RU2068694C1

RU2068694C1 - Method of isolation of fragment c3d of human complement component c3

Info

Publication number: RU2068694C1
Authority: RU
Inventors: Н.С. Матвеевская; В.А. Алешкин
Original assignee: Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского
Priority date: 1992-04-14
Filing date: 1992-04-14
Publication date: 1996-11-10

Abstract

FIELD: medicine, immunochemistry. SUBSTANCE: spirituous precipitate IV-I is precipitated with 16% polyethylene glycol (molecular mass is 4000-6000). From the formed supernatant C3d fragment of complement C3-component is isolated by two successive chromatography procedures: by ion-exchange chromatography on DEAE-Toyopearl and gel-filtration on Sephacryl S-200. EFFECT: simplified method, decreased cost. 1 dwg

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии и иммунохимии, и может быть использовано в диагностике заболеваний, связанных с активацией системы комплемента (СК): болезней иммунных комплексов, инфекционных заболеваний, респираторного дистресс-синдрома взрослых, наследственных дефицитов регуляторных белков СК. The invention relates to medicine, in particular to biochemistry and immunochemistry, and can be used in the diagnosis of diseases associated with the activation of the complement system (SC): diseases of immune complexes, infectious diseases, adult respiratory distress syndrome, hereditary deficiencies of regulatory proteins of SC.

Описанные способы выделения фрагмента С3d компонента С3 комплемента человека принципиально единообразны и схематично могут быть представлены в виде 2 этапов: 1 этап сложный, многоступенчатый процесс выделения высокоочищенного С3 компонента комплемента; 2 этап расщепление С3 компонента комплемента протеолитическими феpментами с последующей гель-фильтрацией и идентификацией С3d фрагмента. The described methods for isolating the C3d fragment of the complement component C3 of a person’s complement are fundamentally uniform and can be schematically presented in 2 stages: stage 1 is a complex, multi-stage process for isolating a highly purified C3 component of complement; Stage 2 cleavage of the C3 component of the complement with proteolytic enzymes followed by gel filtration and identification of the C3d fragment.

Известен способ выделения С3d фрагмента С3 компонента комплемента из плазмы крови, предложенный J. A. Moore et al. (1976 г.): нормальную дефибринированную донорскую плазму диализуют против дистиллированной воды при слабокислом pН с добавлением ЭДТА. Из осадка эуглобулинов путем ионообменной хроматографии на ДЭФЭ-целлюлозе и хроматографии на гидроксилапатите выделяют С3 компонент комплемента, идентифицируя его с помощью иммунопреципитации. Далее очищенный С3 компонент комплемента обрабатывают С3в-инактиватором (фактором 1) совместно с кофактором Н и выделяют образовавшийся С3d фрагмент гель-фильтрацией на сефадексе G-200, идентифицируя С3d с помощью иммунопреципитации, ИЭФ и ПААГ-электрофореза. A known method for the isolation of the C3d fragment of the C3 component of complement from blood plasma, proposed by J. A. Moore et al. (1976): normal defibrinated donor plasma is dialyzed against distilled water with low acid pH with the addition of EDTA. From the precipitate of euglobulins by ion exchange chromatography on DEFE cellulose and chromatography on hydroxylapatite, the C3 complement component is isolated, identifying it by immunoprecipitation. Next, the purified C3 complement component is treated with a C3b inactivator (factor 1) together with cofactor H and the resulting C3d fragment is isolated by gel filtration on Sephadex G-200, identifying C3d by immunoprecipitation, IEF and PAGE electrophoresis.

Вышеописанный способ многостадиен, трудоемок, в нем используется ценное донорское сырье плазма, дорогостоящие ферменты, реактивы, сорбенты для хроматографий. The above method is multi-stage, time-consuming, it uses valuable plasma donor raw materials, expensive enzymes, reagents, sorbents for chromatography.

Целью настоящего изобретения является упрощение и удешевление способа выделения С3d фрагмента С3 компонента комплемента, что важно для диагностических препаратов, а также утилизация отходов промышленного фракционирования плазмы. The aim of the present invention is to simplify and reduce the cost of the method for isolating the C3d fragment of the C3 complement component, which is important for diagnostic preparations, as well as the disposal of industrial plasma fractionation waste.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве источника С3d используется осадок IV-I, являющийся бросовой фракцией при промышленном производстве препаратов крови спиртовом фракционировании плазмы крови на холоде по методу Кона (1946 г. ). С3d, обнаруженный в осадке IV-I по Кону, оказался идентичным как С3d, образующемуся в результате острой или хронической активации системы комплемента in vivo, так и С3d, получаемым вследствие активации комплемента in vivo путем прогревания нормальной сыворотки при 37^oC, обработки ее зимозаном, MgCl₂, Е. соli, агрегированными IgG, и представляет полипептид низкого молекулярного веса (28000 47000 Дальтон) с миграцией в α-область при иммуноэлектрофорезе.This goal is achieved by the fact that precipitate IV-I is used as a source of C3d, which is the waste fraction in the industrial production of blood products by alcohol fractionation of blood plasma in the cold according to the Kohn method (1946). C3d found in Cohn IV-I sediment was identical to both C3d resulting from acute or chronic activation of the complement system in vivo, and C3d obtained as a result of complement activation in vivo by heating normal serum at 37 ^° C and treating it with zymosan , MgCl ₂ , E. coli, aggregated IgG, and represents a low molecular weight polypeptide (28000 47000 Daltons) with migration to the α-region during immunoelectrophoresis.

