RU2045760C1 - Method for preparing of recombinant surface antigen of hepatitis b - Google Patents
Method for preparing of recombinant surface antigen of hepatitis b Download PDFInfo
- Publication number
- RU2045760C1 RU2045760C1 SU5025861/14A SU5025861A RU2045760C1 RU 2045760 C1 RU2045760 C1 RU 2045760C1 SU 5025861/14 A SU5025861/14 A SU 5025861/14A SU 5025861 A SU5025861 A SU 5025861A RU 2045760 C1 RU2045760 C1 RU 2045760C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- nutrient medium
- inorganic phosphorus
- peptone
- yeast
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к способу получения поверхностного антигена гепатита В путем микробиологического синтеза, который может быть использован в медицинской промышленности для изготовления вакцины против гепатита В. The invention relates to a method for producing hepatitis B surface antigen by microbiological synthesis, which can be used in the medical industry for the manufacture of hepatitis B vaccine.
Известны вакцины против гепатита В на основе НBs-антигена из сыворотки доноров [1] Однако такие вакцины небезопасны для человека, так как могут содержать инфекционные частицы гепатита В и могут быть контаминированы другими вирусами, например, ретровирусами, содержащимися в сыворотке. Known vaccines for hepatitis B based on HBs antigen from donor serum [1] However, such vaccines are unsafe for humans, as they may contain infectious particles of hepatitis B and can be contaminated with other viruses, for example, retroviruses contained in serum.
Способ получения вакцин из сывороток является многостадийным, содержит 2-3 стадии инактивации, а выход поверхностного антигена не превышает 10%
Известен способ получения HBs-антигена из штамма-продуцента дрожжей, заключающийся в культивировании штамма-продуцента в среде с богатым содержанием фосфора, в переносе клеток в среду с низким содержанием фосфора для репродукции HBs-антигена с последующим отмыванием клеток на центрифуге с проточным ротором. Далее клеточную пасту, освобожденную от среды, разводят до исходного объема фосфатным буфером и разрушают клетки с помощью гомогенизатора высокого давления. Конечный продукт получают с выходом 29% и с содержанием примесного белка до 20% что делает его применение в качестве вакцины невозможным [2]
Наиболее близким к заявленному по совокупности признаков является способ получения рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В, включающий культивирование штамма-продуцента дрожжей в среде, сбалансированной по свободным аминокислотам в концентрации 20-160 г/л, и при температуре 25оС. Среда содержит также глюкозу в концентрации 6 г/л, соли и витамины. При культивировании подается дополнительно среда с концентрацией глюкозы 400 г/л. Выход биомассы составляет 177 г при расходе глюкозы 1630 г. [3]
Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение выхода поверхностного антигена гепатита В.The method of obtaining vaccines from serum is multi-stage, contains 2-3 stages of inactivation, and the yield of surface antigen does not exceed 10%
A known method of producing HBs antigen from a yeast producer strain is to cultivate the producer strain in a phosphorus rich medium, transfer the cells to a low phosphorus medium to reproduce the HBs antigen, followed by washing the cells in a centrifuge with a flowing rotor. Next, the cell paste freed from the medium is diluted to the original volume with phosphate buffer and the cells are destroyed using a high pressure homogenizer. The final product is obtained with a yield of 29% and with an impurity protein content of up to 20%, which makes its use as a vaccine impossible [2]
The closest to the claimed combination of features for a method of producing a recombinant hepatitis B surface antigen comprising culturing a producer strain of yeast in a medium balanced free amino acids at a concentration of 20-160 g / l and at a temperature of 25 C. The medium also contains glucose in concentrations of 6 g / l, salt and vitamins. During cultivation, an additional medium with a glucose concentration of 400 g / l is supplied. The biomass yield is 177 g with a glucose consumption of 1630 g. [3]
The technical result of the invention is to increase the yield of hepatitis B surface antigen.
