RU2051688C1

RU2051688C1 - Method of antibody assay to individual human retroviral proteins

Info

Publication number: RU2051688C1
Authority: RU
Inventors: А.М. Расули; Н.Н. Клепиков; С.М. Андреев; Д.В. Мещерякова
Original assignee: Научно-производственный кооператив "Биолам" Онкологического научного центра РАМН
Priority date: 1992-07-29
Filing date: 1992-07-29
Publication date: 1996-01-10

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: the source of antigenic component of immunodiagnostic test-system: set of certain synthetic peptides which are immobilized separately corresponding to different antigenic determinants of certain diagnostically important proteins of human retroviruses involving synthetic peptides of proteins encoded by gene env. EFFECT: enhanced diagnostic sensitivity, decreased cost. 7 cl, 4 tbl

Description

Изобретение относится к иммунной биотехнологии и лабораторной диагностике и может быть применено при конструировании диагностических тест-систем, предназначенных для определения антител к индивидуальным белкам ретровирусов человека. The invention relates to immune biotechnology and laboratory diagnostics and can be used in the construction of diagnostic test systems designed to determine antibodies to individual proteins of human retroviruses.

Лабораторная диагностика инфекций, вызываемых ретровирусами человека (Т-лимфотропным вирусом человека I типа (НТLV-I), Т-лимфотропным вирусом человека II типа (НТLV-II), вирусом иммунодефицита человека 1 типа (НIV-1) и вирусом иммунодефицита человека 2 типа (НIV-2) основывается на использовании различных подходов, среди которых превалируют методы серологической иммунодиагностики. Laboratory diagnosis of infections caused by human retroviruses (human T-lymphotropic virus type I (HTLV-I), human T-lymphotropic virus type II (HTLV-II), human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) is based on the use of various approaches, among which the methods of serological immunodiagnostics prevail.

В соответствии официальными и международно принятыми рекомендациями, серологическое тестирование на наличие антител к ретровирусам человека НТLV-I, НТLV-II, HIV-1 и HIV-2 включает двухэтапную процедуру. На первом этапе проводится обследование образцов крови с использованием скринирующих тест-систем, предназначенных для суммарного обнаружения специфических антител. На втором этапе обследования выявленные при скрининге позитивные образцы подвергают подтверждающему контролю, заключающемуся в комплексной интерпретации "спектрального" состава антител к индивидуальным вирусным белкам. Для этой цели в настоящее время используют тест-системы белкового иммуноблоттинга (ИБ) и радиоиммунопреципитационного анализа (РИПА). In accordance with official and internationally accepted recommendations, serological testing for antibodies to human retroviruses HTLV-I, HTLV-II, HIV-1 and HIV-2 involves a two-step procedure. At the first stage, blood samples are examined using screening test systems designed for the total detection of specific antibodies. At the second stage of the examination, positive samples revealed during screening are subjected to confirmatory control, which consists in a comprehensive interpretation of the "spectral" composition of antibodies to individual viral proteins. For this purpose, protein immunoblotting (IB) and radioimmunoprecipitation analysis (RIPA) test systems are currently used.

