RU2053789C1

RU2053789C1 - Antiproteinase preparation

Info

Publication number: RU2053789C1
Application number: RU93039306A
Authority: RU
Inventors: Татьяна Александровна Валуева; Владимир Николаевич Гапанович; Петр Тимофеевич Петров; Лев Иванович Валуев; Николай Альфредович Платэ; Валерий Минович Царенков; Николай Львович Матвеев; Елена Дмитриевна Расюк
Original assignee: Производственное объединение "Белмедпрепараты; Татьяна Александровна Валуева; Владимир Николаевич Гапанович; Петр Тимофеевич Петров; Лев Иванович Валуев; Николай Альфредович Платэ; Валерий Минович Царенков; Николай Львович Матвеев; Елена Дмитриевна Расюк
Priority date: 1993-08-02
Filing date: 1993-08-02
Publication date: 1996-02-10

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: proposed antiproteinase preparation is based on the protein inhibitor of proteinases showing polyvalence antiproteinase activity with relation to serine pancreatic and leucocyte proteinases. Preparation shows prolonged curative action and does not supress activity of serine proteinases of kallikrein-kinin and coagulating blood systems. The main components of antiproteinase preparation is ovomucoid from duck egg protein. EFFECT: enhanced quality of preparation. 2 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к лечебным антипротеиназным препаратам, и может быть использовано для коррекции состояний, связанных с повышением протеолитической активности в тканях, крови и других биологических жидкостях. The invention relates to medicine, namely to therapeutic antiproteinase drugs, and can be used to correct conditions associated with increased proteolytic activity in tissues, blood and other biological fluids.

Многие тяжелые заболевания сопровождаются активацией процессов протеолиза. Ключевая роль в их запуске принадлежит лейкоцитарным сериновым протеиназам (эластаза, катепсин G), а также панкреатическим протеиназам (трипсин, химотрипсин, эластаза). В связи с этим одним из наиболее эффективных путей коррекции патологических состояний, связанных с гиперактивацией протеолитических ферментов, является селективное подавление их активности. Many serious diseases are accompanied by activation of proteolysis processes. The key role in their launch belongs to leukocyte serine proteinases (elastase, cathepsin G), as well as pancreatic proteinases (trypsin, chymotrypsin, elastase). In this regard, one of the most effective ways to correct pathological conditions associated with hyperactivation of proteolytic enzymes is the selective suppression of their activity.

Известны используемые для этой цели препараты, получаемые из поджелудочной железы крупного рогатого скота -"Тразилол", "Контрикал", "Апротинин", "Тзалол", "Гордокс" и др. [1] Однако, проявляя высокий аффинитет к трипсину и химотрипсину, данные препараты малоэффективны по отношению к другим, наиболее агрессивным при патологии организма, сериновым протеиназам лейкоцитарной и панкреатической эластазе, лейкоцитарному катепсину G. К тому же, лечебное действие антиферментных препаратов, получаемых из поджелудочной железы, вследствие их низкой молекулярной массы и быстрого выведения из организма кратковременно. Known used for this purpose are preparations obtained from the pancreas of cattle - Trazilol, Contrical, Aprotinin, Tzolol, Gordox, etc. [1] However, exhibiting high affinity for trypsin and chymotrypsin, these drugs are ineffective in relation to other serine proteinases of leukocyte and pancreatic elastase, leukocyte cathepsin G, which are the most aggressive in the pathology of the body. Moreover, the therapeutic effect of antienzyme preparations obtained from the pancreas due to their low mole body mass and rapid elimination from the body for a short time.

Наиболее близким (прототип) к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту является антипротеиназный препарат (Контрикал), содержащий белковый ингибитор протеиназ, натрия хлорид и воду для инъекций [2] В качестве ингибитора протеиназ этот препарат содержит основной панкреатический ингибитор трипсина при следующем соотношении компонентов, г/л:
Основной панкре-
атический ингиби- тор трипсина 8,0-15,0 Натрия хлорид 8,5-10,0 Вода для инъекций До 1,0 л
Основной панкреатический ингибитор трипсина обладает высоким сродством к активированным ферментам поджелудочной железы трипсину и химотрипсину, в связи с чем наиболее эффективен при патологии этого органа.The closest (prototype) to the claimed technical essence and the achieved effect is an antiproteinase drug (Contrical) containing a protein inhibitor of proteinases, sodium chloride and water for injection [2] As a proteinase inhibitor, this drug contains the main pancreatic trypsin inhibitor in the following ratio of components, g / l:
Main pancreas
Atopic trypsin inhibitor 8.0-15.0 Sodium chloride 8.5-10.0 Water for injection Up to 1.0 L
The main pancreatic trypsin inhibitor has a high affinity for activated pancreatic enzymes trypsin and chymotrypsin, and therefore it is most effective in the pathology of this organ.

