetone. To reprecipitate the active precipitate containing chorionic gonadotropin, the precipitate is dissolved in 5-10% ammonium acetate buffer containing 50-70% ethyl alcohol. Under these conditions, only proteins of a glycoprotein nature are dissolved. Precipitation of the target product is carried out by increasing the concentration of ethanol to 90-92%
Example 1. The urine of pregnant women with a ChG content of 70 units / mg, pH 6.0 in the amount of 60 l is passed through a microfiltration module, filled with 0.22 μm membranes. The clarified raw material is fed to an ultrafiltration module with a cutoff limit of 30 kiloDaltons and concentrated to 0.6 l. The concentrate is washed with 4 volumes of distilled water at a constant volume to a pH of 6.5. Then, in a concentrate using a solution of hydrochloric acid (1: 1), a pH of 3.8 is established, 1.8 l of acetone is added, the mixture is kept at a temperature of 4-6 ^o C for 12-14 hours. After this, the precipitate was separated by centrifugation, washed with acetone and dried in air. To extract the hormone, 6 g of the resulting precipitate is treated with 120 ml of 10% ammonium acetate buffer containing 70% ethanol, and raw chorionic gonadotropin is precipitated by adding ethanol to a concentration of 90-92%. The mixture is kept at a temperature of 4-6 ^o C for 12-14 hours, the precipitate separated by centrifugation, washed with ethanol, acetone and dried in air. Chorionic gonadotropin raw weight 1.8 g, activity 2000 u / mg. Hormone yield 85.7%
Example 2. Urine of pregnant women with a ChG content of 50 u / mg, pH 8.0 in an amount of 60 L is passed through a microfiltration module with 0.45 μm membranes, and then through an ultrafiltration module with a cut-off limit of 10 kD and concentrated to 0.6 L . The concentrate is washed with distilled water to a pH of 6.0. Then, in a concentrate using a solution of hydrochloric acid (1: 1), a pH of 4.2 is established, 1.8 l of acetone is added, the mixture is kept at a temperature of 4-6 ^o C for 12-14 hours. After this, the precipitate was separated by centrifugation, washed with acetone and dried in air. To extract the hormone, 6 g of the resulting precipitate is treated with 120 ml of 10% ammonium acetate buffer containing 70% ethanol, and raw chorionic gonadotropin is precipitated by adding ethanol to a concentration of 90-92%. The mixture is kept at a temperature of 4-6 ^o C for 12-14 hours, the precipitate separated by centrifugation, washed with ethanol, acetate and dried in air. The weight of raw chorionic gonadotropin is 1.8 g, activity is 1500 u / mg. Hormone yield 90%
The inventive method allows to increase by 2-3 times the specific activity of raw chorionic gonadotropin in comparison with the prototype. The method is technological and does not require a large consumption of reagents.

Claims

A method of obtaining raw chorionic gonadotropin from the urine of pregnant women, including clarification of the feedstock, concentration followed by washing, precipitation of the target product with an organic solvent and isolation of the target product, characterized in that the clarification of the feedstock is carried out by microfiltration on membranes with pore size 0.2 0.5 μm at pH 5.6 8.5, the concentration is carried out by ultrafiltration, the concentrate is washed with distilled water at pH 5.8 7.0, and the target product is isolated from the precipitate by extraction mmoniyno acetate buffer solution, followed by reprecipitation of the organic solvent.