RU2051580C1

RU2051580C1 - Method of erythrocyte conservation

Info

Publication number: RU2051580C1
Application number: RU94043332A
Authority: RU
Original assignee: АОЗТ "Интеграл-С"
Priority date: 1994-12-07
Filing date: 1994-12-07
Publication date: 1996-01-10
Also published as: RU94043332A

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: erythrocytes with cryopreserving agent containing sucrose, sodium chloride, bidistilled water and α-propylene glycol at the ratio 1:(1-2) up to the final concentration of a-propylene glycol in intercellular medium 30-32%. Product is frozen at the rate 4-6 C/min up to temperature (-80)-(-196 C). EFFECT: improved method of conservation. 1 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, а именно низкотемпературному консервированию эритроцитов человека для длительного хранения, и может найти применение на станциях переливания крови и отделениях криоконсервирования крови медицинских учреждений. The invention relates to medicine, namely to the low-temperature preservation of human red blood cells for long-term storage, and can be used at blood transfusion stations and blood cryopreservation departments of medical institutions.

Ближайшим аналогом изобретения является способ консервирования эритроцитов под защитой 1,2 пропандиола, (α- пропиленгликоль). Согласно этому способу эритромассу (ЭРМ) в соотношении 1:1 смешивают с криоконсервиpующим раствором, содержащим сахарозу (или маннит), хлористый натрий, бидистиллированную воду, криопротектор, центрифугируют и после удаления надосадка замораживают со скоростью 12-14^оС/мин до (-150)-(-170)^оС. Хранят эритроциты в жидком азоте (-196^оС). Однако известный способ имеет ограничение по температуре хранения замороженного материала (-196^оС), связан с большими потерями хладагента в процессе хранения в следствии его испарения из-за естественного теплопритока через стенки хранилища.The closest analogue of the invention is a method of preserving red blood cells under the protection of 1,2 propanediol, (α-propylene glycol). In this method, red blood cell (ERM) in the ratio 1: 1 was mixed with kriokonservipuyuschim solution containing sucrose (or mannitol), sodium chloride, bidistilled water, cryoprotectant, centrifuged and after removing the supernatant is frozen at a rate ^of 12-14 C / min to (- 150) - (- 170) ^o C. Store red blood cells in liquid nitrogen (-196 ^o C). However, the known method has a limit on the storage temperature of the frozen material (-196 ^about C), associated with large losses of refrigerant during storage due to its evaporation due to natural heat influx through the walls of the store.

Целью изобретения является расширение интервала температур хранения клеток, что позволяет получить следующий технический результат: хранить эритроциты в среде охлажденных газов, электрохолодильниках, уменьшить расход средств при хранении. The aim of the invention is to expand the temperature range of storage of cells, which allows to obtain the following technical result: to store red blood cells in a medium of chilled gases, electric refrigerators, to reduce the cost of storage.

Известно, что основной причиной повреждения клеток в процессе замораживания-оттаивания является кристаллизация воды и сопутствующие этому явлению фазовые переходы в растворах при низких температурах. Детальное изучение физико- химических процессов в растворах криопротекторов позволило установить, что с повышением концентрации возрастает доля аморфной фазы в замороженном растворе, предохраняющая клетки от механического воздействия льда. Уменьшение скорости охлаждения предотвращает фазовые переходы в замороженном растворе. It is known that the main cause of cell damage during freezing-thawing is the crystallization of water and the phase transitions accompanying this phenomenon in solutions at low temperatures. A detailed study of the physicochemical processes in cryoprotectant solutions allowed us to establish that with an increase in concentration, the proportion of the amorphous phase in the frozen solution increases, which protects cells from the mechanical effect of ice. Reducing the cooling rate prevents phase transitions in the frozen solution.

В связи с изложенным технический результат достигается тем, что при консервации, в отличие от известного способа, к объему ЭРМ добавляют один-два объема криоконсервирующего раствора (при этом межклеточная концентрация криопротектора увеличивается с 23% до 28-32% ) и замораживают клетки со скоростью 4-6^оС/мин.In connection with the foregoing, the technical result is achieved by the fact that during conservation, in contrast to the known method, one or two volumes of a cryopreservation solution are added to the volume of the ERM (the intercellular concentration of the cryoprotectant increases from 23% to 28-32%) and the cells are frozen at a rate 4-6 ^about C / min.

П р и м е р 1. Из крови, стабилизированной цитратным стабилизатором и хранившейся 1 сут при +4^оС, отделяют надосадок и к оставшейся эритромассе приливают до соотношения 1:2 смесь следующего состава: 1,2 пропандиол 350 мл; сахароза 30 г; NaCl 6 г; вода бидистилированная 620 мл.EXAMPLES EXAMPLE 1 From the blood, the citrate stabilized stabilizer and has been stored 1 day at +4 ^C, the supernatant was separated and the remaining red blood cell is poured to the 1: 2 mixture of the following composition: 350 ml of 1,2 propanediol; sucrose 30 g; NaCl 6 g; bidistilled water 620 ml.

