RU2057807C1 - Method of carboxylesterase preparing, matrix for organophosphate compound detection and biochemical procedure for quantitative assay of organophosphate compounds - Google Patents
Method of carboxylesterase preparing, matrix for organophosphate compound detection and biochemical procedure for quantitative assay of organophosphate compounds Download PDFInfo
- Publication number
- RU2057807C1 RU2057807C1 SU5028222A RU2057807C1 RU 2057807 C1 RU2057807 C1 RU 2057807C1 SU 5028222 A SU5028222 A SU 5028222A RU 2057807 C1 RU2057807 C1 RU 2057807C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- substrate
- matrix
- esterase
- carboxylesterase
- roc
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к биохимии и аналитической химии и касается получения и применения карбоксилэстеразы нового аналитического реагента для высокочувствительного определения микроколичеств фосфорорганических соединений (ФОС), в том числе пестицидов, в различных объектах окружающей среды с помощью матриц и методик. The invention relates to biochemistry and analytical chemistry, and for the preparation and use of carboxyl esterase of a new analytical reagent for the highly sensitive determination of trace amounts of organophosphorus compounds (FOS), including pesticides, in various environmental objects using matrices and techniques.
Известен способ получения карбоксилэстеразы из листьев пшеницы путем экстракции буфером при рН 7,5 и отделения осадка [1]
Указанный способ является весьма трудоемким, требует дополнительной очистки от хлорофилла и не может быть использован в промышленных целях. Конечный препарат представляет собой водный экстракт, содержащий сложную белковую смесь с низким уровнем эстеразной активности.A known method of producing carboxyl esterase from wheat leaves by extraction with buffer at pH 7.5 and separation of the precipitate [1]
The specified method is very time-consuming, requires additional purification from chlorophyll and cannot be used for industrial purposes. The final preparation is an aqueous extract containing a complex protein mixture with a low level of esterase activity.
Указанный способ является наиболее близким по технической сущности к заявляемому объекту и потому выбран авторами в качестве прототипа. Кроме того, указанный способ хотя и позволяет получать препарат, пригодный для использования в колориметрических методиках, однако не гарантирует получение препарата с эксплуатационными характеристиками, необходимыми при его использовании в матрицах для анализа ФОС, а именно из-за неудовлетворительной смачиваемости матрицы в воде снижается чувствительность анализа и воспроизводимость результатов. The specified method is the closest in technical essence to the claimed object and therefore is selected by the authors as a prototype. In addition, this method, although it allows you to get a drug suitable for use in colorimetric methods, however, it does not guarantee the preparation with the performance characteristics required when using it in matrices for the analysis of FOS, namely, because of the unsatisfactory wettability of the matrix in water, the sensitivity of the analysis and reproducibility of results.
Целью изобретения является разработка способа промышленного получения препарата фермента с улучшенными эксплуатационными характеристиками для использования в матрицах и методиках. The aim of the invention is to develop a method for industrial production of an enzyme preparation with improved performance for use in matrices and methods.
Сущность изобретения состоит в том, что в отличие от известного способа получения препарата, в котором измельченные листья пшеницы экстрагируют 0,05 М трис-буфером рН 7,5 в соотношении 1:5 (масса:объем) в течение 30 мин. Осадок отделяют фильтрацией через капрон и центрифугируют 45 мин при N 18000 об. /мин. Надосадочная жидкость без дальнейшей очистки использовали в качестве аналитического реагента. В заявляемом способе экстракцию проводят при рН 7,6; осадок отделяют, а после ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сорбенте проводят высаливание фермента сульфатом аммония при степени насыщения 0,7, активную фракцию диализуют и высушивают. Экстракцию фермента проводят водой при рН 7,6. Так как при последующем добавлении сухого ДЕАЕ-сорбента происходит закисление экстракта до оптимального значения рН, при котором происходит эффективная сорбция фермента. Дополнительная очистка препарата путем высаливания сульфатом аммония с последующим диализом раствора фермента позволяет избавиться от примесей, присутствие которых ухудшает смачиваемость матрицы. The essence of the invention lies in the fact that, in contrast to the known method for producing a preparation in which the crushed wheat leaves are extracted with 0.05 M Tris-buffer pH 7.5 in a ratio of 1: 5 (mass: volume) for 30 minutes The precipitate was separated by filtration through nylon and centrifuged for 45 min at N 18000 vol. / min The supernatant without further purification was used as an analytical reagent. In the inventive method, the extraction is carried out at a pH of 7.6; the precipitate is separated, and after ion exchange chromatography on a DEAE sorbent, the enzyme is salted out with ammonium sulfate at a saturation degree of 0.7, the active fraction is dialyzed and dried. The extraction of the enzyme is carried out with water at pH 7.6. Since the subsequent addition of the dry DEAE sorbent, the extract is acidified to the optimum pH value at which the enzyme is effectively sorbed. Additional purification of the drug by salting out with ammonium sulfate followed by dialysis of the enzyme solution allows you to get rid of impurities, the presence of which impairs the wettability of the matrix.
