RU2049991C1

RU2049991C1 - Method and active member for detecting metabolites in biological fluids

Info

Publication number: RU2049991C1
Authority: RU
Inventors: А.Л. Гиндилис; С.Ф. Чернов; И.Н. Курочкин
Original assignee: Гиндилис Андрей Львович
Priority date: 1992-06-25
Filing date: 1992-06-25
Publication date: 1995-12-10

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves detecting hydrogen peroxide formation in presence of peroxidase immobilized on electrode to determine metabolite contents in biological fluids capable of enzymatic oxidation. Hydrogen peroxide formation is detected due to enzymatic overstress relieving. The active member has composite carbonic material and peroxidase and oxidase coimmobilized on the electrode surface catalyzing oxidation of substratum to be analyzed accompanied by hydrogen peroxide formation in 1:5-5:1 proportion. EFFECT: enhanced effectiveness of metabolism disorders diagnosis. 6 cl, 3 dwg

Description

Изобретение относится к методам диагностики различных патологий, связанных с нарушениями обмена метаболитов (таких как глюкоза, холестерин, лактат, мочевая кислота и др.) и может быть использовано и поэтому рентабельны в применении только для крупных клиник. Кроме того, данные методы не обеспечивают достаточной экспрессности анализа и отличаются значительной дороговизной за счет высокой стоимости оборудования и большого расхода реактивов. The invention relates to methods for diagnosing various pathologies associated with metabolic metabolic disorders (such as glucose, cholesterol, lactate, uric acid, etc.) and can be used and therefore are cost-effective in use only for large clinics. In addition, these methods do not provide sufficient rapidity of analysis and are significantly expensive due to the high cost of equipment and high consumption of reagents.

Биосенсорный анализ метаболитов в большинстве случаев лишен перечисленных недостатков. Сейчас в коммерческих биосенсорах в основном применяется амперометрический принцип детекции. В этом случае метаболиты окисляются на мембране в присутствие соответствующего иммобилизованного фермента, а образующийся пероксид водорода детектируется на электроде амперометрически. Амперометрический способ детекции отличается от потенциометрического более сложной приборной частью и высокими требованиями к квалификации обслуживающего персонала. The biosensor analysis of metabolites in most cases is devoid of the above disadvantages. Now in commercial biosensors the amperometric principle of detection is mainly applied. In this case, the metabolites are oxidized on the membrane in the presence of the corresponding immobilized enzyme, and the resulting hydrogen peroxide is detected amperometrically on the electrode. The amperometric method of detection differs from the potentiometric method in a more complex instrument part and high requirements for the qualification of staff.

Прототипом изобретения является способ определения глюкозы и активный элемент (электрод) на основе глюкозооксидазы иммобилизованной на поверхности платины. При этом определение глюкозы осуществляется амперометрически по пероксиду водорода, образующемуся в ходе ферментативного окисления глюкозы в присутствии глюкозооксидазы. The prototype of the invention is a method for determining glucose and an active element (electrode) based on glucose oxidase immobilized on the surface of platinum. In this case, glucose is determined amperometrically using hydrogen peroxide formed during the enzymatic oxidation of glucose in the presence of glucose oxidase.

Целью изобретения является разработка простого, прецизионного, инструментального метода для определения содержания метаболитов, способных к ферментативному окислению с образованием пероксида водорода (глюкоза, холестерин, лактат, мочевая кислота и др.), и активных элементов для его проведения. Метод предназначен для широкого использования в диагностике, установления общей клинической картины пациентов и для скрининга среди больших групп населения (диспансерное обслуживание и обследование групп риска). The aim of the invention is to develop a simple, precise, instrumental method for determining the content of metabolites capable of enzymatic oxidation with the formation of hydrogen peroxide (glucose, cholesterol, lactate, uric acid, etc.), and active elements for its implementation. The method is intended for widespread use in diagnostics, establishing the general clinical picture of patients and for screening among large groups of the population (dispensary care and examination of risk groups).