Недостатками известного антипротеиназного препарата являются низкая активность по отношению к другим сериновым протеиназам, прежде всего лейкоцитарным (эластаза, катепсин G), высокая скорость выведения из организма (период полувыведения при внутривенном введении составляет 90 минут), а также способность подавлять активность сериновых протеиназ калликреин-кининовой и свертывающей систем крови, что может вызывать региональные нарушения микроциркуляции. The disadvantages of the known antiproteinase drug are low activity against other serine proteinases, especially leukocyte (elastase, cathepsin G), high excretion rate (elimination half-life with intravenous administration is 90 minutes), and the ability to suppress the activity of kallikrein-kinin serine proteinases and blood coagulation, which can cause regional disturbances in microcirculation.

Задачей изобретения является создание антипротеиназного препарата на основе белкового ингибитора протеиназ, обладающего поливалентной антипротеиназной активностью по отношению к сериновым панкреатическим и лейкоцитарным протеиназам, способностью оказывать пролонгированное лечебное действие и не подавлять активность сериновых протеиназ калликреин-кининовой и свертывающей систем крови. The objective of the invention is the creation of an antiproteinase preparation based on a protein inhibitor of proteinases with polyvalent antiproteinase activity against serine pancreatic and leukocyte proteinases, the ability to have a prolonged therapeutic effect and not inhibit the activity of serine proteinases of kallikrein-kinin and blood coagulation systems.

Достигается это тем, что антипротеиназный препарат, содержащий белковый ингибитор протеиназ, натрия хлорид и воду для инъекций, в качестве белкового ингибитора протеиназ содержит овомукоид из белка утиных яиц при следующем соотношении компонентов, г/л:
Овомукоид из белка утиных яиц 0,5-50,0 Натрия хлорид 8,5-10,0 Вода для инъекций До 1,0 л
Овомукоид из белка утиных яиц получают по методу, описанному [3]
Состав готовят следующим образом.This is achieved by the fact that the antiproteinase preparation containing a protein inhibitor of proteinases, sodium chloride and water for injection, as a protein inhibitor of proteinases contains an ovomcoid from duck egg protein in the following ratio of components, g / l:
Ovomukoid from duck egg protein 0.5-50.0 Sodium chloride 8.5-10.0 Water for injection Up to 1.0 L
Ovomukoid from duck egg protein is obtained according to the method described [3]
The composition is prepared as follows.

П р и м е р 1. 10,0 г полученного в асептических условиях, очищенного ультрафильтрацией и лиофильно высушенного овомукоида из белка утиных яиц растворяют в воде для инъекций, добавляют 9,0 г апирогенного натрия хлорида и доводят объем раствора до 1,0 л водой для инъекций. Раствор фильтруют через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Антипротеиназный препарат готов к употреблению. PRI me R 1. 10.0 g obtained under aseptic conditions, purified by ultrafiltration and freeze-dried ovomukoid from the protein of duck eggs is dissolved in water for injection, add 9.0 g of pyrogen-free sodium chloride and bring the solution volume to 1.0 l water for injection. The solution is filtered through a sterilizing filter with a pore diameter of 0.22 μm. The antiproteinase drug is ready for use.

