RU2066953C1

RU2066953C1 - Method for vegetative micropropagation of selected planting material of karelian birch

Info

Publication number: RU2066953C1
Application number: RU94014499A
Authority: RU
Inventors: Л.В. Ветчинникова; Н.Н. Николаева; З.Д. Бумагина
Original assignee: Институт леса Карельского научного центра РАН
Priority date: 1994-04-15
Filing date: 1994-04-15
Publication date: 1996-09-27
Also published as: RU94014499A

Abstract

FIELD: biotechnology, forestry. SUBSTANCE: method involves using hybrid seed germs as explant; dividing germs into cuttings and planting on nutrient substrate; multiplying, rooting and planting propagules into soil. EFFECT: increased efficiency and simplified method. 2 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в леском хозяйстве для массового получения селекционного посадочного материала ценных древесных растений, в частности, березы карельской. The invention relates to biotechnology and can be used in forestry for mass production of selective planting material of valuable woody plants, in particular, Karelian birch.

Береза карельская (Betula pendula Roth, var, carelica Mercl.) отличается высокодекоративной текстурой древесины, однако ареал естественного произрастания ограничен. Она относится к трудноразмножаемым растениям, поскольку при свободном опылении ее происходит расщепление признаков и в потомстве лишь небольшая часть его наследует признаки узорчатой текстуры древесины. Karelian birch (Betula pendula Roth, var, carelica Mercl.) Has a highly decorative wood texture, but the natural habitat is limited. It belongs to hard-to-propagate plants, since with free pollination it splits the characters and in the offspring only a small part of it inherits the signs of the patterned texture of wood.

Использование контролируемого опыления с целью получения гибридных семян значительно повышает выход растений с признаками "карелистости" (до 80 и более) [1]
Однако контролируемое опыление достаточно трудоемкий процесс, сильно зависящий от климатических условий и биологических особенностей вида (цикличность цветения, низкая всхожесть гибридных семян и т. п.).The use of controlled pollination in order to obtain hybrid seeds significantly increases the yield of plants with signs of "karelity" (up to 80 or more) [1]
However, controlled pollination is a rather laborious process, highly dependent on climatic conditions and biological characteristics of the species (flowering cycle, low germination of hybrid seeds, etc.).

Известен способ микроклонального размножения карельской березы, включающий инкубирование межузловых стеблевых сегментов до образования на них сплошного слоя каллуса, который затем срезают и рекультивируют на свежей среде Мурасиге-Скуга с бензиламинопурином (БАП) 1 мг/л в контролируемых условиях (освещенность 3 4 клк в течение 24 ч при 25 26^oС) до формования адвентивных почек, которые при повторной пересадке культур формируются в побеги [2] Последние изолируют из каллуса, укореняют и доращивают на среде Буле без гормонов в тех же контролируемых условиях. Полученные регенеранты разрезают на микрочеренки с одной почкой и снова выращивают на той же среде. Процесс микрочеренкования повторяют несколько раз до получения необходимого количества растений, которые затем высаживают в горшочки с субстратом (торф и песок), доращивают в минитеплицах в течение 2 4 мес. С постепенным снижением влажности до естественной величины и переносят в пленочные теплицы для закаливания до конца вегетационного периода. Средний прирост к концу вегетационного периода составил 8,3 15,8 см.There is a method of microclonal propagation of Karelian birch, including incubating the interstitial stem segments until a continuous callus layer forms on them, which is then cut and recovered in fresh Murashige-Skoog medium with 1 mg / l benzylaminopurine (BAP) under controlled conditions (illumination 3-4 cl for 24 hours at 25 26 ^o C) before forming of adventitious buds, which when re-transplantation of cultures formed shoots in [2] Recently isolated from callus and perpetuate doraschivat Boulet on medium without hormones in the same control x conditions. The resulting regenerants are cut into microcranes with one kidney and grown again on the same medium. The microcherenking process is repeated several times until the required number of plants is obtained, which are then planted in pots with a substrate (peat and sand), grown in mini-greenhouses for 2-4 months. With a gradual decrease in humidity to a natural value and transferred to film greenhouses for hardening until the end of the growing season. The average growth at the end of the growing season was 8.3 15.8 cm.