Полученный заявляемым способом препарат используется при получении матриц, применяемых в различных уже существующих, а также вновь разрабатываемых индикаторных устройствах (индикаторных трубках, лентах, бумагах и т. д. ) для экспресс-обнаружения фосфорорганических соединений в различных средах: вода, воздух, экстракты органическими растворителями. Obtained by the claimed method, the drug is used to obtain matrices used in various existing, as well as newly developed indicator devices (indicator tubes, tapes, papers, etc.) for the express detection of organophosphorus compounds in various media: water, air, organic extracts solvents.
П р и м е р 1. Способ получения карбоксилэстеразы. PRI me R 1. The method of obtaining carboxyl esterase.
800 г зерен пшеницы (без примесей семян сорняков) непосредственно перед началом выделения размельчают на мельнице. Полученную муку экстрагируют 8 л дистиллированной воды с рН 7,6 в течение 1 ч при 18оС. Полученную суспензию оставляют на несколько часов при 5-10оС, а затем декантируют. К надосадочной жидкости добавляют сухой ДЕАЕ-сорбент, например сефадекс А-50, в количестве 6 г и перемешивают 30 мин. Суспензию декантируют. Осадок геля дважды промывают 20 мМ раствором трис-буфера рН 7,3, осадок переносят в колонку и элюируют 0,7 М раствором хлористого натрия в том же буфере. В элюате, содержащем фермент, проводят высаливание сульфатом аммония: осадок, образующийся при степени насыщения 0,35 отбрасывают, супернатант доводят до степени насыщения 0,7, осадок растворяют в минимальном объеме 20 мМ трис-буфера рН 7,3. Раствор фермента диализуют против того же буфера и лиофильно высушивают. Препарат карбоксилэстеразы представляет собой порошок белого или светло-серого цвета, без запаха, хорошо растворимый в воде. Выход препарата по активности составляет на менее 50% от исходной (в способе-прототипе 30%).800 g of wheat grains (without impurities of weed seeds) are crushed in a mill just before the selection begins. The resulting flour was extracted with 8 liters of distilled water at pH 7.6 for 1 h at 18 C. The resulting suspension was left for several hours at 5-10 ° C and then decanted. Dry DEAE sorbent, for example Sephadex A-50, is added to the supernatant in an amount of 6 g and stirred for 30 minutes. The suspension is decanted. The gel precipitate is washed twice with a 20 mM Tris buffer pH 7.3 solution, the precipitate is transferred to a column and eluted with a 0.7 M sodium chloride solution in the same buffer. In the eluate containing the enzyme, salting out is carried out with ammonium sulfate: the precipitate formed at a saturation degree of 0.35 is discarded, the supernatant is adjusted to a saturation degree of 0.7, and the precipitate is dissolved in a minimum volume of 20 mM Tris buffer pH 7.3. The enzyme solution is dialyzed against the same buffer and freeze-dried. The carboxyl esterase preparation is a white or light gray powder, odorless, readily soluble in water. The yield of the drug by activity is less than 50% of the original (in the prototype method 30%).
П р и м е р 2. Аналогичен примеру 1 за исключением того, что на стадии экстракции используют измельченные зерна ячменя. Выход препарата по активности составляет 48% от исходной. В табл.1 приведена характеристика карбоксилэстеразы, полученной по способу-прототипу и заявляемым способом. PRI me R 2. Similar to example 1 except that at the stage of extraction using crushed barley grains. The yield of the drug by activity is 48% of the original. Table 1 shows the characteristics of carboxyl esterase obtained by the prototype method and the claimed method.
Использование данного способа позволяет получить препарат с улучшенными характеристиками для использования в матрицах. Кроме того, данный способ может быть использован для промышленного получения фермента. Using this method allows to obtain a drug with improved characteristics for use in matrices. In addition, this method can be used for industrial production of the enzyme.
Полученный заявляемым способом препарат карбоксилэстеразы может быть использован в составе индикаторных рецептур для создания матриц, применяемых для экспресс-анализа ФОС. Obtained by the claimed method, the preparation of carboxyl esterase can be used in indicator formulations to create matrices used for rapid analysis of FOS.