Способ получения рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В включает в себя культивирование и инкубацию штамма-продуцента дрожжей на питательной среде с последующим разрушением клеток дрожжей и выделением целевого продукта HBsAg отличием которого является то, что культивирование проводят на питательной среде, содержащей пептон и дрожжевой экстракт с конечной суммарной концентрацией неорганического фосфора 40-200 мг/л, а инкубацию проводят на питательной среде, содержащей пептон и дрожжевой экстракт с конечной суммарной концентрацией неорганического фосфора 5-50 мг/л. При этом в инкубационную среду постоянно добавляют пептон, глюкозу и дрожжевой экстракт в весовом соотношении 0,05-0,15:1:0,05-0,15 соответственно. A method of producing a recombinant hepatitis B surface antigen involves culturing and incubating a yeast producer strain on a nutrient medium, followed by destruction of the yeast cells and isolating the desired HBsAg product, the difference of which is that the cultivation is carried out on a nutrient medium containing peptone and yeast extract with a final total the concentration of inorganic phosphorus 40-200 mg / l, and the incubation is carried out on a nutrient medium containing peptone and yeast extract with a final total concentration inorganic phosphorus 5-50 mg / l. At the same time, peptone, glucose and yeast extract are constantly added to the incubation medium in a weight ratio of 0.05-0.15: 1: 0.05-0.15, respectively.
Использование на стадии культивирования дрожжей и биосинтеза антигена питательной среды, лимитированной по неорганическому фосфору позволяет получать оптимальный выход антигена независимо от вида сырья. The use of a nutrient medium limited in inorganic phosphorus at the stage of yeast cultivation and biosynthesis of the antigen allows one to obtain the optimal yield of antigen regardless of the type of raw material.
Дополнительная подача на стадии синтеза антигена питательной среды, содержащей пептон, глюкозу и дрожжевой экстракт в весомом соотношении 0,05-0,15: 1: 0,05-0,15 соответственно, приводит к повышению накопления биомассы дрожжей с одновременным повышением выхода антигена. An additional supply at the stage of antigen synthesis of a nutrient medium containing peptone, glucose and yeast extract in a weighted ratio of 0.05-0.15: 1: 0.05-0.15, respectively, leads to an increase in the accumulation of yeast biomass with a simultaneous increase in the yield of antigen.
Использование питательной среды как на стадии выращивания биомассы, так и на стадии биосинтеза антигена, с содержанием неорганического фосфора в количестве, выходящем за пределы оптимальных значений предлагаемого способа, не приводит к получению антигена с хорошим выходом. The use of a nutrient medium both at the stage of growing biomass and at the stage of antigen biosynthesis, with an inorganic phosphorus content in an amount that goes beyond the optimal values of the proposed method, does not lead to antigen production in good yield.
При культивировании используют штамм дрожжей, содержащий рекомбинантную плазмиду с геном HBsAg и способную продуцировать иммуногенный HBsAg. В качестве такого исходного штамма может быть использован любой штамм дрожжей продуцент HBsAg, например, штамм Saccharomyces cerevisiae DBY 746/pNMVG-46, полученный включением трансформированной плазмиды рNMVG-46 в реципиентный штамм DBY 746. Плазмида pNMVG-46 получена путем генноинженерной модификации из известной плазмиды рADG47 (Мол. генетика, микробиология и вирусология, 1986, N 8, 12-19). During cultivation, a yeast strain is used containing a recombinant plasmid with the HBsAg gene and capable of producing immunogenic HBsAg. As a starting strain, any HBsAg producing yeast strain can be used, for example, the Saccharomyces cerevisiae DBY 746 / pNMVG-46 strain obtained by incorporating the transformed plasmid pNMVG-46 into the recipient strain DBY 746. Plasmid pNMVG-46 was obtained by genetic engineering modification pADG47 (Mol. Genetics, Microbiology and Virology, 1986, N 8, 12-19).