Первой стадией выделения С3d фрагмента С3 из осадка IV-I по Кону является осаждение 20%-ного осадка IV-I, растворенного в 0,1 М К-Р, pН 7,1 7,3, 1, мМ ЭДТА, 0,5 М NaCl, поли-(этиленгликолем) с м. м. 4000 6000. 32% ПЭГ 4000 - 6000 добавляют в 20%-ный раствор осадка IV-I до конечной концентрации 16% ПЭГ 4000 6000 при перемешивании, 4^oС. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием в течение 20 минут при 6000 об/мин, 4^oC. Супернатант служит источником для выделения С3d фрагмента С3 компонента комплемента. На второй стадии выделения С3d супернатант диализуют против 0,01 М К-Р, pН 7,5 10 мМ ЭДТА, затем хроматографируют на колонке с ДЕАЕ-Тоyopearl, уравновешенной тем же буфером. Связавшиеся белки элюируют линейным градиентом концентрации NaCl 0 0,3 М. Сконцентрированные путем ультрафильтрации на мембране UM-10 С3d содержащие фракции, идентифицированные с помощью иммунопреципитации против антисыворотки, специфичной к С3d, фирмы "Dakopatts", дополнительно очищают гель-фильтрацией на сефакриле S-200 в 0,01 М К-Р, pН 7,5, 10 мМ ЭДТА, 0,15 М NaCl, 0,02% NaN₃. С3d, полученный описанным способом, имеет молекулярную массу около 45000 Дальтон и мигрирует в a-область в иммуноэлектрофорезе.The first stage in the isolation of the C3d fragment of C3 from Cohn IV-I precipitate is the precipitation of a 20% IV-I precipitate dissolved in 0.1 M K-P, pH 7.1 7.3, 1, mM EDTA, 0.5 M NaCl, poly- (ethylene glycol) with a molecular weight of 4000 6000. 32% PEG 4000-6000 is added to a 20% solution of precipitate IV-I to a final concentration of 16% PEG 4000 6000 with stirring, 4 ^° C. The precipitate formed separated by centrifugation for 20 minutes at 6000 rpm, 4 ^° C. The supernatant serves as a source for isolating the C3d fragment of the C3 complement component. In the second step of isolating C3d, the supernatant is dialyzed against 0.01 M KP, pH 7.5 10 mM EDTA, then chromatographed on a DEAE-Toyopearl column equilibrated with the same buffer. Bound proteins are eluted with a linear gradient of NaCl concentration of 0.3 M. Concentrated by ultrafiltration on a UM-10 C3d membrane, the fractions identified by immunoprecipitation against C3d specific antiserum from Dakopatts are further purified by gel filtration on Sephacryl S- 200 in 0.01 M K-P, pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.15 M NaCl, 0.02% NaN ₃ . C3d obtained by the described method has a molecular weight of about 45,000 Daltons and migrates to the a region in immunoelectrophoresis.

Предлагаемый способ выделения С3d фрагмента С3 компонента комплемента человека имеет преимущества перед прототипом: он не требует ценного исходного сырья, каким является донорская плазма, а позволяет осуществить безотходную технологию на одном из этапов производства препаратов. крови, т. к. в качестве исходного сырья используется бросовый осадок IV-I, получаемый при промышленном фракционировании плазмы крови на холоде спиртовым методом Кона; способ прост в осуществлении, не требует дорогостоящих реактивов, ферментов, сорбентов для хроматографии. The proposed method for isolating the C3d fragment of the C3 component of a human complement has advantages over the prototype: it does not require valuable raw materials, such as donor plasma, but allows for non-waste technology at one of the stages of drug production. blood, since the IV-I waste precipitate obtained by industrial fractionation of blood plasma in the cold using the Cohn alcohol method is used as a feedstock; the method is simple to implement, does not require expensive reagents, enzymes, sorbents for chromatography.

Очищенный С3d фрагмент С3 компонента комплемента может быть использован:
1) как иммуноген для гипериммунизации животных с целью получения моноспецифической анти-С3d преципитирующей сыворотки;
2) для удаления нежелательных анти-С3d антител из поливалентных сывороток;
3) для определения титров анти-С3d преципитирующих сывороток методом РИД по Манчини (см. чертеж).Purified C3d fragment C3 of the complement component can be used:
1) as an immunogen for hyperimmunization of animals in order to obtain monospecific anti-C3d precipitating serum;
2) to remove unwanted anti-C3d antibodies from polyvalent sera;
3) to determine the titers of anti-C3d precipitating sera by the method of RID according to Mancini (see drawing).

Claims

A method for isolating a C3d fragment of a human complement C3 component, characterized in that precipitate IV-I is used as a raw material from industrial fractionation of blood plasma in the cold using the Kohn alcohol method by dissolving this precipitate in high ionic strength buffer, precipitating with polyethylene glycol 4000-6000 D followed by ion exchange chromatography of the supernatant on a DEAE anion exchanger and gel filtration.