Однако в указанном способе присутствует этап каллусообразования, который повышает вероятность самоклональной изменчивости исходного материала. При этом процесс получения посадочного материала достаточно длительный и составляет не менее 10 12 недь, средний прирост полученных растений довольно низкий (8,3 15,8 см). However, in this method there is a callus formation step, which increases the likelihood of self-clonal variability of the starting material. At the same time, the process of obtaining planting material is quite long and amounts to at least 10 12 weeks, the average growth of the obtained plants is quite low (8.3 15.8 cm).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности является способ клонального микроразмножения гибридов карельской березы [3] Согласно указанному способу в качестве исходных эксплантов используют верхушечные и пазушные почки гибридов карельской березы, рост каллуса и формирование конгломерата микропобегов проводят на основной агаризованной питательной среды по Мурасиге и Скугу с добавками 80 120 мг/л лизина, 0,05 - 0,15 мг/л кинетина, 0,6 1,0 мг/л БАП, 0,05 0,08 мг/л нафтилуксусной кислоты (НУК) (среда 1), с последующим субкультивированием и удлинением побегов на основной агаризованной среде с уменьшенной вдвое концентрацией макросолей и сахарозы и с дополнением 0,4 0,6 мг/л БАП, 0,3 0,5 мг/л ИУК - (среда 2), укоренение растений проводят на основной жидкой питательной среде с дополнением 0,4-0,6 мг/л индолил-3-масляной кислоты (ИМК) и 0,1 0,3 мг/л НУК (среда 3). Культуры выращивают при освещении люминесцентными лампами (10 000 лк) на 16-часовом фотопериоде при 25^oС и относительной влажности воздуха 70 Укоренные растения-регенеранты высаживают в почву в теплицу с последующей высадкой в открытый грунт. Указанный способ позволяет в течение 10 11 нед получить посадочный материал, при этом приживаемость растений составляет в среднем 76
Недостатком указанного способа является присутствие этапа каллусообразования, что увеличивает вероятность самоклональной изменчивости. Кроме того, процесс получения посадочного материала достаточно длительный и требует большого количества дефицитных и дорогостоящих реактивов. При этом невысок процент приживаемости растений, инфицированность и гибель эксплантов (почек) составляет в среднем 16,4
Цель предлагаемого изобретения повышение выхода размножаемого селекционного материала, сокращение сроков его получения, а кроме того, повышение эффективности способа за счет упрощения и удешевления процесса получения посадочного материала.Closest micropropagation of Karelian birch hybrids is closest to the proposed invention in technical essence [3] According to the specified method, apical and axillary buds of Karelian birch hybrids are used as initial explants, callus growth and formation of microboot conglomerate are carried out on the main agarized nutrient medium according to Murasige sku with additives 80 120 mg / l of lysine, 0.05 - 0.15 mg / l of kinetin, 0.6 1.0 mg / l of BAP, 0.05 0.08 mg / l of naphthylacetic acid (NAA) (medium 1) followed by subcultivation shoots and elongation of shoots on the main agar medium with a halved concentration of macrosalts and sucrose and with the addition of 0.4 0.6 mg / l BAP, 0.3 0.5 mg / l IAA - (medium 2), rooting of plants is carried out on the main liquid nutrient medium with the addition of 0.4-0.6 mg / l of indolyl-3-butyric acid (IMA) and 0.1 0.3 mg / l of NAA (medium 3). The cultures are grown under illumination with fluorescent lamps (10,000 lux) on a 16-hour photoperiod at 25 ^° C and relative air humidity. 70 Rooted regenerant plants are planted in the soil in a greenhouse, followed by planting in open ground. The specified method allows for 10 11 weeks to obtain planting material, while the survival rate of plants is on average 76
The disadvantage of this method is the presence of the stage of callus formation, which increases the likelihood of autoclonal variability. In addition, the process of obtaining planting material is quite lengthy and requires a large number of scarce and expensive reagents. Moreover, the percentage of plant survival is low, infection and death of explants (kidneys) is on average 16.4
The purpose of the invention is to increase the yield of propagated breeding material, reduce the time for its receipt, and in addition, increase the efficiency of the method by simplifying and reducing the cost of the process of obtaining planting material.

Цель достигается тем, что в способе клонального микроразмножения селекционного посадочного материала березы карельской, включающем получение проростков, их микрочеренкование, получение из микрочеренков побегов, размножение их, укоренение и адаптацию к нестерильным условиям среды растений-регенерантов, согласно изобретению, в качестве экспланта используют проростки гибридных семян. The goal is achieved by the fact that in the method of clonal micropropagation of the breeding planting material of Karelian birch, including the production of seedlings, their microcrops, shoots from microcrops, their propagation, rooting and adaptation to non-sterile environmental conditions of regenerated plants, according to the invention, hybrid seedlings are used as an explant seed.