П р и м е р 1. В биореактор с рабочим объемом 10 л, содержащим 9 л стерильной среды состава (мас.): пептон из кислотного гидролизата казеина с исходным содержанием неорганического фосфора 0,5-0,6 мг/г 3,0; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 2,0-2,5 мг/г 1,0; глюкоза 2,0, содержащей фосфора неорганического 40-45 мг/л, при рН 5,0-5,5 вносят культуру дрожжей S.с. DBY 746/pNMVG-46 в количестве 1,0 л, выращенную на минимальной среде (см. состав 1) и имеющую титр клеток 4,2 ˙ 107 в см3 культуральной жидкости. Культивирование ведут при температуре 29 + 1оС в течение 20 ч. Получают накопительную культуру с титром клеток 2,0 ˙ 108 кл/см3 культуральной жидкости.PRI me R 1. In a bioreactor with a working volume of 10 l, containing 9 l of sterile medium composition (wt.): Peptone from an acid hydrolyzate of casein with an initial inorganic phosphorus content of 0.5-0.6 mg / g 3.0 ; yeast extract with an initial inorganic phosphorus content of 2.0-2.5 mg / g 1.0; glucose 2.0, containing inorganic phosphorus 40-45 mg / l, at pH 5.0-5.5, yeast culture S.s. DBY 746 / pNMVG-46 in an amount of 1.0 l, grown on minimal medium (see composition 1) and having a cell titer of 4.2 ˙ 10 7 in cm 3 of culture fluid. Cultivation is carried out at a temperature of 29 + 1 about C for 20 hours. An accumulative culture is obtained with a cell titer of 2.0 ˙ 10 8 cells / cm 3 of culture fluid.
Культуру клеток в количестве 10 л переносят в биореактор с рабочим объемом 100 л, содержащий 70 л стерильной питательной среды состава (мас.): пептон из кислотного гидролизата казеина с исходным содержанием неорганического фосфора 0,5-0,6 мг/г 1,5, экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 2,0-2,5 мг/г 0,1; глюкоза 1,0; соли, микроэлементы, витамины (состав 2), содержащей фосфора неорганического 5,0-6,0 мг/л при рН 5,5-6,0. Культивирование ведут при температуре 30оС в течение 40 ч. В процессе культивирования дополнительно подают, начиная с 6 ч культивирования, 20 л стерильной питательной среды состава (мас.): пептон из кислотного гидролизата казеина с исходным содержанием неорганического фосфора 0,5-0,6 мг/г 5,0; глюкоза 42,0; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 2,0-2,5 мг/г 4,2 (или в соотношении 0,12:1:0,1 соответственно), соли, микроэлементы, витамины (состав 3).The cell culture in an amount of 10 l is transferred to a bioreactor with a working volume of 100 l, containing 70 l of a sterile nutrient medium composition (wt.): Peptone from an acidic casein hydrolyzate with an initial inorganic phosphorus content of 0.5-0.6 mg / g 1.5 yeast extract with an initial inorganic phosphorus content of 2.0-2.5 mg / g 0.1; glucose 1.0; salts, trace elements, vitamins (composition 2), containing inorganic phosphorus 5.0-6.0 mg / l at pH 5.5-6.0. Culturing was carried out at 30 ° C for 40 h cultivation process additionally fed, starting with 6 hours of culture, 20 l of sterile nutrient medium composition (wt.). Peptone, casein acid hydrolyzate of the original content of inorganic phosphorus 0,5-0 6 mg / g 5.0; glucose 42.0; yeast extract with an initial inorganic phosphorus content of 2.0-2.5 mg / g 4.2 (or in a ratio of 0.12: 1: 0.1, respectively), salts, trace elements, vitamins (composition 3).