П р и м е р ы 2-5. Антипротеиназный препарат готовят по примеру 1, используя 0,5 г овомукоида и 8,5 г натрия хлорида; 3,0 г овомукоида и 10,0 г натрия хлорида; 25,0 г овомукоида и 9,0 г натря хлорида; 50,0 г овомукоида и 9,0 г натрия хлорида, соответственно. PRI me R s 2-5. Antiproteinase preparation is prepared according to example 1, using 0.5 g of ovomukoid and 8.5 g of sodium chloride; 3.0 g of ovomucoid and 10.0 g of sodium chloride; 25.0 g of ovomucoid and 9.0 g of sodium chloride; 50.0 g of ovomucoid and 9.0 g of sodium chloride, respectively.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что заявляемый объект отличается химической природой белкового ингибитора протеиназ, то есть заявляемое решение соответствует критерию "новизна". Оно также соответствует критерию "изобретательский уровень", так как среди известных антипротеиназных препаратов отсутствуют вещества, обладающие поливалентной антипротеиназной активностью по отношению к сериновым панкреатическим (трипсин и химотрипсин) и лейкоцитарным (эластаза и катепсин G) протеиназам, а также способностью оказывать пролонгированное лечебное действие. Comparative analysis with the prototype shows that the claimed object is characterized by the chemical nature of the protein proteinase inhibitor, that is, the claimed solution meets the criterion of "novelty." It also meets the criterion of "inventive step", since among the known antiproteinase preparations there are no substances that have polyvalent antiproteinase activity with respect to serine pancreatic (trypsin and chymotrypsin) and leukocyte (elastase and cathepsin G) proteinases, as well as the ability to have a prolonged therapeutic effect.

П р и м е р 6. В опытах на 92 крысах линии Вистар обоего пола весом 200,0 г изучают лечебный эффект антипротеиназного препарата на фоне острого деструктивного панкреатита. Моделирование воспаления поджелудочной железы осуществляют путем введения консервированной медицинской желчи в общий билиопанкреатический проток путем канюляции его через просвет двенадцатиперстной кишки тупой иглой 0,4 мм диаметром. Объем вводимой желчи 0,1 мл на 100 г массы тела. Животных разделяют на контрольную (48 особей) и две опытные серии: для изучения лечебной эффективности заявляемого объекта (22 особи) и препарата сравнения Контрикала (22 особи). Сравниваемые препараты вводят внутривенно однократно, через 2 часа после моделирования острого панкреатита в дозе 10 мг на кг массы тела. В контрольной серии никакого лечения не проводят. PRI me R 6. In the experiments on 92 rats of the Wistar rats of both sexes weighing 200.0 g, the therapeutic effect of the antiproteinase drug against the background of acute destructive pancreatitis is studied. Modeling of inflammation of the pancreas is carried out by introducing canned medical bile into the common biliopancreatic duct by cannulating it through the lumen of the duodenum with a blunt needle 0.4 mm in diameter. The volume of injected bile is 0.1 ml per 100 g of body weight. The animals are divided into a control (48 individuals) and two experimental series: to study the therapeutic efficacy of the claimed object (22 individuals) and the Kontrikal comparison drug (22 individuals). Compared drugs are administered intravenously once, 2 hours after modeling acute pancreatitis at a dose of 10 mg per kg of body weight. In the control series, no treatment is performed.

В динамике развития заболевания осуществляют биохимическое исследование плазмы крови, оценивают показатель летальности животных, изучают морфо-структурные особенности течения патологического процесса в поджелудочной железе. In the dynamics of the development of the disease, a biochemical study of blood plasma is carried out, the mortality rate of animals is assessed, the morphological and structural features of the pathological process in the pancreas are studied.

При выбранной модели панкреонекроза в ткани поджелудочной железы у крыс контрольной серии развивается картина крупноочагового прогрессирующего панкреонекроза с геморрагиями в некротизированных тканях, жировыми некрозами и нагноением. Происходит резкое увеличение протеолитической активности плазмы крови животных, достигающее максимума через 3-4 ч после начала эксперимента, при повторном, еще более выраженном подъеме спустя 1 сутки. Необходимо отметить четкую корреляцию биохимических и гистологических исследований на высоте развития геморрагического компонента некроза и появления стеатонекроза титр амидазной активности (БАПНА) плазмы крови является наивысшим (табл. 1). Прогрессирование патологического процесса в этой серии животных вызывает гибель части из них: летальность через 24 и 48 ч после начала эксперимента составляет 45,8% (22 особи) и 77,1% (37 особей) соответственно. With the selected model of pancreatic necrosis in pancreatic tissue in rats of the control series, a picture of large-focal progressive pancreatic necrosis with hemorrhages in necrotic tissues, fatty necrosis and suppuration develops. There is a sharp increase in the proteolytic activity of animal blood plasma, reaching a maximum 3-4 hours after the start of the experiment, with a second, even more pronounced rise after 1 day. It should be noted that there is a clear correlation between biochemical and histological studies at the height of the hemorrhagic component of necrosis and the appearance of steatonecrosis, the titer of amidase activity (ALNA) of blood plasma is the highest (Table 1). The progression of the pathological process in this series of animals causes the death of some of them: mortality 24 and 48 hours after the start of the experiment is 45.8% (22 individuals) and 77.1% (37 individuals), respectively.