В 1990 г. ВОЗ опубликованы новые критерии для интерпретации результатов тестов, подтверждающих серопозитивность по антителам к ретровирусам человека (World Health Organization. Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). Proposed WHO criteria for interpreting results from Western blot assays for HIV-1, HIV-2, and HTLV-1/HTLV-II // Weekly Epidem. Rec. 1990, vol.65, p. 281-283). Согласно новым пересмотренным критериям, образец сыворотки или плазмы крови является положительным по антителам к:
НТLV-I/НТLV-II, если он демонстрирует иммунореактивность, по меньшей мере с одним белковым продуктом гена env (предшественником gp62/68 или надмембранным гликопротеином gp46/gp46) и одним белковым продуктом гена gag (кор-белком р24/р24 или матрикс-белком р19/р21);
НIV-1/HIV-2, если он демонстрирует иммунореактивность, по-меньшей мере, с двумя белковыми продуктами гена env (предшественником gp160/gp140, надмембранным гликопротеином gp120/gp125 или трансмембранным гликопротеином gp41/gp36).In 1990, WHO published new criteria for interpreting results from Western blot assays for HIV-1, HIV-2, for the interpretation of test results confirming seropositivity for antibodies to human retroviruses (World Health Organization. Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). , and HTLV-1 / HTLV-II // Weekly Epidem. Rec. 1990, vol. 65, p. 281-283). According to the new revised criteria, a serum or plasma sample is positive for antibodies to:
HTLV-I / HTLV-II, if it demonstrates immunoreactivity, with at least one protein product of the env gene (precursor gp62 / 68 or supmembrane glycoprotein gp46 / gp46) and one protein product of the gag gene (core protein p24 / p24 or matrix- protein p19 / p21);
HIV-1 / HIV-2, if it demonstrates immunoreactivity with at least two protein products of the env gene (gp160 / gp140 precursor, gp120 / gp125 supmembrane glycoprotein or gp41 / gp36 transmembrane glycoprotein).

Образец сыворотки или плазмы крови является отрицательным по антителам к ретровирусам при отсутствии реактивности с ретровирус-специфическими белками. Образец сыворотки или плазмы крови является неопределенным по антителам к ретровирусам при реактивности, не рассматриваемой как положительная или отрицательная. A serum or plasma sample is negative for antibodies to retroviruses in the absence of reactivity with retrovirus-specific proteins. A serum or plasma sample is undefined for antibodies to retroviruses with reactivity not considered positive or negative.

При оценке диагностических показателей подтверждающих тест-систем ИБ установлено, что при применении данного метода эффективно выявляются антитела направленные к белкам, кодируемым геном gag и с меньшей чувствительностью обнаруживаются антитела к env-белкам ретровирусов (Т.М.Hartley et al.//J. Clin. Microbiol. 1990, vol. 28, p. 646-650). Кроме того, культивирование ретровирусов в продуцирующих клетках является инфекционно опасным, дорогостоящим и трудоемким, а получение вирусного лизата не обеспечивает стандартности антигенов. When evaluating the diagnostic parameters of IB confirmation test systems, it was found that using this method, antibodies directed to the proteins encoded by the gag gene are detected efficiently and antibodies to retrovirus env proteins are detected with less sensitivity (T.M. Hartley et al.//J. Clin. Microbiol. 1990, vol. 28, p. 646-650). In addition, the cultivation of retroviruses in producing cells is infectious, expensive and time-consuming, and the production of a viral lysate does not ensure the standardization of antigens.

Перечисленные недостатки определения антител к индивидуальным ретровирусным белкам в ИБ на основе вирусных антигенов могут быть преодолены созданием антигенов искусственного происхождения пептидов, синтезированных химическими способами. Известно, что синтетические пептиды, соответствующие аминокислотной последовательности антигенов вирусных белков, могут быть использованы для выявления противовирусных антител (Применение синтетических антигенов для диагностики инфекционных болезней / Доклад Научной группы ВОЗ. Женева: 1991, с. 75). Синтетические пептиды обеспечивают инфекционную безопасность как при производстве, так и при применении; высокую диагностическую чувствительность, специфичность и стандартность в результате доступности структуры для контроля; стабильность неопределено долгое время; низкую себестоимость антигенного компонента. The listed disadvantages of determining antibodies to individual retroviral proteins in information technology based on viral antigens can be overcome by creating artificial antigens of peptides synthesized by chemical methods. It is known that synthetic peptides corresponding to the amino acid sequence of viral protein antigens can be used to detect antiviral antibodies (Use of synthetic antigens for the diagnosis of infectious diseases / Report of the WHO Scientific Group. Geneva: 1991, p. 75). Synthetic peptides provide infectious safety both in production and in use; high diagnostic sensitivity, specificity and standardity as a result of the availability of the structure for control; stability indefinitely for a long time; low cost of antigenic component.