Культуральную жидкость с содержанием клеток 6,7 ˙ 108 кл/см3 подают на проточную центрифугу типа Westfalia со скоростью протока 500 л/ч. Клеточную пасту освобождают от среды промыванием 0,05 М карбонатным буфером с рН 9,0 методом микрофильтрации с использованием мембранных фильтров с диаметром пор 0,2-0,45 мкм либо трехкратной отмывкой в буфере того же состава с последующим отделением биомассы на проточной центрифуге типа Westfalia при скорости протока 500 л/ч. Получают 5,0 кг биомассы, которую суспендируют в 50 л карбонатного буфера состава: 0,05 М Na2CO3 NaHCO3, 0,15 M NaCl, 10 mM ЭДТA, 0,2 мМ фенилметилсульфонилфторида и 0,3% Twenn-20. Разрушают с помощью гомогенизатора типа Gaulin APV при давлении 600-700 атм в 3 цикла. Гомогенизат осветляют с помощью проточной центрифуга типа Westfalia при скорости протока жидкости 60 л/ч. Получают 70 л осветленного гомогенизата, в котором определяют содержание антигена. Титр антигена составляет 28 мкг/мл. Выход антигена 19,5 мг с одного литра культуральной жидкости. Содержание HBsAg определяют методом иммуноферментного анализа с использованием наборов Abbott Auszyme II. Антигенную активность измеряют в мкг/мл, используя в качестве стандарта отраслевой стандартный образец активности НBsAg (ОСО 42-28-153-88), выпускаемый ГИСК им. Л.А.Тарасевича. На электрофореграммах в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях рекомбинантный антиген представлен в виде полосы мономера 24 kD. Иммуноспецифичность этой полосы показана методом иммуноблоттинга с использованием коммерческих анти-НBs, меченных йодом-125.A culture fluid with a cell content of 6.7 ˙ 10 8 cells / cm 3 is fed to a Westfalia type flow centrifuge with a flow rate of 500 l / h. The cell paste is freed from the medium by washing with 0.05 M carbonate buffer with a pH of 9.0 by microfiltration using membrane filters with a pore diameter of 0.2-0.45 μm or washing three times in a buffer of the same composition, followed by separation of the biomass in a flow type centrifuge Westfalia at a flow rate of 500 l / h. Obtain 5.0 kg of biomass, which is suspended in 50 l of carbonate buffer composition: 0.05 M Na 2 CO 3 NaHCO 3 , 0.15 M NaCl, 10 mM EDTA, 0.2 mm phenylmethylsulfonyl fluoride and 0.3% Twenn-20 . Destroy using a homogenizer type Gaulin APV at a pressure of 600-700 atm in 3 cycles. The homogenizate is clarified using a Westfalia type flow centrifuge at a fluid flow rate of 60 l / h. Obtain 70 l of clarified homogenizate, in which the antigen content is determined. The antigen titer is 28 μg / ml. The antigen yield of 19.5 mg per liter of culture fluid. The content of HBsAg was determined by enzyme immunoassay using Abbott Auszyme II kits. Antigenic activity is measured in μg / ml using the industry standard HBsAg activity standard (OSO 42-28-153-88), manufactured by GISK im. L.A. Tarasevich. On electrophoregrams in polyacrylamide gel under reducing conditions, the recombinant antigen is presented as a 24 kD monomer band. The immunospecificity of this band is indicated by immunoblotting using commercial anti-HBs labeled with iodine-125.
П р и м е р 2. В биореактор с 9 л стерильной питательной среды состава (мас. ): пентон с исходным содержанием неорганического фосфора 4,5-5,0 мг/г 2,0; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 10-11 мг/г 1,0; глюкоза 2,0 содержащей фосфора неорганического 195-200 мг/л, при рН 5,0-5,5 вносят культуру дрожжей в количестве 1 л, выращенную на минимальной среде (состав 1) и имеющую титр 4,4 ˙ 107 кл/см3 культуральной жидкости. Культивирование ведут при 29+1оС в течение 24 ч. Получают накопительную культуру с титром 2,8 ˙ 108 кл/см3 культуральной жидкости.PRI me R 2. In a bioreactor with 9 l of a sterile nutrient medium composition (wt.): Penton with an initial inorganic phosphorus content of 4.5-5.0 mg / g 2.0; yeast extract with an initial inorganic phosphorus content of 10-11 mg / g 1.0; glucose 2.0 containing inorganic phosphorus 195-200 mg / l, at pH 5.0-5.5, a yeast culture is introduced in an amount of 1 l, grown on minimal medium (composition 1) and having a titer of 4.4 ˙ 10 7 cells / cm 3 of culture fluid. Cultivation is carried out at 29 + 1 about C for 24 hours. An accumulative culture is obtained with a titer of 2.8 ˙ 10 8 cells / cm 3 of culture fluid.