Гистологические исследования тканей поджелудочной железы в серии животных с внутривенным введением заявляемого антипротеиназного препарата показывают, что уже через 1 ч в поджелудочной железе регрессируют явления интерстициального отека, гемореологические нарушения, дистрофические и некробиотические изменения ацинарных клеток. В этот же период отмечается значительное, более чем в 30 раз по отношению к аналогичному периоду у животных контрольной серии, и более чем в 15 раз к исходным данным снижение суммарной протеолитической активности плазмы крови крыс. Через 4 и 22 ч после инъекции заявляемого антипротеиназного препарата его ингибирующее действие на амидазные системы крови сохраняется, причем уровень протеолитической активности в эти временные интервалы не превышает начальные величины. Histological studies of pancreatic tissue in a series of animals with intravenous administration of the inventive antiproteinase drug show that within 1 hour the phenomena of interstitial edema, hemorheological disorders, dystrophic and necrobiotic changes in acinar cells regress in the pancreas. In the same period, a significant decrease of the total proteolytic activity of rat blood plasma by more than 30 times with respect to the same period in animals of the control series was noted, and more than 15 times with the initial data. 4 and 22 hours after injection of the inventive antiproteinase drug, its inhibitory effect on blood amidase systems is maintained, and the level of proteolytic activity in these time intervals does not exceed the initial values.

По гистологическим данным через 22 часа после введения заявляемого объекта отсутствуют признаки прогрессирования некроза и гемореологических нарушений в системах макро- и микроциркуляторного русла. Вокруг очагов воспаления возникает четкая воспалительная демаркация. Снижение интерстициального отека, отсутствие дистрофических изменений ацинарных клеток в оставшихся жизнеспособных дольках приводит к восстановлению эксфузии зимогенов в просвет протоков, предотвращая тем самым парапедез их в интерстиций и поступление в кровеносные и лимфатические сосуды. Лечение заявляемым объектом тормозит прогрессирование дистрофических и некробиотических изменений ацинарных клеток и способствует, тем самым уменьшению масштабов поражения. Под влиянием проведенного лечения прекращается не только распространение гемореологических нарушений, но и восстанавливается, после лизиса или реканализации тромбов, кровоток в первично поврежденных артериях и венах. Большинство животных этой серии выживает. Летальность через 24 ч составляет 13,6% (3 особи), через 48-22,7% (5 особей) соответственно. According to histological data, 22 hours after the introduction of the claimed object, there are no signs of progression of necrosis and hemorheological disorders in the systems of macro- and microvasculature. Around the foci of inflammation there is a clear inflammatory demarcation. Reducing interstitial edema, the absence of dystrophic changes in acinar cells in the remaining viable lobules leads to the restoration of exogenous zymogens into the lumen of the ducts, thereby preventing their parapedesis into the interstitium and into the blood and lymph vessels. The treatment of the claimed object inhibits the progression of dystrophic and necrobiotic changes in acinar cells and contributes, thereby reducing the extent of the lesion. Under the influence of the treatment, not only the spread of hemorheological disorders ceases, but also, after lysis or recanalization of blood clots, blood flow is restored in the initially damaged arteries and veins. Most animals in this series survive. Mortality after 24 hours is 13.6% (3 individuals), after 48-22.7% (5 individuals), respectively.