Сущность нового подхода определения метаболитов в биологических жидкостях заключается в использовании явления безмедиаторного биоэлектрокатализа, позволяющего за счет ферментативного снятия перенапряжения детектировать образование пероксида водорода в присутствии иммобилизованной на электроде пероксидазы. Это свойство положено в основу селективной потенциометрической детекции метаболитов, способных к ферментативному окислению с образованием пероксида водорода. Активный элемент состоит из композитного углеродистого материала и соиммобилизованных на поверхности электрода их пероксидазу и фермент катализатор окисления аналита (глюкозооксидазу или лактатоксидазу, уратоксидазу, холестериноксидазу и т.п.). Каталитическое окисление аналита приводит к образованию пероксида водорода. Безмедиаторный катализ пероксидазой электровосстановления пероксида водорода обуславливает сдвиг электродного потенциала за счет каталитического снятия перенапряжения. При этом скорость роста электродного потенциала пропорциональна концентрации аналита. The essence of a new approach for the determination of metabolites in biological fluids is to use the phenomenon of mediatorless bioelectrocatalysis, which allows the formation of hydrogen peroxide in the presence of peroxidase immobilized on the electrode due to enzymatic removal of overvoltage. This property underlies the selective potentiometric detection of metabolites capable of enzymatic oxidation with the formation of hydrogen peroxide. The active element consists of a composite carbon material and their peroxidase and an analyte oxidation catalyst (glucose oxidase or lactate oxidase, uratoxidase, cholesterol oxidase, etc.) that are immobilized on the electrode surface. The catalytic oxidation of the analyte leads to the formation of hydrogen peroxide. The mediator-free catalysis of hydrogen peroxide electroreduction by peroxidase causes a shift in the electrode potential due to catalytic overvoltage relief. In this case, the growth rate of the electrode potential is proportional to the analyte concentration.

Для проведения таких измерений разработан активный элемент (электрод), методика произведения измерений и прибор (биосенсор) для анализа метаболитов. To carry out such measurements, an active element (electrode), a measurement technique, and a device (biosensor) for metabolite analysis have been developed.

Преимущества данного подхода обусловлены тем фактом, что изменение электродного потенциала в присутствии пероксида водорода обусловлено прямым биоэлектрокатализом реакции электровосстановления последнего. Этот факт дает возможность отказаться от использования низкомолекулярных медиаторов. Отказ от использования низкомолекулярных медиаторов позволяет реализовать потенциометрическую схему многоразового анализа при отсутствии каких-либо дополнительных реагентов кроме буферного раствора. The advantages of this approach are due to the fact that the change in the electrode potential in the presence of hydrogen peroxide is due to direct bioelectrocatalysis of the electroreduction reaction of the latter. This fact makes it possible to abandon the use of low molecular weight mediators. The rejection of the use of low molecular weight mediators allows for the implementation of a potentiometric reusable assay scheme in the absence of any additional reagents other than a buffer solution.

Особенность нового подхода заключается в том, что он отличается методической простотой. Электронная часть аппаратурного оформления по существу представляет собой вольтметр с высоким входным импедансом и блок преобразования сигнала. Активные элементы (электроды) исключительно просты в изготовлении и миниатюризированы. A feature of the new approach is that it differs in methodological simplicity. The electronic part of the hardware is essentially a voltmeter with a high input impedance and a signal conversion unit. Active elements (electrodes) are extremely simple to manufacture and miniaturized.

Способ осуществляют следующим образом:
П р и м е р 1. Изготовление активных элементов (электродов).The method is as follows:
PRI me R 1. The manufacture of active elements (electrodes).