Известна матрица, используемая для определения фосфорорганических ингибиторов в воде [2] Матрица выполнена в виде подложки (хроматографической бумаги) с нанесенными на нее субстратом (бутирилхолинйодидом), индикатором (бромтимоловым синим), а в качестве основного аналитического реагента используется эстераза-бутирилхолинэстераза сыворотки крови лошади в виде раствора. Процедура анализа следующая: исследуемую пробу ингибитора, например, диизопропилфторфосфата смешивают с раствором эстеразы, инкубируют в течение определенного времени и на инкубируемую смесь накладывают кусочки хроматографической бумаги, пропитанной субстрат-индикаторной смесью. В контроле вместо ингибитора используется дистиллированная вода. Присутствие ингибитора регистрируется визуально по разнице окраски пробы и контроля в течение наблюдаемого времени. Существенным недостатком описанной матрицы является необходимость приготовления раствора эстеразы перед каждой серией анализов, что повышает трудоемкость и снижает производительность анализа, а также характеризуется низкой воспроизводимостью результатов анализа по сравнению с заявляемой матрицей. Матрица для анализа ФОС может быть реализована в виде одно- или двухэлементного устройства, что поясняется следующими примерами. Known matrix used to determine organophosphorus inhibitors in water [2] The matrix is made in the form of a substrate (chromatographic paper) coated with a substrate (butyrylcholinium iodide), an indicator (bromothymol blue), and horse serum esterase-butyrylcholinesterase is used as the main analytical reagent in the form of a solution. The analysis procedure is as follows: a test sample of an inhibitor, for example, diisopropyl fluorophosphate, is mixed with an esterase solution, incubated for a certain time, and pieces of chromatographic paper impregnated with a substrate-indicator mixture are applied to the incubated mixture. In the control, distilled water is used instead of the inhibitor. The presence of an inhibitor is detected visually by the difference in sample color and control over the observed time. A significant drawback of the described matrix is the need to prepare an esterase solution before each series of analyzes, which increases the complexity and reduces the performance of the analysis, and is also characterized by low reproducibility of the analysis results in comparison with the claimed matrix. The matrix for the analysis of FOS can be implemented as a one- or two-element device, which is illustrated by the following examples.
П р и м е р 3. Матрица одноэлементная. Изготовление матрицы. PRI me R 3. The matrix is singleton. Fabrication of the matrix.
Бумажную подложку пропитывают буферно-индикаторным раствором карбоксилэстеразы, а именно: сначала готовят раствор индикатора, например, дихлориндофенолята натрия 0,3 мг/мл в буфере, например, 0,3 М фосфатном рН 8,7, затем в полученный раствор добавляют заданное количество фермента. Пропитанную полученным раствором подложку сушат при температуре не выше 48оС в течение 2,5 ч. Далее высушенную подложку пропитывают раствором субстрата, например, 1-тионафтилацетата (20 мг/мл) в неполярном органическом растворителе, например бензоле, и повторно высушивают при температуре не выше 30оС.The paper substrate is impregnated with a buffer-indicator solution of carboxyl esterase, namely: first, a solution of an indicator, for example, sodium dichloroindophenolate 0.3 mg / ml in a buffer, for example, 0.3 M phosphate pH 8.7, is prepared, then a predetermined amount of enzyme is added to the resulting solution . The impregnated substrate was dried with the obtained solution at a temperature not higher than 48 ° C for 2.5 hours. The dried support is impregnated with a solution of the substrate, e.g., 1-tionaftilatsetata (20 mg / ml) in a nonpolar organic solvent such as benzene, and again dried at a temperature no higher than 30 about C.
П р и м е р 4 аналогичен примеру N 3 за исключением того, что вместо бумаги в качестве подложки используют хлопчатобумажную ленту. PRI me R 4 is similar to example N 3 except that instead of paper, cotton tape is used as a substrate.
П р и м е р 5 аналогичен примеру 3 за исключением того, что в качестве подложки используют синтетическую ленту. PRI me
П р и м е р 6. Матрица двухэлементная. Изготовление матрицы. PRI me R 6. The matrix is two-element. Fabrication of the matrix.