Использование для определения антител к индивидуальным белкам ретровирусов человека иммунореактивных синтетических пептидов из белков, рекомендуемых для подтверждения серопозитивности, может представить эффективную альтернативу методам ИБ и РИПА на основе вирусных антигенов. The use of immunoreactive synthetic peptides from proteins recommended for confirmation of seropositivity for the determination of antibodies to individual proteins of human retroviruses can provide an effective alternative to the methods of IB and RIPA based on viral antigens.

Наиболее близким аналогом изобретения является способ определения антител к индивидуальным белкам в иммуноблоттинге, основанном на использовании вирусных белков НIV-1, иммобилизованных на нитроцеллюлозную мембрану (Huisman J. G. Immunoblotting: an amerging technique in immunohematology // Vox Sang. 1986, vol.59, p. 129-136). The closest analogue of the invention is a method for determining antibodies to individual proteins in immunoblotting, based on the use of viral proteins HIV-1, immobilized on a nitrocellulose membrane (Huisman JG Immunoblotting: an amerging technique in immunohematology // Vox Sang. 1986, vol. 59, p. 129-136).

Целью изобретения является повышение эффективности и удешевление способа. The aim of the invention is to increase the efficiency and cost of the method.

Технический результат выражается в повышении диагностической чувствительности иммунодиагностических тест-систем (определяющих антитела к индивидуальным белкам ретровирусов человека) к антителам, направленным к ретровирусным белкам, кодируемым геном env, а также в снижении стоимости антигенного компонента тест-систем. Технический результат достигается тем, что в качестве антигенного компонента иммунодиагностических тест-систем используют набор из нескольких, иммобилизованных по отдельности, синтетических пептидов, соответствующих разным антигенным детерминантам нескольких диагностически значимых белков ретровирусов человека, включая синтетические пептиды белков, кодируемых геном env. Это позволяет проводить комплексную оценку реактивности исследуемых образцов биологической жидкости с индивидуальными синтетическими пептидами белков ретровирусов человека, в том числе с синтетическими пептидами белков, кодируемых геном env. Таким образом, происходит индивидуальное определение антител ко всем, необходимым для подтверждения противоретровирусной серопозитивности, ретровирусным белкам. The technical result is expressed in an increase in the diagnostic sensitivity of immunodiagnostic test systems (detecting antibodies to individual proteins of human retroviruses) to antibodies directed to retroviral proteins encoded by the env gene, as well as in a decrease in the cost of the antigenic component of test systems. The technical result is achieved in that a set of several individually immobilized synthetic peptides corresponding to different antigenic determinants of several diagnostically significant human retroviral proteins, including synthetic protein peptides encoded by the env gene, is used as an antigenic component of immunodiagnostic test systems. This allows a comprehensive assessment of the reactivity of the studied samples of biological fluid with individual synthetic peptides of human retrovirus proteins, including synthetic peptides of proteins encoded by the env gene. Thus, an individual determination of antibodies to all retroviral proteins necessary to confirm antiretroviral seropositivity occurs.

Отличительным от наиболее близкого аналога признаком являются использование в иммунодиагностических тест-системах для определения антител к индивидуальным белкам ретровирусов человека в качестве антигенов синтетических пептидов белков ретровирусов человека. A distinctive feature from the closest analogue is the use in immunodiagnostic test systems for determining antibodies to individual proteins of human retroviruses as antigens of synthetic peptides of proteins of human retroviruses.

Предпочтительным является использование в иммунодиагностических тест-системах (ИБ, РИПА, иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ, реакции агглютинации и др.) для определения антител к индивидуальным белкам ретровирусов человека в качестве антигенов синтетических пептидов белков ретровирусов человека, в диапазоне концентраций при иммобилизации от 0,001 мкг/мл до 1000 мкг/мл. It is preferable to use in immunodiagnostic test systems (IB, RIPA, enzyme-linked immunosorbent assay, radioimmunoassay, agglutination reactions, etc.) to determine antibodies to individual human retroviruses as antigens of synthetic peptides of human retroviruses proteins, in a concentration range from immobilization from 0.001 μg / ml to 1000 mcg / ml.