Культуру клеток в количестве 10 л переносят в биореактор, содержащий 70 л стерильной питательной среды состава (мас.): пептон с исходным содержанием неорганического фосфора 4,5-5,0 мг/г 1,0; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 10-11 мг/г 0,1; глюкоза 1,0; моли, микроэлементы, витамины (состав 2), содержащей фосфора неорганического 50 мг/г, при рН 5,5-6,0. Культивирование ведут при температуре 30оС в течение 48 ч. В процессе культивирования дополнительно подают, начиная с 10 ч роста, 18 л стерильной питательной среды состава (мас.): пептон с исходным содержанием неорганического фосфора 4,5-5 мг/г 5,0, глюкоза 42,0; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 10-11 мг/г 4,2 (или в соотношении 0,12: 1: 0,1 соответственно); соли, микроэлементы, витамины (состав 3). Культуральную жидкость, содержащую 8,8 ˙ 108 кл/см3 подвергают обработке аналогично описанному в примере 1.The cell culture in an amount of 10 l is transferred to a bioreactor containing 70 l of a sterile nutrient medium composition (wt.): Peptone with an initial inorganic phosphorus content of 4.5-5.0 mg / g 1.0; yeast extract with an initial inorganic phosphorus content of 10-11 mg / g 0.1; glucose 1.0; moths, trace elements, vitamins (composition 2), containing inorganic phosphorus 50 mg / g, at a pH of 5.5-6.0. Culturing was carried out at 30 ° C for 48 h cultivation process additionally fed, starting from 10 hours of growth, 18 l of a sterile nutrient medium composition (wt.). Peptone the original content of inorganic phosphorus 4.5-5 mg / g 5 , 0, glucose 42.0; yeast extract with an initial inorganic phosphorus content of 10-11 mg / g 4.2 (or in a ratio of 0.12: 1: 0.1, respectively); salts, trace elements, vitamins (composition 3). The culture fluid containing 8.8 ˙ 10 8 cells / cm 3 is subjected to processing as described in example 1.
Вес сырой биомассы составляет 6,2 кг, а количество осветленного гомогенизата 70 л, который содержит 32 мкг/мл антигена. Выход антигена 22,5 мг с одного литра культуральной жидкости. The weight of the raw biomass is 6.2 kg, and the amount of clarified homogenizate is 70 l, which contains 32 μg / ml antigen. The yield of antigen is 22.5 mg per liter of culture fluid.
П р и м е р 3. Процесс ведут аналогично примеру 2; на стадии выращивания биомассы используют питательную среду с содержанием неорганического фосфора 300 мг/л. Среду готовят из 2 мас. пептона с содержанием неорганического фосфора 8 мг/г и 1,0 мас. экстракта дрожжевого с исходным содержанием неорганического фосфора 15,0 мг/г. На стадии биосинтеза антигена используют питательную среду с содержанием неорганического фосфора 100 мг/л, составленную из 1,0 мас. пептона и 0,1 мас. экстракта дрожжевого с вышеуказанным содержанием неорганического фосфора. Питательную среду для дополнительной подачи готовят из вышеуказанных пептона и экстракта дрожжевого, взятых в соотношении пептон-глюкоза-экстракт дрожжевой, равном 0,20:1:0,20. Получают 8,0 кг сырой биомассы. Биосинтез антигена отсутствует. PRI me R 3. The process is carried out analogously to example 2; at the stage of growing biomass, a nutrient medium with an inorganic phosphorus content of 300 mg / l is used. The medium is prepared from 2 wt. peptone with an inorganic phosphorus content of 8 mg / g and 1.0 wt. yeast extract with an initial inorganic phosphorus content of 15.0 mg / g. At the stage of antigen biosynthesis, a nutrient medium with an inorganic phosphorus content of 100 mg / L, composed of 1.0 wt. peptone and 0.1 wt. yeast extract with the above inorganic phosphorus content. Nutrient medium for additional supply is prepared from the above peptone and yeast extract, taken in the ratio of peptone-glucose-yeast extract equal to 0.20: 1: 0.20. 8.0 kg of crude biomass are obtained. Antigen biosynthesis is absent.