В 0,5 мл раствора полимера (полиэтиленимина модифицированного последовательно этилбромидом и цетилбромидом по известному методу в бензоле (10 мг/мл) суспендируют 30 мг сажи ПМ-100 с удельной поверхностью 98 м²/г, суспензию наносили на электрод из углеродистого материала (пирографит, графитовое волокно) и высушивают. Электрод обрабатывают в течение 10 ч в 7,5%-ном растворе глутарового альдегида в 0,01 М фосфатном буфере рН 6,8 при 310 К. Затем помещали в раствор пероксидазы и фермента-катализатора окисления аналита в 0,01 М фосфатном буфере рН 6,8, инкубируют в течение 4 ч при 277 К. Ферменты-катализаторы окисления аналита для соответствующих аналитов используются следующие: глюкозооксидаза (глюкоза), холестериноксидаза (холестерин), лактатоксидаза (лактат), уратоксидаза (мочевая кислота). Отношение концентрации фермента к концентрации пероксидазы составляет от 1:5 до 5:1 в зависимости от природы фермента-катализатора окисления аналита.In a 0.5 ml polymer solution (polyethyleneimine sequentially modified with ethyl bromide and cetyl bromide according to the known method in benzene (10 mg / ml), 30 mg of PM-100 carbon black with a specific surface area of 98 m ² / g was suspended, the suspension was applied to an electrode made of carbon material (pyrographite , graphite fiber) and dried.The electrode is treated for 10 h in a 7.5% solution of glutaraldehyde in 0.01 M phosphate buffer pH 6.8 at 310 K. Then it was placed in a solution of peroxidase and an analyte oxidation enzyme in 0.01 M phosphate buffer pH 6.8, incubate t for 4 hours at 277 K. The analyte oxidation enzymes for the corresponding analytes are as follows: glucose oxidase (glucose), cholesterol oxidase (cholesterol), lactate oxidase (lactate), urate oxidase (uric acid). The ratio of the concentration of the enzyme to the concentration of peroxidase is from 1 : 5 to 5: 1, depending on the nature of the analyte oxidation enzyme.

Полимер, входящий в состав композитного материала активного элемента выполняет следующие основные функции: служит связующим для сажи при сохранении проводимости последней; предоставляет аминогруппы для иммобилизации ферментов на поверхности электрода. Кроме того, модифицированный полиэтиленимин препятствует неспецифической сорбции белков на поверхности электрода, благодаря своим поверхностно-активным свойствам. The polymer that is part of the composite material of the active element performs the following main functions: serves as a binder for soot while maintaining the conductivity of the latter; provides amino groups for immobilizing enzymes on the surface of the electrode. In addition, modified polyethyleneimine prevents nonspecific sorption of proteins on the electrode surface due to its surface-active properties.

П р и м е р 2. Определение глюкозы. PRI me R 2. Determination of glucose.

1. Анализ глюкозы в водных растворах. Измерения производят в 0,01 М Na-фосфатном буфере рН 6,8, содержащим 0,05 M NaCl в измерительной ячейке объемом 0,1-1 мл. Электродом сравнения служит Ag/AgCl электрод или электрод из материала активного элемента, не содержащего иммобилизованных ферментов. Регистрация потенциала производится при помощи вольтметра с высоким входным импедансом, имеющим выход на самописец или блок обработки сигнала. Объем вводимой пробы составляет 10% от объема измерительной ячейки. 1. Analysis of glucose in aqueous solutions. Measurements are made in 0.01 M Na-phosphate buffer pH 6.8, containing 0.05 M NaCl in a measuring cell with a volume of 0.1-1 ml. The reference electrode is an Ag / AgCl electrode or an electrode made of an active element material that does not contain immobilized enzymes. The potential is recorded using a voltmeter with a high input impedance, which has an output to the recorder or signal processing unit. The volume of the injected sample is 10% of the volume of the measuring cell.