Более предпочтительным является использование в твердофазной иммуноферментной (ИФА) тест-системе для определения антител к индивидуальным белкам ретровирусов человека в качестве антигенов синтетических пептидов (в диапазоне концентраций при иммобилизации от 0,1 мкг/мл до 100 мкг/мл) ретровирусных белков gp46 env НТLV-I, p24 gag НТLV-I, p19 gag НТLV-I, gp46 env НТLV-II, p24 gag НТLV-II, p21 gag НТLV-II, gp120 env HIV-1, gp41 env HIV-1, gp125 env HIV-2, gp36 env HIV-2, наличие антител к которым является необходимым для подтверждения противоретровирусной серопозитивности. It is more preferable to use in the solid phase enzyme-linked immunosorbent (ELISA) test system for determining antibodies to individual proteins of human retroviruses as antigens of synthetic peptides (in the concentration range during immobilization from 0.1 μg / ml to 100 μg / ml) retroviral proteins gp46 env HTLV -I, p24 gag НТLV-I, p19 gag НТLV-I, gp46 env НТLV-II, p24 gag НТLV-II, p21 gag НТLV-II, gp120 env HIV-1, gp41 env HIV-1, gp125 env HIV-2 , gp36 env HIV-2, the presence of antibodies to which is necessary to confirm antiretroviral seropositivity.

П р и м е р 1. При конструировании диагностической ИФА тест-системы, предназначенной для определения антител к индивидуальным белкам НIV-1, в качестве антигенного компонента применяют набор из четырех, иммобилизованных по отдельности в разные лунки планшета, синтетических пептидов, обладающих специфичностью антигенных детерминант белков р24 gag, gp120 env и gp41 env HIV-1 (формулы и принадлежность пептидов приведены в табл. 1). EXAMPLE 1. When constructing a diagnostic ELISA test system designed to determine antibodies to individual HIV-1 proteins, a set of four synthetic peptides immobilized individually into different wells of an antigen specificity are used as an antigen component the determinant of p24 gag, gp120 env and gp41 env HIV-1 proteins (the formulas and peptides are listed in Table 1).

По результатам испытания контрольных сывороток, содержащих и не содержащих антитела к НIV-1, проводят сравнение диагностической чувствительности тест-систем:
а) предлагаемого ИФА с использованием синтетических пептидов белков НIV-1;
б) ранее известного коммерческого ИБ фирмы Du Pont "HIV Western Blot" с использованием вирусных белков.According to the test results of control sera containing and not containing antibodies to HIV-1, the diagnostic sensitivity of the test systems is compared:
a) the proposed ELISA using synthetic peptides of proteins HIV-1;
b) previously known commercial information security company Du Pont "HIV Western Blot" using viral proteins.

Испытание сывороток в ИФА проводят по следующей схеме. The test of sera in ELISA is carried out as follows.

Пептиды синтезируют твердофазным методом по стандартной методике (Andreev S.M. et al. // Biomed. Sci. 1991. vol.2. p. 271-278). Peptides are synthesized by the solid phase method according to the standard method (Andreev S.M. et al. // Biomed. Sci. 1991. vol.2. P. 271-278).

Пептиды формулы (I), (II), (III) и (IV) сорбируют по отдельности по 100 мкл в лунки 96-луночного полистиролового планшета "Greiner" (Германия) в концентрациях по 20 мкг/мл в 0,01 М карбонатном буфере (рН 9,6) в течение 12-16 ч при 4^оС. По истечении указанного времени сорбции пептидов, лунки планшета четырехкратно отмывают 0,01 М фосфатносолевым буфером, содержащим 0,05% Твина-20 (ФСБ-Т).Peptides of formulas (I), (II), (III) and (IV) adsorb individually 100 μl per well of a 96-well Greiner polystyrene plate (Germany) at 20 μg / ml concentrations in 0.01 M carbonate buffer (pH 9.6) for 12-16 hours at 4 ° ^C. at the end of said peptide sorption time, the wells were washed four times with 0.01 M fosfatnosolevym buffer containing 0.05% Tween-20 (PBS-T).