Бумажную подложку (подложка N1) пропитывают буферно-индикаторным раствором карбоксилэстеразы, а именно: сначала готовят раствор индикатора, например, дихлориндофенолята натрия 0,3 мг/мл в буфере, например, 0,3 М фосфатном рН 8,7, затем в полученный раствор добавляют заданное количество фермента. Пропитанную полученным раствором подложку сушат при температуре не выше 48оС в течение 2,5 ч. Бумажную подложку (подложка N2) пропитывают раствором субстрата, например, 1-тионафтилацетата (20 мг/мл) в неполярном органическом растворителе, например, бензоле и высушивают при температуре не выше 30оС. Подложки 1 и 2 одинаковы по размеру.The paper substrate (substrate N1) is impregnated with a buffer-indicator solution of carboxyl esterase, namely: first, prepare a solution of an indicator, for example, sodium dichloroindophenolate 0.3 mg / ml in a buffer, for example, 0.3 M phosphate pH 8.7, then into the resulting solution add a given amount of enzyme. The impregnated substrate obtained solution was dried at a temperature not higher than 48 ° C for 2.5 hours. The paper substrate (N2 substrate) is impregnated with a solution of the substrate, e.g., 1-tionaftilatsetata (20 mg / ml) in a nonpolar organic solvent, e.g., benzene and dried at a temperature of not higher than 30 ° C. The substrates 1 and 2 are identical in size.
П р и м е р 7 аналогичен примеру 6 за исключением того, что в качестве подложки используется хлопчатобумажная лента. PRI me R 7 is similar to example 6 except that cotton tape is used as the substrate.
П р и м е р 8 аналогичен примеру 6 за исключением того, что в качестве подложки используется синтетическая лента. Example 8 is similar to example 6 except that a synthetic tape is used as a substrate.
П р и м е р 9. Аналогичен примеру 6 за исключением того, что раствора субстрата в органическом растворителе помещен в любое устройство, позволяющее его дозированное прикапывание на подложку N 1. PRI me R 9. Similar to example 6 except that the solution of the substrate in an organic solvent is placed in any device that allows its metered dropping onto a substrate N 1.
П р и м е р 10. Матрица одно- или двухэлементная с дополнительной пропиткой, например раствором кремнезоля. Изготовление матрицы аналогично примерам 3-9 за исключением того, что перед пропиткой подложки N 1 буферно-индикаторным раствором карбоксилэстеразы подложку пропитывают раствором кремнезоля заданной концентрации. Примечание. Количественное соотношение компонентов в пропиточной растворе для изготовления матриц, описанных в примерах 3-10, подбирают в соответствии с заданной чувствительностью анализа. Проведение анализа ФОС с помощью матриц в различных средах появляется следующими примерами:
П р и м е р 11. Проведение анализа по обнаружению ФОС в воде с помощью одноэлементной матрицы. Для анализа берут две матрицы, из которых одну смачивают в дистиллированной воде (контрольная матрица), вторую в водном растворе анализируемой пробы (опытная матрица), через определенное время наблюдают индикационный эффект. Индикационный эффект заключается в обесцвечивании контрольной матрицы и сохранении исходной окраски опытной матрицы в случае наличия ФОС в исследуемой пробе. При отсутствии ФОС опытная матрица обесцвечивается одновременно с контрольной.PRI me R 10. The matrix is one- or two-element with additional impregnation, for example, a solution of silica sol. The fabrication of the matrix is similar to examples 3-9 except that before impregnation of the substrate N 1 with a buffer-indicator solution of carboxyl esterase, the substrate is impregnated with a solution of silica of a given concentration. Note. The quantitative ratio of the components in the impregnating solution for the manufacture of the matrices described in examples 3-10, is selected in accordance with a given sensitivity analysis. The analysis of FOS using matrices in various environments appears with the following examples:
PRI me R 11. The analysis of the detection of FOS in water using a single-element matrix. For analysis, two matrices are taken, one of which is moistened in distilled water (control matrix), the second in an aqueous solution of the analyzed sample (experimental matrix), and after a certain time the indicator effect is observed. The indication effect consists in discoloration of the control matrix and preservation of the initial color of the experimental matrix in the case of the presence of FOS in the test sample. In the absence of FOS, the experimental matrix is discolored simultaneously with the control.
П р и м е р 12. Проведение анализа по обнаружению ФОС в воде с помощью двухэлементной матрицы. Аналогичен примеру 11, за исключением того, что в дистиллированной воде и анализируемой пробе смачивается подложка, пропитанная буферно-индикаторным раствором карбоксилэстеразы и после инкубации в течение 1-5 мин, эти подложки совмещают с подложками, содержащими субстрат. Через определенное время наблюдают индикационный эффект. PRI me R 12. The analysis of the detection of FOS in water using a two-element matrix. Similar to example 11, except that in the distilled water and the analyzed sample the substrate is wetted, impregnated with a buffer-indicator solution of carboxyl esterase and after incubation for 1-5 minutes, these substrates are combined with substrates containing the substrate. After a certain time, an indication effect is observed.