В отсутствие глюкозы в среде на электроде устанавливается потенциал 0-100 мВ. Рост электродного потенциала после инжектирования глюкозы в реакционную ячейку происходит с начальными скоростями в десятки-сотни мВ/мин в зависимости от концентрации глюкозы. Предельное значение потенциала электрода обуславливается снятием перенапряжения электровосстановления пероксида водорода и соответствует приблизительно 400 мВ. Для надежного определения начальной скорости достаточно 10-и секунд. После каждого измерения необходимо снять поляризацию электрода кратковременной (несколько секунд) принудительной катодной поляризацией с использованием вспомогательного электрода. Вспомогательный электрод может быть выполнен из углеродистого материала (пирографит, углеродистое волокно). Рабочий электрод подключают к катоду, а вспомогательный к аноду источника питания (напряжение 1 В). После падения потенциала рабочего электрода ниже фонового значения цепь размыкают. После установления на рабочем электроде фонового значения потенциала можно производить последующее измерение (фиг. 1). Эта процедура достаточно проста и отнимает вместе с промывкой электрода и ячейки не более 1 мин. In the absence of glucose in the medium, a potential of 0-100 mV is established on the electrode. The growth of the electrode potential after injection of glucose into the reaction cell occurs with initial velocities of tens to hundreds of mV / min depending on the glucose concentration. The limit value of the electrode potential is determined by the removal of the overvoltage of the electroreduction of hydrogen peroxide and corresponds to approximately 400 mV. For a reliable determination of the initial speed, 10 seconds are enough. After each measurement, it is necessary to remove the electrode polarization by short-term (several seconds) forced cathodic polarization using an auxiliary electrode. The auxiliary electrode may be made of carbon material (pyrographite, carbon fiber). The working electrode is connected to the cathode, and the auxiliary to the anode of the power source (voltage 1 V). After the potential of the working electrode drops below the background value, the circuit is opened. After establishing the background value of the potential at the working electrode, a subsequent measurement can be made (Fig. 1). This procedure is quite simple and takes together with washing the electrode and the cell no more than 1 min.

На фиг. 2 приведена калибровочная зависимость скорости роста потенциала активного элемента (электрода) от концентрации глюкозы. Зависимость линейна в диапазоне концентрации глюкозы 0,25-20 мМ (с учетом десятикратного разбавления пробы при инжектировании), что полностью покрывает необходимый клинический диапазон концентраций в крови и моче. Анализ глюкозы в крови ведут аналогично. Способ позволяет определять глюкозу как в плазме так и в цельной крови. In FIG. Figure 2 shows the calibration dependence of the growth rate of the potential of the active element (electrode) on glucose concentration. The dependence is linear in the range of glucose concentration of 0.25-20 mM (taking into account tenfold dilution of the sample during injection), which completely covers the necessary clinical range of concentrations in blood and urine. Blood glucose analysis is carried out similarly. The method allows to determine glucose both in plasma and in whole blood.

Устройство для проведения измерения концентрации глюкозы (фиг. 3) включает в себя: электрохимическую ячейку, содержащую рабочий электрод (активный элемент), электрод сравнения (Ag/AgСl электрод), вспомогательный электрод (угольный электрод); инжектор пробы; измерительный прибор (вольтметр с входным сопротивлением не ниже 100 МОм); устройство для обработки сигнала (самописец); источник деполяризующего напряжения (гальванический элемент на 1 В). Основным фактором крови (мочи), который может существенно влиять на результаты анализа является аскорбиновая кислота. Аскорбиновая кислота является субстратом пероксидазы и ее наличие приводит к занижению реального значения концентрации аналита при концентрации аскорбата в анализируемой среде свыше 0,1 мМ. A device for measuring glucose concentration (Fig. 3) includes: an electrochemical cell containing a working electrode (active element), a reference electrode (Ag / AgCl electrode), an auxiliary electrode (carbon electrode); sample injector; measuring device (voltmeter with an input resistance of at least 100 megohms); signal processing device (recorder); depolarizing voltage source (1 V galvanic cell). The main factor in the blood (urine), which can significantly affect the results of the analysis, is ascorbic acid. Ascorbic acid is a substrate of peroxidase and its presence leads to an underestimation of the real value of the analyte concentration at an ascorbate concentration in the analyzed medium of more than 0.1 mM.

П р и м е р 3. Определение холестерина в биологических жидкостях. Активный элемент готовят аналогично примеру 1, в качестве фермента катализатора окисления аналита используется холестериноксидаза. Измерения ведут аналогично примеру 2. Диапазон определяемых концентраций: 0,5-15 мМ. PRI me R 3. Determination of cholesterol in biological fluids. The active element is prepared analogously to example 1, cholesterol oxidase is used as the enzyme of the analyte oxidation catalyst. The measurements are carried out analogously to example 2. The range of determined concentrations: 0.5-15 mm.