Температуру криоконсерванта и эритромассы к моменту их смешивания доводят до 20^оС. Концентрация α ПГ в межклеточной среде 28% Полученную эритровзвесь центрифугируют в течение 20 мин при 2000 об/мин. После отделения надосадка эритромассу (200 мл) переносят в алюминиевый контейнер емкостью 290 мл. Контейнер помещают в металлический чехол, который погружают в жидкий азот (чтобы азот не проникал внутрь чехла) и охлаждают со скоростью 5^о/мин до температуры 170^оС. Затем контейнер переносят в хранилище с жидким азотом (-196^оС). Размораживают эритромассу через 1 ч, через 6 мес и через 12 мес в воде с температурой +40^оС. Гемолиз после размораживания соответственно 2,2% 2,4% 2,1%
П р и м е р 2. Из крови выделяют эритромассу в соответствии с примером 1. В качестве криопротектора используют α ПГ, добавляя к эритромассе до соотношения 1:1 смесь следующего состава: α ПГ 450 мл; сахароза 40 г; NaCl 5 г; вода бидистиллированная 510 мл.The temperature of the cryoprotectant and the red blood cell by the time of mixing is adjusted to 20 ° ^C. The concentration of PG in the intercellular α medium 28% eritrovzves resultant was centrifuged for 20 min at 2000 rev / min. After separation of the supernatant, erythromass (200 ml) is transferred into an aluminum container with a capacity of 290 ml. The container is placed in a metal cover, which is immersed in liquid nitrogen (the nitrogen not to penetrate into the sheath) and cooled at a rate ^of 5 / min to a temperature of 170 ^o C. The container is then transferred to a liquid nitrogen storage (-196 ° ^C). Thawed red blood cell after 1 hour, after 6 months or after 12 months in water at 40 ^C. The hemolysis after thawing, respectively, 2.2% 2.4% 2.1%
PRI me R 2. Erythromass is isolated from blood in accordance with Example 1. α PG is used as a cryoprotectant, adding a mixture of the following composition to erythromass to a 1: 1 ratio: α PG 450 ml; sucrose 40 g; NaCl 5 g; bidistilled water 510 ml.

Концентрация α ПГ в межклеточной среде 32% Охлаждение проводят со скоростью 6^оС/мин. Хранят при (-80)^оС. Проверка уровня гемолиза показала 2,1-2,8%
П р и м е р 3. Эритроциты выделяют из крови в соответствии с примером 2. К эритромассе добавляют в соотношении 1:2 композицию следующего состава: α ПГ 380 мл; сахароза 30 г; NaCl 6 г; вода бидистиллированная 590 мл.The concentration of α GHG in the intercellular medium 32%. Cooling is carried out at a speed of 6 ^about C / min. Store at (-80) ^о С. The hemolysis level test showed 2.1-2.8%
PRI me R 3. Erythrocytes isolated from blood in accordance with example 2. To the erythromass add in the ratio 1: 2 a composition of the following composition: α PG 380 ml; sucrose 30 g; NaCl 6 g; bidistilled water 590 ml.

Концентрация α ПГ в межклеточной среде 30% Замораживают со скоростью 4^оС/мин. Хранят при (-110)^оС, гемолиз 2,1-2,4%
П р и м е р 4. Эритроциты выделяют из крови в соответствии с примером 1. К эритромассе в соотношении 1:2 добавляют композицию следующего состава: α ПГ 450 мг; сахароза 35 г; NaCl 5,5 г; выда бидистиллированная 615 мл.The concentration of α GHG in the intercellular environment 30% Freeze at a speed of 4 ^about C / min Store at (-110) ^о С, hemolysis 2.1-2.4%
PRI me R 4. Erythrocytes isolated from blood in accordance with example 1. To the erythromass in a ratio of 1: 2 add a composition of the following composition: α PG 450 mg; sucrose 35 g; NaCl 5.5 g; yield bidistilled 615 ml.

Межклеточная концентрация α ПГ в суспензии 36% Охлаждают со скоростью 6^оС/мин. Хранят при (-196)^оС. Гемолиз 6-13%
П р и м е р 5. Проводят операции, как в примере 4. К эритромассе добавляют в соотношении 1:2 композицию следующего состава: α ПГ 325 мл; сахароза 35 г; NaCl 6 г; вода бидистиллированная 640 мл.The intercellular concentration of α-PG in a suspension of 36% is cooled at a rate of 6 ^° C / min. Store at (-196) ^o C. Hemolysis 6-13%
PRI me R 5. Perform operations as in example 4. To the erythromass add in the ratio 1: 2 composition of the following composition: α PG 325 ml; sucrose 35 g; NaCl 6 g; bidistilled water 640 ml.

Межклеточная концентрация α ПГ 26% Охлаждают со скоростью 4^оС/мин. Хранят при (-80)^оС. Гемолиз 5-10%
П р и м е р 6. Эритроциты выделяют из крови в соответствии с примером 1. К эритромассе в соотношении 1:2 добавляют композицию следующего состава: α ПГ 350 мл; сахароза 30 г; NaCl 6 г; вода бидистиллированная 620 мл.The intercellular concentration of α GH 26% Cool at a speed of 4 ^about C / min Store at (-80) ^about C. Hemolysis 5-10%
PRI me R 6. Erythrocytes isolated from blood in accordance with example 1. To the erythromass in a ratio of 1: 2 add a composition of the following composition: α PG 350 ml; sucrose 30 g; NaCl 6 g; bidistilled water 620 ml.