П р и м е р 13. Проведение анализа по обнаружению ФОС в органических экстрактах с помощью одноэлементной матрицы. Аналогично примеру 11 за исключением того, что контрольную матрицу смачивают в чистом органическом растворителе, а опытную в органическом экстракте анализируемой пробы. Обе матрицы высушивают на воздухе и смачивают в дистиллированной воде. Через определенное время наблюдают индикационный эффект. PRI me R 13. The analysis of the detection of FOS in organic extracts using a single element matrix. Analogously to example 11 except that the control matrix is wetted in a pure organic solvent, and experimental in the organic extract of the analyzed sample. Both matrices are air dried and wetted in distilled water. After a certain time, an indication effect is observed.
П р и м е р 14. Проведение анализа по обнаружению ФОС в органических экстрактах с помощью двухэлементной матрицы. Аналогично примеру 12 за исключением того, что подложку, пропитанную индикаторно-буферным раствором карбоксилэстеразы (подложка N 1), предварительно смачивают: контрольную в чистом растворителе, опытную в органическом экстракте анализируемой пробы. Обе подложки высушивают на воздухе и после этого смачивают в дистиллированной воде и далее аналогично анализу в воде (пример 12). Примечание. Использование контрольной матрицы в примерах 11-14 не является обязательным, поскольку в сертификатах к матрицам указывается время обесцвечивания в дистиллированной воде. PRI me R 14. The analysis of the detection of FOS in organic extracts using a two-element matrix. Analogously to example 12, except that the substrate impregnated with the indicator-buffer solution of carboxyl esterase (substrate No. 1) is pre-wetted: the control in a pure solvent, experienced in the organic extract of the analyzed sample. Both substrates are dried in air and then wetted in distilled water and then similar to analysis in water (example 12). Note. The use of the control matrix in examples 11-14 is not necessary, since the certificates for the matrices indicate the time of bleaching in distilled water.
П р и м е р 15. Проведение анализа ФОС в воздухе с помощью одно- и двухэлементной матрицы. Поглощение ФОС из воздуха может быть осуществлено с помощью барботирования через растворитель (вода, органический растворитель). Далее анализ проводят: водных проб аналогично примерам 11-12; органических экстрактов аналогично примерам 13-14. PRI me R 15. The analysis of FOS in the air using a single and two-element matrix. The absorption of FOS from air can be carried out by sparging through a solvent (water, organic solvent). Further analysis is carried out: water samples similarly to examples 11-12; organic extracts similarly to examples 13-14.
П р и м е р 16. Проведение анализа ФОС в воздухе с помощью одно- или двухэлементной матрицы, содержащей, например, кремнезоль. PRI me R 16. The analysis of FOS in air using a one- or two-element matrix containing, for example, silica sol.
Матрицу, приготовленную описанным в примере 10 способом, закрепляют в любом устройстве, обеспечивающим продувку воздуха требуемого объема, например-ручной насос. После продувки воздуха подложку извлекают из устройства и смачивают в дистиллированной воде. В случае одноэлементной матрицы индикационный эффект заключается в сохранении исходной окраски матрицы в зоне прососа воздуха, что свидетельствует о наличии ФОС в анализируемом воздухе (окрашенное пятно на белом фоне). В случае двухэлементной матрицы воздух продувают через подложку, содержащую фермент, после чего ее извлекают из устройства и смачивают в дистиллированной воде, инкубируют 1-5 мин и совмещают с подложкой, содержащей субстрат. Через определенное время наблюдают индикационный эффект. Примечение. При анализе воздуха могут быть использованы индикаторные трубки с помещенной внутрь матрицей, содержащей в индикаторной рецептуре карбоксилэстеразу злаковых культур. The matrix prepared by the method described in example 10 is fixed in any device providing air purging of the required volume, for example, a hand pump. After purging the air, the substrate is removed from the device and moistened in distilled water. In the case of a single-element matrix, the indication effect is to preserve the initial color of the matrix in the zone of air leakage, which indicates the presence of FOS in the analyzed air (colored spot on a white background). In the case of a two-element matrix, air is blown through a substrate containing the enzyme, after which it is removed from the device and moistened in distilled water, incubated for 1-5 min and combined with a substrate containing a substrate. After a certain time, an indication effect is observed. Note When analyzing air, indicator tubes with an internal matrix containing cereal carboxyl esterase in the indicator formulation can be used.