П р и м е р 4. В биореактор с 9 л стерильной питательной среды состава (мас.) пептон с исходным содержанием неорганического фосфора 0,05 мг/г 3,0; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 10-11 мг/г 1,0; глюкоза 2,0, содержащей фосфора неорганического 105-110 мг/л, при рН 5,0-5,5 вносят культуру дрожжей в количестве 1 л, выращенную на минимальной среде (состав 1) и имеющую титр 4,3 ˙ 107 кл/см3 культуральной жидкости. Культивирование ведут при 29+1оС в течение 20 ч. Получают накопительную культуру с титром 2,3 ˙ 108 кл/см3 культуральной жидкости.PRI me R 4. In a bioreactor with 9 l of a sterile nutrient medium composition (wt.) Peptone with an initial inorganic phosphorus content of 0.05 mg / g 3.0; yeast extract with an initial inorganic phosphorus content of 10-11 mg / g 1.0; glucose 2.0, containing inorganic phosphorus 105-110 mg / l, at pH 5.0-5.5, a yeast culture in the amount of 1 l grown on minimal medium (composition 1) and having a titer of 4.3 ˙ 10 7 cells is introduced / cm 3 culture fluid. Cultivation is carried out at 29 + 1 about C for 20 hours. An accumulative culture is obtained with a titer of 2.3 ˙ 10 8 cells / cm 3 of culture fluid.
Культуру клеток в количестве 10 л переносят в биореактор, содержащий 70 л стерильной питательной среды состава (мас.): пептон с исходным содержанием неорганического фосфора 0,05 мг/г 1,5; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 10-11 мг/г 0,1; глюкоза 1,0; соли, микроэлементы, витамины (состав 2), содержащей фосфора неорганического 10 мг/л, при рН 5,5-6,0. Культивирование ведут при 30оС в течение 44 ч. В процессе культивирования дополнительно подают, начиная с 8 ч роста, 20 л стерильной питательной среды состава (мас.): пептон с исходным содержанием неорганического фосфора 0,05 мг/г 5,0; глюкоза 42,0; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 10-11 мг/г 4,2; соли, микроэлементы, витамины (состав 3). Соотношение пептон-глюкоза-экстракт дрожжевой составляет 0,12:1: 0,10. Получают культуральную жидкость, содержащую 7.8 ˙ 108 кл/см3. Отделение биомассы, освобождение биомассы от остатков питательной среды, разрушение клеток и осветление гомогенизата осуществляют аналогично описанному в примере 1. Получают 5,8 кг сырой биомассы и 70 л осветленного гомогенизата с содержанием антигена 30 мкг/мл. Выход антигена составляет 21,0 мг с одного литра культуральной жидкости.The cell culture in an amount of 10 l is transferred to a bioreactor containing 70 l of a sterile nutrient medium composition (wt.): Peptone with an initial inorganic phosphorus content of 0.05 mg / g 1.5; yeast extract with an initial inorganic phosphorus content of 10-11 mg / g 0.1; glucose 1.0; salts, trace elements, vitamins (composition 2), containing inorganic phosphorus 10 mg / l, at pH 5.5-6.0. Culturing was carried out at 30 ° C for 44 h cultivation process additionally fed starting at 8 hours of growth, 20 l of a sterile nutrient medium composition (wt.) Peptone the original content of inorganic phosphorus 0.05 mg / g 5.0;. glucose 42.0; yeast extract with an initial inorganic phosphorus content of 10-11 mg / g 4.2; salts, trace elements, vitamins (composition 3). The ratio of peptone-glucose-yeast extract is 0.12: 1: 0.10. Get a culture fluid containing 7.8 ˙ 10 8 cells / cm 3 . Separation of biomass, liberation of biomass from residues of the nutrient medium, cell destruction and clarification of the homogenizate is carried out similarly to that described in example 1. 5.8 kg of crude biomass and 70 l of clarified homogenisate with an antigen content of 30 μg / ml are obtained. The antigen yield is 21.0 mg per liter of culture fluid.