Межклеточная концентрация α ПГ 28% Охлаждают со скоростью 4^оС/мин. Хранят при (-70)^оС. Гемолиз 6-12%
П р и м е р 7. Проводят операции в соответствии с примером 6.Intracellular concentration α GH 28% Cool at a rate of 4 ^about C / min Store at (-70) ^about C. Hemolysis 6-12%
PRI me R 7. Perform operations in accordance with example 6.

Хранят при температуре (-110)^оС. Гемолиз 2,2-2,4%
П р и м е р 8. Эритроциты выделяют из крови в соответствии с примером 1. К эритромассе до соотношения 1:2 добавляют композицию следующего состава: α ПГ 400 мл; сахароза 40 г; NaCl 6 г; вода бидистиллированная 560 мл.Store at a temperature of (-110) ^about C. Hemolysis of 2.2-2.4%
PRI me R 8. Erythrocytes isolated from blood in accordance with example 1. To the erythromass to a ratio of 1: 2 add a composition of the following composition: α PG 400 ml; sucrose 40 g; NaCl 6 g; bidistilled water 560 ml.

Межклеточная концентрация α ПГ 32% Охлаждают со скоростью 2^оС/мин; Хранят при (-80)^оС. Гемолиз 8-12%
П р и м е р 9. Проводят операции в соответствии с примером 8.The intercellular concentration of α PG 32% Cool at a speed of 2 ^about C / min; Store at (-80) ^about C. Hemolysis 8-12%
PRI me R 9. Perform operations in accordance with example 8.

Охлаждают со скоростью 9^оС/мин. Хранят при (-110)^оС. Гемолиз 5-10%
Приведенные примеры показывают, что:
оптимальная концентрация αПГ во взвеси клеток 28-32%
оптимальной скоростью охлаждения является 4-6^оС/мин, а температура, до которой следует охлаждать продукт (сохраняемый) (-80)-(-196)^оС.Cool at a rate of 9 ^about C / min Store at (-110) ^about C. Hemolysis 5-10%
The above examples show that:
optimal concentration of α-PG in suspension of cells 28-32%
the optimal cooling rate is 4-6 ^o C / min, and the temperature to which the product should be cooled (stored) (-80) - (- 196) ^о С.

В таблице приведены данные по хранению эритроцитов при различных температурах, замороженных по известному и заявленному способам. The table shows the data on the storage of red blood cells at various temperatures, frozen according to the known and claimed methods.

Как следует из таблицы, нет достоверных различий в гемолизе при хранении эритромассы по предлагаемому способу в течение года при (-195)^оС и (-80)^оС, в то время как по известному способу гемолиз клеток через год хранения при (-80)^оС увеличивается в 3 раза.As follows from the table, there are no significant differences in hemolysis during storage of erythromass according to the proposed method during the year at (-195) ^о С and (-80) ^о С, while according to the known method, hemolysis of cells after a year of storage at (-80 ) ^о С increases by 3 times.

Хранение при (-70)^оС как в предлагаемом способе, так и в известном, не дает положительных результатов. Таким образом, предлагаемый способ консервации позволяет хранить замороженную эритромассу при (-196)^оС и при (-80)^оС.Storage at (-70) ^{° C} in the present process, and in a certain, does not give positive results. Thus, the proposed method allows to store the frozen preservation of red blood cell at (-196) ^{° C} and (-80) ° ^C

Повышение концентрации 1,2 пропандиола в суспензии осуществляют путем добавления к объему эритромассы одного-двух объемов консервирующего раствора, содержащего 35-45% криопротектора. Учитывая, что эритроцит содержит в среднем 55% воды, а 1,2 ПД свободно проникает через мембрану клетки, концентрация αПГ в суспензии в случае прототипа равна 23% а в предлагаемом способе достигает 28-32%
Хранение при -80^оС в электрохолодильниках типа МП эритромассы более экономично в сравнении с хранением в жидко-азотном хранилище.An increase in the concentration of 1.2 propanediol in the suspension is carried out by adding to the volume of erythromass one or two volumes of a preservation solution containing 35-45% cryoprotectant. Given that the red blood cell contains an average of 55% water, and 1.2 PD freely penetrates the cell membrane, the concentration of αPH in suspension in the case of the prototype is 23% and in the proposed method reaches 28-32%
Storage at ^-80 ° C in a type of Electric MP red blood cell is more economical in comparison with the storage in the liquid-nitrogen storage.

Claims

METHOD FOR CONSERVATION OF ERYTHROCYTES by mixing them with a cryopreservation solution containing sucrose, sodium chloride, double-distilled water and propylene glycol followed by freezing, characterized in that the erythromass is mixed with a cryopreservative in a ratio of 1: (1 - 2) to a final concentration of propylene 30 32%, and freezing is carried out at a rate of 4 - 6 ^o C / min to a temperature of (-80) - (-196) ^o C.