С помощью матриц, описанных в примерах 3-10 можно проводить биохимический анализ по обнаружению ФОС общей форму- лы 
П р и м е р 17. Биохимическое обнаружение ФОС, таких как ярмин, фосфакол, диизопропилфосфат, карбофос, фталофос, антис, фозалон, метафос, базудин и т.д. с использованием матриц. К 100 мл водно-ацетонового экстракта, содержащего анализируемое вещество, приливают 20 мл 1М раствора соли плавиковой кислоты, например, фторида калия, перемешивают и выдерживают 20-30 мин, после чего приливают 2-5 мл органического растворителя, например гексана. Смесь встряхивают в течение 1 мин. Гексановый слой подвергают анализу с использованием одно- или двухэлементной матрицы аналогично примерам 13-14. Чувствительность обнаружения ФОС с использованием матрицы приведена в табл.2. PRI me R 17. Biochemical detection of FOS, such as yarmin, phosphacol, diisopropyl phosphate, karbofos, phthalophos, antis, fosalon, metaphos, bazudine, etc. using matrices. 20 ml of a 1M solution of hydrofluoric acid salt, for example, potassium fluoride, are added to 100 ml of an aqueous-acetone extract containing the analyte, stirred and incubated for 20-30 minutes, after which 2-5 ml of an organic solvent, for example hexane, is added. The mixture is shaken for 1 min. The hexane layer is subjected to analysis using a one or two element matrix as in Examples 13-14. The sensitivity of detection of FOS using a matrix is given in table.2.
Известно, что эстеразы используются также в биохимических колориметрических методиках определения ФОС [3] В качестве эстеразы используют ферменты животного происхождения: бутирилхолин-эстеразу сыворотки крови лошадей или ацетилхолинэстеразу эритроцитов. Анализ проводится путем смешения раствора пробы, исследуемой на содержание ФОС, с раствором эстеразы, инкубацией в течение определенного времени, добавлением субстрата и фотоколориметрирования пробы на спектрофотометре. Расчет концентрации ингибитора в пробе осуществляют по калибровочной кривой, представляющей собой функцию экстинции от концентрации. Указанный аналог выбран в качестве прототипа. Карбоксилэстераза, как аналитический реагент, может использоваться в колориметрическом анализе, в визуальных и инструментальных методиках, что поясняется следующими примерами. It is known that esterases are also used in biochemical colorimetric methods for determining FOS [3]. As an esterase, enzymes of animal origin are used: horse serum butyrylcholine esterase or erythrocyte acetylcholinesterase. The analysis is carried out by mixing the sample solution studied for the content of FOS with an esterase solution, incubation for a certain time, adding a substrate and photocolorimetry of the sample on a spectrophotometer. Calculation of the concentration of inhibitor in the sample is carried out according to the calibration curve, which is a function of extinction from the concentration. The specified analogue is selected as a prototype. Carboxyl esterase, as an analytical reagent, can be used in colorimetric analysis, in visual and instrumental methods, which is illustrated by the following examples.
П р и м е р 18. Биохимический способ количественного определения ФОС, например, армина, колориметрическим методом по реакции гидролиза субстрата, например, 1-тионафтилацетата карбоксил-эстеразой 1. Определение активности карбоксилэстеразы (Al). В спектрофотометрическую кювету, термостатируемую при 35оС вносят 1 мл раствора карбоксилэстеразы в 0,3 М фосфатном буфере с рН 8,0, 0,1 мл дистиллированной воды и 1 мл раствора 1-тионафтилацетата с концентрацией 3 ·10-4 М. Прирост оптической плотности в единицу времени (ΔД1) наблюдают на длине волны 335 нм в течение, например, 5 мин. При добавлении реагента на SH-группы прирост оптической плотности наблюдают на длине волны поглощения индикатора.Example 18. Biochemical method for the quantitative determination of FOS, for example, armin, by the colorimetric method by the reaction of hydrolysis of a substrate, for example, 1-thionaphthyl acetate by carboxyl esterase 1. Determination of the activity of carboxyl esterase (Al). In a spectrophotometric cuvette, thermostatted at 35 C. 1 ml of making carboxylesterase solution in 0.3 M phosphate buffer pH 8.0, 0.1 ml of distilled water and 1 ml of a solution of 1-tionaftilatsetata a concentration of 3 x 10 -4 M. Gain optical density per unit time (Δ1) is observed at a wavelength of 335 nm for, for example, 5 minutes When reagent is added to SH groups, an increase in optical density is observed at the absorption wavelength of the indicator.