Во второй опытной серии экспериментов лечение панкреонекроза проводят внутривенным введением препарата сравнения Контрикала. По сравнению с крысами, леченными заявляемым объектом, через 1 ч после инфузии Контрикала отмечается более значительный уровень суммарной протеолитической активности плазмы крови (табл.1). Тем не менее введение препарата сравнения способствует существенному (р<0,05) снижению амидазной активности относительно сопоставимого срока в контроле. Гистологические различия между опытными сериями в этот временной интервал не проявляются. Однако спустя 4 ч после инъекции Контрикала протеолитическая активность плазмы достигает соответствующих значений в контрольной серии, более чем в 2 раза превышая таковую у животных с введением заявляемого объекта. Гистологически в этот период наблюдается картина обострения патологического процесса в поджелудочной железе с элементами повторных геморрагий, усугубление дистрофических и некробиотических изменений ацинарных клеток, увеличение зон с гемореологическими расстройствами. В дальнейшем через 22 ч после коррекции панкреонекроза инфузиями Контрикала уровень протеолитической активности еще более возрастает, статистически достоверно отличаясь не только от исходных значений, но и от показателей сравниваемой опытной группы (табл.1). Тем не менее анализ динамики изменений общей амидазной активности плазмы равно как и морфо-функциональных перестроек в паренхиме поджелудочной железы свидетельствует о том, что введение Контрикала также способствует торможению развития патологического процесса в органе, хотя выраженность этого лечебного эффекта значительно ниже в сравнении с заявляемым объектом, а способность ингибировать активные формы сериновых протеиназ краткосрочно, проявляется лишь в течение 1-2 ч после инфузии. Инъекции заявляемого объекта напротив способствуют стабильному удержанию уровня суммарной амидазной активности плазмы животных с экспериментальным панкреонекрозом в границах физиологической нормы практически в течение 22 ч после введения, обеспечивая тем самым мобилизацию компенсаторно-приспособительных репаративных и пролиферативных механизмов. Летальность при лечении Контрикалом через 24 ч составляет 22,7% (5 особей), через 48 54,5% (12 особей) соответственно. In the second experimental series of experiments, the treatment of pancreatic necrosis is carried out by intravenous administration of the drug Contrikal comparison. Compared with rats treated with the claimed object, 1 hour after the infusion of Contrikal, a more significant level of the total proteolytic activity of blood plasma is noted (Table 1). Nevertheless, the introduction of a comparison drug contributes to a significant (p <0.05) decrease in amidase activity relative to a comparable period in the control. Histological differences between the experimental series in this time interval do not appear. However, 4 hours after the injection of Contrical, the proteolytic activity of the plasma reaches the corresponding values in the control series, more than 2 times higher than that in animals with the introduction of the claimed object. Histologically during this period, there is a picture of an exacerbation of the pathological process in the pancreas with elements of repeated hemorrhages, aggravation of dystrophic and necrobiotic changes in acinar cells, an increase in zones with hemorheological disorders. Later, 22 hours after correction of pancreatic necrosis with Contrical infusions, the level of proteolytic activity increases even more, statistically significantly differing not only from the initial values, but also from the indices of the compared experimental group (Table 1). Nevertheless, an analysis of the dynamics of changes in the total plasma amidase activity as well as morpho-functional rearrangements in the pancreatic parenchyma suggests that the administration of Contrical also contributes to the inhibition of the development of the pathological process in the organ, although the severity of this therapeutic effect is significantly lower in comparison with the claimed object, and the ability to inhibit the active forms of serine proteinases in the short term, manifests itself only within 1-2 hours after infusion. Injections of the claimed object, on the contrary, contribute to the stable retention of the level of total amidase activity of the plasma of animals with experimental pancreatic necrosis within the physiological norm almost within 22 hours after administration, thereby ensuring the mobilization of compensatory-adaptive reparative and proliferative mechanisms. Mortality after treatment with Contrikal after 24 hours is 22.7% (5 individuals), after 48 54.5% (12 individuals), respectively.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой лечебной антипротеиназной активности заявляемого антипротеиназного препарата, его способности длительно (пролонгировано) ингибировать активные формы сериновых протеиназ, что можно отнести за счет особенностей химической структуры входящего в состав препарата овомукоида из белка утиных яиц. The results indicate a high therapeutic antiproteinase activity of the inventive antiproteinase drug, its ability to inhibit the active forms of serine proteinases for a long time (prolonged), which can be attributed to the chemical structure of the ovomukoid protein from duck eggs.

