RU2054486C1

RU2054486C1 - Method of microorganism identification

Info

Publication number: RU2054486C1
Authority: RU
Inventors: Валерий Георгиевич Петухов
Original assignee: Валерий Георгиевич Петухов
Priority date: 1992-09-01
Filing date: 1992-09-01
Publication date: 1996-02-20

Abstract

FIELD: microbiology. SUBSTANCE: fluorescence spectra of cellular components of microbe cells were obtained by measuring delayed (or prolonged) fluorescence and phosphorescence at the room temperature rather than conventional ones. EFFECT: improved method of identification. 1 dwg, 1 tbl

Description

Изобретение относится к микробиологии, медицине, пищевой промышленности и может быть использовано для быстрой идентификации микроорганизмов. The invention relates to microbiology, medicine, food industry and can be used for quick identification of microorganisms.

Известны спектры люминесценции, флуоресценции и низкотемпературной (обычно при минус 196^оС) фосфоресценции различных биологических объектов, в том числе микроорганизмов [1, 2, 3] Эти спектры возбуждаются в УФ-области и принадлежат клеточным белкам. Попытки использовать эти спектры для целей различения различных микроорганизмов были неудачны, так как белки имеют одинаковый спектр практически у всех биологических объектов. Попытки же получить спектры флуоресценции других клеточных компонентов микробных клеток были безуспешны из-за сильного маскирующего эффекта мутности этих объектов.Known luminescence spectra of fluorescence and low-temperature (usually at -196 ° ^C) phosphorescence various biological objects, including microorganisms [1, 2, 3] These spectra are excited in the UV region and belong to cellular proteins. Attempts to use these spectra to distinguish between different microorganisms were unsuccessful, since proteins have the same spectrum in almost all biological objects. Attempts to obtain fluorescence spectra of other cellular components of microbial cells were unsuccessful due to the strong masking effect of the turbidity of these objects.

Ближайшим аналогом изобретения является способ дифференциации R-форм холерных вибрионов от L-форм и их ревертантов [4] в котором микробную взвесь облучали ультрафиолетовым светом длиной волны 365 нм и регистрировали интегральную интенсивность обычной флуоресценции. The closest analogue of the invention is a method for differentiating R-forms of cholera vibrios from L-forms and their revertants [4] in which the microbial suspension was irradiated with ultraviolet light at a wavelength of 365 nm and the integrated intensity of ordinary fluorescence was recorded.

В предлагаемом способе измеряются спектры люминесценции микроорганизмов, но не "обычной", а замедленной (или длительной) флуоресценции и фосфоресценции при комнатной температуре. In the proposed method, the luminescence spectra of microorganisms are measured, but not “ordinary”, but delayed (or long-term) fluorescence and phosphorescence at room temperature.

Идентификация по предлагаемому способу осуществляется путем измерения спектров длительной люминесценции (фосфоресценции и замедленной флуоресценции) микроорганизмов при комнатной температуре (или температуре их жизнедеятельности) при возбуждении в видимой и (или) ультрафиолетовой областях спектра и определения положения максимумов интенсивностей длительной люминесценции и их соотношения при различных длинах волн, например в различных максимумах люминесценции внутриклеточных металлопорфиринов и (или) белков и других соединений. Набор таких максимумов и отношений является характерным для тех или иных микроорганизмов. Identification by the proposed method is carried out by measuring the spectra of prolonged luminescence (phosphorescence and delayed fluorescence) of microorganisms at room temperature (or the temperature of their vital activity) upon excitation in the visible and (or) ultraviolet regions of the spectrum and determining the positions of the maxima of the intensities of long-term luminescence and their ratio at various lengths waves, for example, at various luminescence maxima of intracellular metalloporphyrins and (or) proteins and other compounds. A set of such maxima and relationships is characteristic of certain microorganisms.

Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.

Культуру микроорганизмов, выращенную на твердой или жидкой питательной среде, наливают в кювету и помещают в фосфориметрическую установку для измерения спектров длительной люминесценции. Установка состоит из источника возбуждающего света (ультрафиолетовой лампы или лампы накаливания, или лазерного источника в УФ- или видимой области), устройства для выделения соответствующего спектра возбуждающего света (светофильтры или монохроматор), фосфороскопа (устройства для разделения во времени возбуждающего света и света люминесценции со временем порядка 0,01-0,001 с), устройства для разложения люминесценции объекта в спектр (система светофильтров или монохроматор), приемника излучения, например фотоумножителя, устройства для усиления и регистрации фототока и записывающего устройства. A microorganism culture grown on a solid or liquid nutrient medium is poured into a cuvette and placed in a phosphorimetric apparatus for measuring long-term luminescence spectra. The installation consists of a source of exciting light (an ultraviolet lamp or incandescent lamp, or a laser source in the UV or visible region), a device for separating the corresponding spectrum of exciting light (filters or a monochromator), a phosphoroscope (a device for separating time between exciting light and luminescence light with a time of the order of 0.01-0.001 s), a device for decomposing the luminescence of an object into a spectrum (a system of light filters or a monochromator), a radiation receiver, such as a photomultiplier, a device for amplification the filing and recording of the photocurrent and recording device.