Анализ научно-технической и патентной литературы показал, что проростки гибридных семян березы карельской для клонального микроразмножения селекционного посадочного материала не использовались. Высокая эффективность процесса, его тиражируемость, высокая приживаемость, отсутствие инфицированности экспланта, определяют промышленную применимость предлагаемого способа. Расширяется биологическое разнообразие (в данном случае) исчезающего вида березы карельской, что имеет большое значение для селекции и практики лесного хозяйства. Analysis of scientific, technical and patent literature showed that seedlings of hybrid seeds of Karelian birch for clonal micropropagation of selective planting material were not used. The high efficiency of the process, its replicability, high survival rate, lack of infection of the explant, determine the industrial applicability of the proposed method. The biological diversity (in this case) of the endangered species of Karelian birch is expanding, which is of great importance for breeding and forestry practices.

По предлагаемому способу состава питательной среды имеет меньший набор компонентов, что, во-первых, удешевляет его, и во-вторых, делает более доступным. Преимуществом предлагаемого способа является и то, что побеги формируются непосредственно из ткани экспланта, минуя каллусообразование. Как известно, клетки каллуса недостаточно устойчивы, в них возможны мутационные процессы, что может повлиять на генотип потомства. According to the proposed method, the composition of the nutrient medium has a smaller set of components, which, firstly, reduces its cost, and secondly, makes it more affordable. An advantage of the proposed method is that the shoots are formed directly from the explant tissue, bypassing callus formation. As you know, callus cells are not stable enough, mutation processes are possible in them, which can affect the genotype of offspring.

Способ осуществляют следующим образом. The method is as follows.

Гибридные семена от скрещивания лучших форм березы карельской стерилизуют в ламинаре в течение 1 мин в 70-ном этаноле, а затем 15 мин в "Пероксе". По окончании стерилизации трижды промывают автоклавированной дистиллированной водой и укладывают в чашки Петри для проращивания на стерильную увлажненную фильтровальную бумагу. Затем, проростки, вытянувшиеся до 1,5 2,0 см разрезают на черенки и горизонтально помещают на питательную среду А (табл. 1), основой которой служит среда Мурасиге-Скуга. На свету через 3 4 нед образуются многочисленные побеги с молодыми листьями. Побеги быстро растут и удлиняются. На этой же среде проводят мультипликацию побегов, т.е. умножение их. Полученные побеги вновь черенкуют и горизонтально субкультивируют на свежую среду А. Указанный процесс повторяют многократно в зависимости от необходимости в объеме посадочного материала. Побеги, достигшие высоты 1,5 - 2,5 см с развитыми листочками, пересаживают на среду Б для корнеобразования (табл. 1). Образование и формирование корней на среде Б наблюдается в течение 10 14 дн. Hybrid seeds from crossing the best forms of Karelian birch are sterilized in a laminar for 1 min in 70th ethanol, and then 15 min in Perox. At the end of sterilization, washed three times with autoclaved distilled water and placed in Petri dishes for germination on sterile moistened filter paper. Then, seedlings stretched to 1.5 2.0 cm are cut into cuttings and horizontally placed on a nutrient medium A (Table 1), which is based on the Murashige-Skoog medium. In the light, after 3 4 weeks, numerous shoots with young leaves are formed. Shoots grow rapidly and lengthen. On the same medium, shoots are multiplied, i.e. multiplying them. The resulting shoots are again cut and horizontally subcultured on fresh medium A. This process is repeated many times depending on the need for the amount of planting material. Shoots that have reached a height of 1.5 - 2.5 cm with developed leaflets are transplanted onto medium B for root formation (Table 1). The formation and formation of roots on medium B is observed for 10 14 days.

Полученные растения-регенеранты, имеющие стебелек с листочками и корневую систему, высаживают в нестерильные условия сразу в теплицу с полиэтиленовым покрытием и капельным поливом. The resulting regenerant plants having a leaf stalk and root system are planted in non-sterile conditions immediately in a greenhouse with a polyethylene coating and drip irrigation.