2. Определение активности карбоксилэстеразы в присутствии анализируемой пробы (А2). В спектрофотометрическую кювету, термостатируемую при 35С вносят 1 мл раствора карбоксилэстеразы в 0,3 М фосфатном буфере с рН 8,0; 0,1 мл анализируемой пробы, например, раствор армина, инкубируют 10 мин. и добавляют 1 мл раствора субстрата. Прирост оптической плотности ( ΔД2) наблюдают как описано в п.1. 2. Determination of the activity of carboxyl esterase in the presence of the analyzed sample (A2). Into a spectrophotometric cuvette, thermostatically controlled at 35 ° C, add 1 ml of a solution of carboxyl esterase in 0.3 M phosphate buffer with a pH of 8.0; 0.1 ml of the analyzed sample, for example, an armin solution, is incubated for 10 minutes. and add 1 ml of substrate solution. The increase in optical density (Δ2) is observed as described in claim 1.
3. Обработка результатов. Рассчитывают активность препарата в отсутствие и в присутствии анализируемой пробы по формуле
A 
V1 объем реакционной смеси, мл;
V2 объем раствора фермента, мл;
К коэффициент молярной экстинкции субстрата;
С концентрация фермента, мг/мл.3. Processing the results. The activity of the drug is calculated in the absence and in the presence of the analyzed sample according to the formula
A
V1 is the volume of the reaction mixture, ml;
V2 volume of the enzyme solution, ml;
To the coefficient of molar extinction of the substrate;
With the concentration of the enzyme, mg / ml.
По приведенной выше формуле рассчитывают A1 и А2. Далее рассчитывают степень угнетания активности карбоксилэстеразы (J,) анализируемой пробой по формуле
J 
J
П р и м е р 19. Аналогичен примеру 18 за исключением того, что в качестве субстрата используют 2-тионафтилацетат. PRI me R 19. Similar to example 18 except that 2-thionaphthyl acetate is used as a substrate.
П р и м е р 20. Аналогичен примеру 18 за исключением того, что в качестве субстрата используют тиофенилпропионат. PRI me R 20. Similar to example 18 except that thiophenylpropionate is used as a substrate.
П р и м е р 21. Аналогичен примеру 18 за исключением того, что в качестве субстрата используют индофенилацетат. PRI me R 21. Similar to example 18 except that indophenyl acetate is used as a substrate.
П р и м е р 22. Аналогичен примеру 18 за исключением того, что в качестве субстрата используют 1-нафтилацетат, а измерение проводят флуориметрическим методом. PRI me R 22. Similar to example 18 except that 1-naphthyl acetate is used as the substrate, and the measurement is carried out by the fluorimetric method.
П р и м е р 23. Аналогичен примеру 18 за исключением того, что в качестве субстрата используют 2-нафтилацетат, измерение проводят флуориметрическим методом. PRI me R 23. Similar to example 18 except that 2-naphthyl acetate is used as the substrate, the measurement is carried out by the fluorimetric method.
П р и м е р 24. Аналогичен примеру 18, за исключением того, что в качестве субстрата используют N-метилиндоксилацетат. PRI me R 24. Similar to example 18, except that as the substrate using N-methylindoxyl acetate.
Как показано в примерах 18-24, в качестве субстратов карбоксилэстеразы могут использоваться сложные эфиры общей формулы ROC(O)R1 и ROC(S)R1, где R фенил, нафтил 1 или 2, R1 метил или этил.As shown in Examples 18-24, esters of the general formula ROC (O) R 1 and ROC (S) R 1 , where R is phenyl, naphthyl 1 or 2, R 1 is methyl or ethyl, can be used as substrates of carboxyl esterase.
Приведенные примеры показывают, что карбоксилэстераза растительного происхождения может быть с успехом использована в качестве аналитического реагента для определения большого круга ФОС с высокой специфичностью как индивидуальной, так и групповой, в различных средах: в воде, воздухе, органических растворителях. Все изложенное выше показывает, что карбоксилэстераза может заменить эстеразы животного и микробного происхождения в средствах и методиках анализа ФОС. The above examples show that plant-derived carboxyl esterase can be successfully used as an analytical reagent to determine a wide range of FOS with high specificity, both individual and group, in various environments: in water, air, organic solvents. All of the above shows that carboxyl esterase can replace esterases of animal and microbial origin in the means and methods of analysis of FOS.