Свободные сайты твердой фазы забивают путем сорбции 3%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в ФСБ-Т по 100 мкл в лунку при 37^оС в течение 1 ч, после чего лунки двукратно отмывают раствором ФСБ-Т.The free sites of the solid phase sacrificed by sorption of a 3% solution of bovine serum albumin (BSA) in 100 l of PBS-T per well at ³⁷ ° C for 1 hour, after which the wells were washed twice with a solution of PBS-T.

Сыворотки в разведении 1:20 в ФСБ-Т, содержащем 0,5% БСА, вносят по 100 мкл в лунки планшета с иммобилизованными пептидами и инкубируют при 37^оС 0,5 ч, после чего лунки четырехкратно отмывают раствором ФСБ-Т.Serum at a dilution of 1:20 in PBS-T containing 0.5% BSA Pipette 100 ul in the wells with the immobilized peptides and incubated at ³⁷ ° C for 0.5 hours, after which wells were washed four times with a solution of PBS-T.

В лунки вносят по 100 мкл протеина А St. aureus в рабочем разведении в ФСБ-Т, содержащем 0,5% БСА, и инкубируют 0,5 ч при 37^оС, после чего лунки четырехкратно отмывают ФСБ-Т.100 μl St. Protein A is added to the wells. aureus in the working dilution in PBS-T containing 0.5% BSA, and incubated for 0.5 hours at ³⁷ ° C, after which wells were washed four times PBS-T.

В лунки вносят по 100 мкл хромогенного энзим-субстрата, содержащего 0,032% ортофенилендиамина в 0,1 М цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0) и 0,012% Н₂О₂, и инкубируют 10 мин в темноте при комнатной температуре. Ферментативную реакцию останавливают добавлением в каждую лунку по 50 мкл 3 М раствора Н₂SO₄.100 μl of a chromogenic enzyme substrate containing 0.032% orthophenylenediamine in 0.1 M citrate-phosphate buffer (pH 5.0) and 0.012% H ₂ O ₂ are added to the wells and incubated for 10 minutes in the dark at room temperature. The enzymatic reaction is stopped by adding to each well of 50 μl of a 3 M solution of H ₂ SO ₄ .

Величину экстинкции определяют с помощью фотометра при длине волны 492 нм. The magnitude of the extinction is determined using a photometer at a wavelength of 492 nm.

Интерпретацию результатов осуществляют следующим образом. The interpretation of the results is as follows.

Вычисляют величину контрольного уровня (КY) по формуле КY Mx2, где М среднее значение экстинкции, полученное при испытании контрольных сывороток, не содержащих антитела к вирусу НIV-1. Результат испытания считают положительным, если уровень экстинкции, полученный для испытуемого образца, находится в пределах +/-5% КY (результат "+/-) или более, чем на 5% превышает KY (результат "+", "++", "+++"). Результат испытания считают отрицательным, если уровень экстинкции, полученный для испытуемого образца, более, чем на 5% ниже КY (результат "-"). The value of the control level (KY) is calculated by the formula KY Mx2, where M is the average value of extinction obtained when testing control sera that do not contain antibodies to the HIV-1 virus. The test result is considered positive if the extinction level obtained for the test sample is within +/- 5% KY (result "+/-) or more than 5% exceeds KY (result" + "," ++ ", "+++"). The test result is considered negative if the extinction level obtained for the test sample is more than 5% lower than KY (the result is "-").

Испытание сывороток в коммерческом ИБ фирмы Du Pont проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации тест-системы. The test of sera in a commercial information security company Du Pont is carried out in accordance with the instruction manual for the test system.