В табл. 2 представлены показатели роста растений, высаженных в теплицу в июне-июле 1993 г. In the table. Figure 2 shows the growth indicators of plants planted in a greenhouse in June-July 1993.

Как показывают данные табл. 2, несмотря на неблагоприятное лето 1993 г. прирост растений-регенерантов, полученных по предлагаемому способу, превышает прирост по сравнению с аналогом в 2 раза. As the data in table. 2, despite the unfavorable summer of 1993, the growth of regenerated plants obtained by the proposed method exceeds the growth in comparison with the analogue by 2 times.

Способ апробирован в опытно-производственных условиях. Получено и высажено более 3 тыс. растений-регенерантов. The method is tested in experimental production conditions. Received and planted more than 3 thousand plants-regenerants.

Преимуществом предложенного способа по сравнению с известными является отсутствие этапа каллусообразования, что уменьшает вероятность самоклональной изменчивости. Кроме того, во времени процесс получения посадочного материала сокращается на 2 3 нед и составляет 7 9 нед, тогда как в известном способе для культивирования необходимо 10 11 недель. The advantage of the proposed method compared to the known ones is the absence of a callus formation stage, which reduces the likelihood of self-clonal variability. In addition, over time, the process of obtaining planting material is reduced by 2 3 weeks and is 7 9 weeks, while in the known method for cultivation it takes 10 11 weeks.

В предложенном способе на отдельном черенке исходного материала образуется до 22 новых побегов, которые хорошо развиваются и в дальнейшем каждый из них дает полноценное растение. In the proposed method, up to 22 new shoots are formed on a separate shank of the source material, which develop well and in the future each of them gives a full plant.

Сравнение результатов укоренения in vitro показывает, что предлагаемый способ отличается упрощенным составом среды (экономятся дорогостоящие реактивы) и высоким процентом первичного укоренения (93 в предлагаемом, 69 в известном). Инфицирования и гибели регенерантов на этапах элонгации, мультипликации и укоренения не наблюдается. В предлагаемом способе приживаемость растений, высаженный в грунт, составила 83
Согласно проведенным экспериментом по предлагаемому способу клонального микроразмножения селекционного посадочного материала березы карельской в течение года можно получить более миллиона растений из одного семени.Comparison of the results of rooting in vitro shows that the proposed method has a simplified composition of the medium (saving expensive reagents) and a high percentage of primary rooting (93 in the proposed, 69 in the known). Infection and death of regenerants at the stages of elongation, animation and rooting is not observed. In the proposed method, the survival rate of plants planted in the soil was 83
According to the experiment on the proposed method of clonal micropropagation of breeding planting material of Karelian birch during the year, you can get more than a million plants from one seed.

Высокий коэффициент размножения, упрощенный и более доступный состав питательной среды позволяют использовать предлагаемый способ для решения производственных задач в лесном хозяйстве с целью выращивания ценного посадочного материала. Потомство может отличаться генетическим разнообразием, а это имеет большое положительное значение для селекционных целей и сохранения биологического разнообразия исчезающих растений. A high reproduction rate, a simplified and more affordable composition of the nutrient medium allow using the proposed method for solving production problems in forestry with the aim of growing valuable planting material. Offspring can differ in genetic diversity, and this is of great positive importance for breeding purposes and the conservation of biological diversity of endangered plants.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Leena Ryynanen, Martti Ryynanen. Propagation of adult curlybirch. Succeeds with tussue culture.-Silva Fennika. 20. 1986, p.139-147.INFORMATION SOURCES
1. Leena Ryynanen, Martti Ryynanen. Propagation of adult curlybirch. Succeeds with tussue culture.-Silva Fennika. 20. 1986, p. 139-147.

2. Авторское свидетельство СССР N 1597386, МКИ5 C 12 N 5/00, 1990 г. 2. Copyright certificate of the USSR N 1597386, MKI5 C 12 N 5/00, 1990

3. Авторское свидетельство СССР N 1752284, МКИ 5 A 01 H 4/00, 1992 г. ТТТ1 ТТТ2 3. USSR author's certificate N 1752284, MKI 5 A 01 H 4/00, 1992 TTT1 TTT2

Claims

The method of clonal micropropagation of the breeding material of Karelian birch, including the production of seedlings, their microcrossing, obtaining shoots from microcranes, their propagation, rooting and adaptation to non-sterile environmental conditions of regenerated plants, characterized in that hybrid seedlings are used as an explant.