П р и м е р 5. Выращивание накопительной культуры, биосинтез антигена проводят в условиях, аналогичных описанным в примере 1. На стадии биосинтеза в ферментер дополнительно подают, начиная с 6 ч роста, 22 л стерильной питательной среды, состава (мас.): пептон из кислотного гидролизата казеина с исходным содержанием неорганического фосфора 0,5-0,6 мг/г 2,1; глюкоза 42,0; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 5,0-5,3 2,1 (или в отношении 0,05:1:0,05 соответственно); соли, микроэлементы, витамины (состав 3). Культуральную жидкость с содержанием клеток 6,3 ˙ 108 кл/см3 подают на центрифугу. Процедура отделения биомассы, промывки биомассы, разрушения клеток и осветления полученного гомогенизата аналогична примеру 1. Получают 4,7 кг сырой биомассы; количество осветленного гомогенизата с титром антигена 25 мкг/мл 70 л. Выход антигена составляет 17,5 мг с одного литра культуральной жидкости.PRI me R 5. The cultivation of the accumulative culture, the biosynthesis of antigen is carried out under conditions similar to those described in example 1. At the stage of biosynthesis in the fermenter additionally served, starting from 6 hours of growth, 22 l of sterile nutrient medium, composition (wt.): peptone from casein acid hydrolyzate with an initial inorganic phosphorus content of 0.5-0.6 mg / g 2.1; glucose 42.0; yeast extract with an initial inorganic phosphorus content of 5.0-5.3 2.1 (or in the ratio of 0.05: 1: 0.05, respectively); salts, trace elements, vitamins (composition 3). The culture fluid with a cell content of 6.3 ˙ 10 8 cells / cm 3 served on a centrifuge. The procedure for separating biomass, washing biomass, destroying cells and clarifying the resulting homogenizate is similar to Example 1. 4.7 kg of crude biomass are obtained; the amount of clarified homogenizate with an antigen titer of 25 μg / ml 70 l The antigen yield is 17.5 mg per liter of culture fluid.
П р и м е р 6. Отличается от примера 1 тем, что на стадии синтеза антигена в биореактор дополнительно подают, начиная с 6 ч роста, 20 л стерильной питательной среды состава (мас.): пептон с исходным содержанием неорганического фосфора 0,5-0,6 мг/г 6,90; глюкоза 46,0; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 2,0-2,5 мг/г 6,90 (или соотношении 0,15: 1: 0,15 соответственно); соли, микроэлементы, витамины (состав 3). Получают культуральную жидкость с титром клеток 8,0 ˙ 108 кл/см3, которую подвергают обработке аналогично описанному в примере 1.PRI me R 6. Differs from example 1 in that at the stage of synthesis of the antigen in the bioreactor additionally served, starting from 6 h of growth, 20 l of a sterile nutrient medium composition (wt.): Peptone with an initial content of inorganic phosphorus of 0.5 -0.6 mg / g 6.90; glucose 46.0; yeast extract with an initial inorganic phosphorus content of 2.0-2.5 mg / g 6.90 (or a ratio of 0.15: 1: 0.15, respectively); salts, trace elements, vitamins (composition 3). Get a culture fluid with a cell titer of 8.0 × 10 8 cells / cm 3 , which is subjected to processing as described in example 1.
Вес сырой биомассы составляет 5,9 кг, количество осветленного гомогенизата 70 л. Титр антигена в осветленном гомогенизате 35 мкг/мл. Выход антигена 24,5 мг с одного литра культуральной жидкости. The weight of raw biomass is 5.9 kg, the amount of clarified homogenizate is 70 l. The antigen titer in the clarified homogenizate is 35 μg / ml. The yield of antigen is 24.5 mg per liter of culture fluid.
Таким образом, предложенный способ позволяет в 80 раз повысить выход рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В и использовать сырье различного вида (пептон и экстракт дрожжевой как отечественные, так и различных фирм). Thus, the proposed method allows to increase the yield of the recombinant surface antigen of hepatitis B by 80 times and use various types of raw materials (peptone and yeast extract, both domestic and various companies).