Результаты испытания контрольных сывороток, содержащих антитела к вирусу НIV-1, представлены в табл. 2. The test results of control sera containing antibodies to the virus HIV-1 are presented in table. 2.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что в предлагаемой пептидной тест-системе ИФА для всех контрольных положительных сывороток, заведомо содержащих антитела к НIV-1, была установлена иммунореактивность с синтетическими пептидами, по меньшей мере двух белковых продуктов гена env НIV-1 gp120 и gp41, что отвечает официальным критериям подтвержденной анти-НIV-1 серопозитивности. Диагностическая чувствительность предлагаемого пептидного ИФА к антителам против белков НIV-1, кодируемых геном env, превысила этот показатель для сравниваемого ИБ, который в ряде сывороток не определял антитела к gp120 и gp41 env. The presented results indicate that in the proposed peptide ELISA test system for all control positive sera that obviously contain antibodies to HIV-1, immunoreactivity with synthetic peptides of at least two protein products of the env HIV-1 gene gp120 and gp41 was established. which meets the official criteria for confirmed anti-HIV-1 seropositivity. The diagnostic sensitivity of the proposed peptide ELISA to antibodies against HIV-1 proteins encoded by the env gene exceeded that for the compared IB, which in a number of sera did not detect antibodies to gp120 and gp41 env.

П р и м е р 2. При конструировании диагностической ИФА тест-системы, предназначенной для определения антител к индивидуальным белкам НТLV-I, в качестве антигенного компонента применяют набор из трех, иммобилизованных по отдельности в разные лунки планшета, синтетических пептидов, обладающих специфичностью антигенных детерминант белков р19 gag, gp46 env и gp21 env НТLV-I (формулы, принадлежность и концентрации пептидов при сорбции приведены в табл. 3). PRI me R 2. When constructing a diagnostic ELISA test system designed to determine antibodies to individual HTLV-I proteins, a set of three synthetic peptides immobilized individually into different wells of the antigen specificity are used as antigenic component determinant of p19 gag, gp46 env and gp21 env HTLV-I proteins (formulas, affiliation and concentration of peptides during sorption are given in Table 3).

По результатам испытания контрольных сывороток, содержащих и не содержащих антитела к НТLV-I, проводят сравнение диагностической чувствительности тест-систем:
а) предлагаемого ИФА с использованием синтетических пептидов белков НТLV-I;
б) ранее известного ИБ с использованием вирусных белков из лизата НТLV-I-продуцирующих клеток МТ-2 и С91/РL.According to the test results of control sera containing and not containing antibodies to HTLV-I, the diagnostic sensitivity of the test systems is compared:
a) the proposed ELISA using synthetic peptides of proteins HTLV-I;
b) previously known IB using viral proteins from the lysate of HTLV-I-producing cells MT-2 and C91 / PL.

Испытание сывороток в ИФА и интерпретацию результатов проводят аналогично примеру 1. The test of sera in ELISA and interpretation of the results is carried out analogously to example 1.

Реакцию ИБ проводят следующим образом. На слоты 0,5 см полиакриламидного геля толщиной в 1 мм наслаивают количество лизата эквивалентное 10-15 мкг белка. Электрофорез с последующим электропереносом проводят по стандартной методике (М.Sauter, Mueller-Lantzsch // Virus Res. 1987, vol.8, p.141-152.). Для детекции белковых полос в ИБ используют компоненты фирмы "Dakopatts", а в качестве блокировочного раствора 10% сухое обезжиренное молоко в фосфатном буфере (ФБ). Сыворотки считают позитивными, если они дают специфические полосы с лизатами клеток МТ-2 и С91/РL, соответствующие структурным вирусным белкам НТLV-I, и не дают соответствующих полос с лизатами негативных клеток МОLT-4. The IB reaction is carried out as follows. On the slots of 0.5 cm polyacrylamide gel 1 mm thick layered amount of lysate equivalent to 10-15 μg of protein. Electrophoresis followed by electrotransfer is carried out according to a standard method (M. Sauter, Mueller-Lantzsch // Virus Res. 1987, vol. 8, p. 141-152.). For the detection of protein bands in information technology, Dakopatts company components are used, and 10% skimmed milk powder in phosphate buffer (FB) as a blocking solution. Sera are considered positive if they give specific bands with lysates of MT-2 and C91 / PL cells corresponding to the structural viral proteins of HTLV-I and do not give corresponding bands with lysates of negative MOLT-4 cells.