П р и м е р 4. Определение лактата в биологических жидкостях. Активный элемент готовят аналогично примеру 1, в качестве фермента катализатора окисления аналита используется лактатоксидаза. Измерение ведут аналогично примеру 2. Диапазон определяемых концентраций: 0,1-15 мМ. PRI me R 4. Determination of lactate in biological fluids. The active element is prepared analogously to example 1, lactate oxidase is used as an enzyme for the analyte oxidation catalyst. The measurement is carried out analogously to example 2. The range of determined concentrations: 0.1-15 mm.

П р и м е р 5. Определение мочевой кислоты в биологических жидкостях. Активный элемент готовят аналогично примеру 1, в качестве фермента катализатора окисления аналита используется уратоксидаза. Измерения ведут аналогично примеру 2. Диапазон определяемых концентраций: 1-20 мМ. PRI me R 5. Determination of uric acid in biological fluids. The active element is prepared analogously to example 1, as an enzyme for the analyte oxidation catalyst, uratoxidase is used. The measurements are carried out analogously to example 2. The range of determined concentrations: 1-20 mm.

П р и м е р 6. Определение холина в биологических жидкостях. Активный элемент готовят аналогично примеру 1, в качестве фермента катализатора окисления аналита используется холиноксидаза. Измерения ведут аналогично примеру 2. Диапазон определяемых концентраций: 0,2-10 мМ. PRI me R 6. Determination of choline in biological fluids. The active element is prepared analogously to example 1, choline oxidase is used as the enzyme of the analyte oxidation catalyst. The measurements are carried out analogously to example 2. The range of determined concentrations: 0.2-10 mm.

Таким образом, описанный метод имеет высокую производительность (до 30 анализов в час), отличается методической простотой (не требует дополнительных реагентов кроме буферного раствора), дешевизной (расход ферментов на 1 активный элемент не превышает 10 мкг, активный элемент выдерживает от 100 до 1000 анализов), и может быть реализован аппаратурно на простой элементной базе. Thus, the described method has high productivity (up to 30 analyzes per hour), differs in methodological simplicity (does not require additional reagents except a buffer solution), cheapness (the consumption of enzymes per 1 active element does not exceed 10 μg, the active element withstands from 100 to 1000 analyzes ), and can be implemented in hardware on a simple element base.

Claims

1. A method for determining metabolites in biological fluids, including sampling a biological sample, introducing a sample into a measuring cell with a special enzyme electrode, on which the corresponding enzyme is immobilized, the substrate of which is a determined metabolite, measuring the electrical characteristics of the electrode, the change of which occurs as a result of the enzymatic formation of hydrogen peroxide and determining the concentration of the metabolite, characterized in that the detection of hydrogen peroxide is carried out by reactions of electrocatalytic reduction of hydrogen peroxide in the presence of peroxidase co-mobilized with oxidase, which catalyzes the oxidation of the analyzed substrate with the formation of hydrogen peroxide, in the ratio of 1 5 5 1 on the electrode in the kinematic potentiometric mode, and the rate of change of the potential is proportional to the concentration of the metabolite.

2. The method according to claim 1, characterized in that glucose oxidase, cholesterol oxidase, urate oxidase, lactic oxidase, choline oxidase are used as oxidase.

3. The method according to claim 1, characterized in that after a cycle of measuring and washing the electrode before the next measurement, forced cathodic depolarization of the active element from an external source to the initial level of the potentiometric enzymatic electrode is carried out.

4. An active element for determining metabolites in biological fluids, containing a conductive substrate on which a conductive layer of a polymer-carbon composite material is applied, characterized in that the polymer used is sequentially modified with ethyl bromide and cetyl bromide polyethyleneimine with a polymerization degree of 10 - 2000 and the number of modified amino groups of 15 70% peroxidase and oxidase enzymes catalyzing the oxidation of the analyzed substrate are immobilized on the working surface of the element that the formation of hydrogen peroxide in a 1 5 5 1.

5. The element according to claim 4, characterized in that glucose oxidase is used as an oxidase.

6. The element according to claim 4, characterized in that cholesterol oxidase is used as an oxidase.