Claims (3)
в различных средах, отличающаяся тем, что в качестве субстрата используют сложные эфиры общей формулы ROC(O)R1 и ROC(S)R1, где R фенил, нафтил 1 и 2, R1 метил или этил, а в качестве экстеразы используют карбоксилэстеразу из зерен злаковых культур.2. The matrix for the detection of organophosphorus compounds, made in the form of poses with the components of the substrate-indicator system using esterase to detect organophosphorus compounds of the General formula
in various media, characterized in that esters of the general formula ROC (O) R 1 and ROC (S) R 1 are used as a substrate, where R is phenyl, naphthyl 1 and 2, R 1 is methyl or ethyl, and as an exterase, carboxyl esterase from cereal grains.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5028222 RU2057807C1 (en) | 1991-12-24 | 1991-12-24 | Method of carboxylesterase preparing, matrix for organophosphate compound detection and biochemical procedure for quantitative assay of organophosphate compounds |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5028222 RU2057807C1 (en) | 1991-12-24 | 1991-12-24 | Method of carboxylesterase preparing, matrix for organophosphate compound detection and biochemical procedure for quantitative assay of organophosphate compounds |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2057807C1 true RU2057807C1 (en) | 1996-04-10 |
Family
ID=21597335
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU5028222 RU2057807C1 (en) | 1991-12-24 | 1991-12-24 | Method of carboxylesterase preparing, matrix for organophosphate compound detection and biochemical procedure for quantitative assay of organophosphate compounds |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2057807C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2475736C1 (en) * | 2011-11-14 | 2013-02-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-производственная фирма "СЕРВЭК" ЗАО "НПФ "СЕРВЭК" | Device for control of harmful substances with enzyme-inhibitory effect |
| RU2755887C2 (en) * | 2019-11-27 | 2021-09-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Астраханский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of extracting carboxyl esterase of human seed plasma |
-
1991
- 1991-12-24 RU SU5028222 patent/RU2057807C1/en active
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 1. Физиология и биохимия культурных растений 1983, 15, N 1, с.28-32. * |
| 2. Франке З. Химия отравляющих веществ. М.: Химия, 1973, с.176. * |
| 3. Там же, с.179. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2475736C1 (en) * | 2011-11-14 | 2013-02-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-производственная фирма "СЕРВЭК" ЗАО "НПФ "СЕРВЭК" | Device for control of harmful substances with enzyme-inhibitory effect |
| RU2755887C2 (en) * | 2019-11-27 | 2021-09-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Астраханский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of extracting carboxyl esterase of human seed plasma |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| de Araújo et al. | Determination of phospholipase A2 activity by a colorimetric assay using a pH indicator | |
| DAS et al. | Selectivity of protein oxidative damage during aging in Drosophila melanogaster | |
| KR920010313B1 (en) | Determination of sodium ions in fluids | |
| Zhou et al. | Raw material enzymatic activity determination: a specific case for validation and comparison of analytical methods—the example of superoxide dismutase (SOD) | |
| US6340572B1 (en) | Kit for the isolation, identification and quantitation of toxicants | |
| JPS5886083A (en) | Stabilizing agent for glycerol-3-phosphoric acid oxidase | |
| Asryants et al. | Determination of Sepharose-bound protein with Coomassie brilliant blue G-250 | |
| Matsumura et al. | Studies on carboxyesterase in malathion-resistant Culex tarsalis | |
| US4211844A (en) | Bilirubin-specific fungal enzyme preparation | |
| US7713690B1 (en) | Luminous bacteria and methods for the isolation, identification and quantitation of toxicants | |
| JPH0549278B2 (en) | ||
| Funk et al. | Resolution of the isoenzymes of soybean lipoxygenase using isoelectric focusing and chromatofocusing | |
| NZ268405A (en) | Atp-adp chemiluminescent testing for microorganisms including a source of a magnesium ion | |
| Taylor et al. | PTEN and myotubularins: families of phosphoinositide phosphatases | |
| RU2057807C1 (en) | Method of carboxylesterase preparing, matrix for organophosphate compound detection and biochemical procedure for quantitative assay of organophosphate compounds | |
| Garside et al. | A thin-layer chromatographic method for the determination of plant pigments in sea water and cultures | |
| Susor et al. | [15] Fructose-diphosphate aldolase, pyruvate kinase, and pyridine nucleotide-linked activities after electrophoresis | |
| US4001088A (en) | Method for the determination of creatine phosphokinase enzyme | |
| Barbour et al. | Studies on measurement of plasma magnesium: application of the Magon dye method to the" Monarch" centrifugal analyzer. | |
| US20080113401A1 (en) | Cell-Based Assay for the Detection of Toxic Analytes | |
| Tsuchiya et al. | Temperature‐dependent changes in phospholipid and fatty acid composition and membrane lipid fluidity of Yersinia enterocolitica | |
| Yamato et al. | Preparation and characterization of immobilized acid phosphatase used for an enzyme reactor: evaluation in flow-injection analysis and pre-column liquid chromatography | |
| US4142938A (en) | Determination of triglycerides and glycerol | |
| RU2157850C1 (en) | Method of determination of anticholine esterase compounds in water and aqueous extracts | |
| Pickering et al. | Studies of rat alkaline phosphatase: I. Development of methods for detecting isoenzymes |