Для живых клеток микроорганизмов в среде должен находиться питательный субстрат, например 1%-ная глюкоза; если клетки мало или нежизнеспособны, то из кюветы следует удалить кислород либо путем вакуумной откачки, либо путем продувания через кювету газа, не содержащего кислород, например химически чистого азота. For living cells of microorganisms, the medium must contain a nutrient substrate, for example, 1% glucose; if the cells are small or nonviable, then oxygen should be removed from the cuvette either by vacuum pumping or by blowing through a cuvette a gas that does not contain oxygen, for example, chemically pure nitrogen.

Полученные спектры микроорганизмов имеют несколько максимумов, например при возбуждении в области 250-300 нм имеется максимум около 340 нм, принадлежащий белкам клеток; при возбуждении в области 400-560 нм имеются три максимума около 580 нм, 600 нм и 700 нм, принадлежащие металлопорфиринам клеток (обычно цинк-порфиринам); при возбуждении в области 300-400 нм имеется максимум в области 540-550 нм. Соотношение интенсивностей в этих максимумах для разных микроорганизмов различное, что позволяет их идентифицировать по этим параметрам. The obtained spectra of microorganisms have several maxima, for example, when excited in the region of 250-300 nm, there is a maximum of about 340 nm, which belongs to cell proteins; upon excitation in the region of 400-560 nm, there are three maxima at about 580 nm, 600 nm and 700 nm, which belong to metalloporphyrins of cells (usually zinc-porphyrins); when excited in the region of 300-400 nm, there is a maximum in the region of 540-550 nm. The ratio of intensities at these maxima for different microorganisms is different, which allows them to be identified by these parameters.

На чертеже приведены спектры длительной люминесценции бактерий E. Coli M-17 (кривая А) и М. tuberculosis (кривая Б), при возбуждении видимым светом при комнатной температуре. Ось абсцисс длина волны, нм. Ось ординат интенсивность люминесценции, отн.ед. The drawing shows the spectra of prolonged luminescence of bacteria E. Coli M-17 (curve A) and M. tuberculosis (curve B), when excited by visible light at room temperature. Abscissa axis wavelength, nm. Ordinate axis luminescence intensity, rel.

П р и м е р. Бактерии кишечной палочки Е. Coli штамм М-17 выращивают в чашках Петри на твердой питательной среде мясопептонном агаре Хоттингера в течение 24 ч. По окончании этого времени клетки смывают физиологическим раствором, отмывают от питательной среды центрифугированием при 8 тыс. об/мин в течение 10 мин и ресуспендируют в свежем физиологическом растворе до концентрации 10 млрд./мл с добавлением глюкозы до конечной концентрации 1% Бактерии M. Tuberculosis (БЦЖ) выращивают на соответствующей твердой питательной среде, после выращивания клетки также отмывают и доводят оптическую плотность в кювете с длиной оптического пути 1 см до 10 ед. мутности по Международному стандарту мутности. Суспензии наливают в кювету из поликарбоната и помещают в фосфороскоп. Источником света служит лампа накаливания мощностью 150 Вт. Люминесценцию возбуждают в области 400-550 нм. Спектры длительной люминесценции получают с помощью монохроматора в области 550-750 нм и регистрируют с помощью фотоумножителя типа ФЭУ-79. Полученные спектры замедленной флуоресценции и фосфоресценции представлены на чертеже, результаты измерений представлены в таблице. PRI me R. E. coli Escherichia coli bacteria strain M-17 is grown in Petri dishes on a solid nutrient medium of Hottinger meat and peptone agar for 24 hours. At the end of this time, the cells are washed off with physiological saline, washed from the nutrient medium by centrifugation at 8 thousand rpm for 10 min and resuspended in fresh physiological saline to a concentration of 10 billion / ml with the addition of glucose to a final concentration of 1% M. Tuberculosis bacteria (BCG) are grown on an appropriate solid nutrient medium, the cells are also washed after growth adjusted absorbance in a cell with optical path length of 1 cm to 10 units. turbidity according to the International turbidity standard. Suspensions are poured into a polycarbonate cuvette and placed in a phosphoroscope. The light source is an incandescent lamp with a power of 150 watts. Luminescence is excited in the region of 400-550 nm. Long-term luminescence spectra are obtained using a monochromator in the region of 550-750 nm and recorded using a photomultiplier of the FEU-79 type. The obtained spectra of delayed fluorescence and phosphorescence are presented in the drawing, the measurement results are presented in the table.

Как видно из данных таблицы, спектры замедленной флуоресценции и фосфоресценции при комнатной температуре отличаются по своим параметрам для бактерий E. Coli M-17 и M. tuberculosis, что позволяет их различать. As can be seen from the table, the spectra of delayed fluorescence and phosphorescence at room temperature differ in their parameters for the bacteria E. Coli M-17 and M. tuberculosis, which allows them to be distinguished.

Claims

METHOD FOR IDENTIFICATION OF MICROORGANISMS, including irradiating a microbial suspension with light and then recording their luminescence, characterized in that the microorganisms are irradiated with visible and / or ultraviolet light in the range of 250 - 600 nm, and long-term luminescence spectra (delayed fluorescence at 300 and at room temperature) are recorded - 800 nm, determine the position of the maxima and the ratio of the intensities of this luminescence at various maxima, and microorganisms are identified by the set of these values.