Результаты испытания контрольных сывороток, содержащих и не содержащих антитела к вирусу НТLV-I, представлены в табл. 4. The test results of control sera containing and not containing antibodies to the virus HTLV-I, are presented in table. 4.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в предлагаемой пептидной тест-системе ИФА для всех контрольных положительных сывороток, заведомо содержащих антитела к НТLV-I, было установлена иммунореактивность как с одним или двумя синтетическими пептидами белковых продуктов гена env (надмембранного гликопротеина gp46 env или трансмембранного гликопротеина gp21), так и с синтетическим пептидом матрикс-белка p19 gag, что отвечает официальным критериям подтвержденной анти-НТLV-I серопозитивности. Диагностическая чувствительность предлагаемого пептидного ИФА к антителам против гликопротеинов НТLV-I, кодируемых геном еnv, превысила этот показатель для сравниваемого ИБ, который в ряде сывороток не определял env-специфические антитела. The results obtained indicate that in the proposed peptide ELISA test system for all control positive sera that obviously contain antibodies to HTLV-I, immunoreactivity was established as with one or two synthetic peptides of the protein products of the env gene (supmembrane gp46 env glycoprotein or transmembrane glycoprotein gp21), as well as with the synthetic peptide of the p19 gag matrix protein, which meets the official criteria for confirmed anti-HTLV-I seropositivity. The diagnostic sensitivity of the proposed peptide ELISA to antibodies against the HTLV-I glycoproteins encoded by the env gene exceeded that for the compared IB, which did not detect env-specific antibodies in a number of sera.

Предлагаемый способ определения антител к индивидуальным белкам ретровирусов человека позволяет повысить диагностическую чувствительность иммунодиагностических тест-систем к env-специфическим антителам, необходимым для подтверждения противоретровирусной серопозитивности, а также снизить стоимость антигенного компонента тест-систем за счет использования недорогостоящих синтетических пептидных антигенов. The proposed method for determining antibodies to individual proteins of human retroviruses allows to increase the diagnostic sensitivity of immunodiagnostic test systems to env-specific antibodies necessary to confirm antiretroviral seropositivity, as well as to reduce the cost of the antigenic component of test systems by using inexpensive synthetic peptide antigens.

Claims

1. METHOD FOR DETERMINING ANTIBODIES TO INDIVIDUAL HUMAN RETROVIRUS PROTEINS, comprising contacting a test sample of a biological fluid with a kit consisting of several individual retroviral protein antigens individually immobilized, followed by recording the results of an immunological reaction, characterized in that the test sample is contacted with peptides corresponding to different antigenic determinants of several diagnostically significant proteins of human retroviruses, including inthetic peptides of proteins encoded by the env gene.

2. The method according to p. 1, characterized in that the antibodies to individual proteins of retroviruses are determined: human immunodeficiency virus type 1 (HTV-I) and T-lymphotropic human type 1 virus (HTLV-I).

3. The method according to PP. 1 and 2, characterized in that the test sample is contacted with synthetic peptides corresponding to the antigenic determinants of the proteins encoded by the env genes of human retroviruses: gp46 env HTLV-I, gp21 env HTLV-I, gp120 env HIV-i, gp41 env HIV-i.

4. The method according to PP. 1-3, characterized in that the test sample is contacted with a set of synthetic peptides corresponding to the antigenic determinants of the p24 gag, gp120 env and gp41 env HIV-I proteins.

5. The method according to PP. 1 to 4, characterized in that the test sample is contacted with a set of synthetic peptides corresponding to the antigenic determinants of the p19 gag, gp46 env and gp 21 env HTLV-I proteins.

6. The method according to PP. 1 to 5, characterized in that the synthetic peptides are used in a concentration range for immobilization from 0.1 to 100 μg / ml.

7. The method according to PP. 1-6, characterized in that the synthetic peptides are mobilized in the wells of the plates for enzyme immunoassay.