П р и м е р 7. Для определения антипротеиназной активности заявляемого объекта, препарат, содержащий 9,0 г/л натрия хлорида и 10,0 г/л, овомукоида разводят 0,1 М трис-НСl буфером, рН 8,0, содержащем 0,02 М СаСl₂, до концентрации овомукоида 0,46х10^-9 моль в 1 мл, 0,5 мл полученного раствора (содержание овомукоида 0,23х10^-9 моль) добавляют к 0,5 мл раствора трипсина в том же буфере (содержание трипсина 0,46х10^-9 моль) и инкубируют в течение 5 мин при 37^оС. Для определения остаточной активности фермента к инкубационной смеси добавляют 3,5 мл раствора п-нитроанилида N,α-бензоил-D,L-аргинина (0,75х10^-3 М) в том же буфере. Реакцию останавливают через 10 минут добавлением 0,5 мл 30%-ного раствора уксусной кислоты и измеряют плотность раствора при 410 нм. Контрольный эксперимент проводят по аналогичной методике в отсутствии овомукоида. Остаточную активность фермента рассчитывают путем деления оптической плотности пробы на оптическую плотность контроля и выражают в процентах.PRI me R 7. To determine the antiproteinase activity of the claimed object, a preparation containing 9.0 g / l sodium chloride and 10.0 g / l, ovomukoid diluted with 0.1 M Tris-Hcl buffer, pH 8.0, containing 0.02 M CaCl ₂ , to an ovomucoid concentration of 0.46x10 ^-9 mol in 1 ml, 0.5 ml of the resulting solution (ovomukoid content of 0.23x10 ^-9 mol) is added to 0.5 ml of trypsin solution in the same buffer ( trypsin content 0,46h10 ^-9 mol) and incubated for 5 min at 37 ^° C to determine residual activity of the enzyme to the incubation mixture was added 3.5 ml of a solution of p-nitroanilide N, α-benzo il-D, L-arginine (0.75x10 ^-3 M) in the same buffer. The reaction is stopped after 10 minutes by adding 0.5 ml of a 30% acetic acid solution and the density of the solution is measured at 410 nm. The control experiment is carried out by a similar technique in the absence of an ovomukoid. The residual activity of the enzyme is calculated by dividing the optical density of the sample by the optical density of the control and expressed as a percentage.

Результаты измерения приведены в табл.2. The measurement results are given in table.2.

П р и м е р ы 8-12. Эксперимент проводят по примеру 7, используя препараты, содержащие 0,5 г/л овомукоида и 8,5 г/л натрия хлорида; 3,0 г/л овомукоида и 10,0 г/л натрия хлорида; 25,0 г/л овомукоида и 9,0 г/л натрия хлорида; 50,0 г/л овомукоида и 9,0 г/л натрия хлорида; 0,9 г/л овомукоида и 9,0 г/л натрия хлорида соответственно. PRI me R s 8-12. The experiment is carried out as in example 7, using preparations containing 0.5 g / l of ovomukoid and 8.5 g / l of sodium chloride; 3.0 g / l ovomucoid and 10.0 g / l sodium chloride; 25.0 g / l ovomukoid and 9.0 g / l sodium chloride; 50.0 g / l ovomukoid and 9.0 g / l sodium chloride; 0.9 g / l of ovomukoid and 9.0 g / l of sodium chloride, respectively.

П р и м е р ы 13-14. (Контроль, по прототипу). Эксперимент проводят по примеру 7, используя препарат Контрикал. PRI me R s 13-14. (Control, prototype). The experiment is carried out as in example 7, using the drug Contrical.

П р и м е р ы 15-24. Эксперимент проводят по примеру 7. Используемые ферменты, белковые ингибиторы протеиназ, субстраты для определения активности, а также результаты измерения активности приведены в табл.2. PRI me R s 15-24. The experiment is carried out as in example 7. The enzymes used, protein proteinase inhibitors, substrates for determining activity, as well as the results of measuring activity are shown in table 2.

Claims

ANTIPROTEINASE PRODUCT based on a proteinase inhibitor of protein nature, sodium chloride and water for injection, characterized in that it contains an ovomukoid from duck egg protein in the following ratio of components, g / l:
Ovomukoid from duck egg protein - 0.5 - 50.0
Sodium chloride - 8.5 - 10.0
Water for injection - Up to 1 L