Состав 1, мас. KH2PO4 0,100 NaCl 0,010 CaCl2 безводный 0,020 MgSO4 ˙ 7H2O 0,102 (NH4)2SO4 0,500 глюкоза 2,000 р-р микроэлементов 0,50 мл/л р-р витаминов 1,00 мл/л Дистил. вода До 100,0 Раствор микроэлементов, мг% KJ 20,0 H3BO3 2,0 MnSO4 2,0 MoO4(NH4)2 2,0 FeSO4 10,0 Дистил. вода До 100 мл Раствор витаминов, мг% Тиамин хлорид 20,00 Пиридоксин 20,00 Рибофлавин (моно- нуклеотид) 20,00 Пантотенат кальция 20,00 Никотиновая кислота 20,00 п-Аминобензойная кислота 20,00 Биотин 0,20 Инозитол 1000,0 Дистил. вода До 100 мл Состав 2, мас. KCl 0,100 NaCl 0,010 CaCl2 безводный 0,020 MgSO4 ˙ 7H2O 0,102 (NH4)2SO4 0,500 р-р микроэлементов 0,50 мл/л
(см. состав 1) р-р витаминов 1,00 мл/л
(см. состав 1) Состав 3, мас. KCl 0,350 NaCl 0,035 CaCl2 безводный 0,070 MgSO4 ˙ 7H2O 0,350 р-р микроэлементов 1,75 мл/л
(см. состав 1) р-р витаминов 3,50 мл/л
(см. состав 1)Composition 1, wt. KH 2 PO 4 0,100 NaCl 0,010 CaCl 2 anhydrous 0,020 MgSO 4 ˙ 7H 2 O 0,102 (NH 4 ) 2 SO 4 0,500 glucose 2,000 microelements 0.50 ml / l vitamins 1.00 ml / l Dist. water Up to 100.0 Micronutrient solution, mg% KJ 20.0 H 3 BO 3 2.0 MnSO 4 2.0 MoO 4 (NH 4 ) 2 2.0 FeSO 4 10.0 Dist. water Up to 100 ml Vitamin solution, mg% Thiamine chloride 20.00 Pyridoxine 20.00 Riboflavin (mononucleotide) 20.00 Calcium pantothenate 20.00 Nicotinic acid 20.00 p-Aminobenzoic acid 20.00 Biotin 0.20 Inositol 1000 , 0 Dist. water Up to 100 ml Composition 2, wt. KCl 0,100 NaCl 0,010 CaCl 2 anhydrous 0,020 MgSO 4 ˙ 7H 2 O 0,102 (NH 4 ) 2 SO 4 0,500 micronutrient solution 0.50 ml / l
(see structure 1) solution of vitamins 1.00 ml / l
(see composition 1) Composition 3, wt. KCl 0.350 NaCl 0.035 CaCl 2 anhydrous 0.070 MgSO 4 ˙ 7H 2 O 0.350 micronutrient solution 1.75 ml / l
(see structure 1) solution of vitamins 3.50 ml / l
(see composition 1)
Claims (1)
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5025861/14A RU2045760C1 (en) | 1991-12-27 | 1991-12-27 | Method for preparing of recombinant surface antigen of hepatitis b |
| AU32697/93A AU3269793A (en) | 1991-12-27 | 1992-12-25 | Method for obtaining recombinant surface antigen of hepatitis B, antigen and vaccine based on it |
| PCT/RU1992/000258 WO1993012815A1 (en) | 1991-12-27 | 1992-12-25 | Method for obtaining recombinant surface antigen of hepatitis b, antigen and vaccine based on it |
| CN93101738A CN1090324A (en) | 1991-12-27 | 1993-01-20 | It is the antigen and the vaccine of base that the preparation method of hepatitis B recombinant chou surface antigen reaches with it |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5025861/14A RU2045760C1 (en) | 1991-12-27 | 1991-12-27 | Method for preparing of recombinant surface antigen of hepatitis b |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2045760C1 true RU2045760C1 (en) | 1995-10-10 |
Family
ID=21596177
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU5025861/14A RU2045760C1 (en) | 1991-12-27 | 1991-12-27 | Method for preparing of recombinant surface antigen of hepatitis b |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2045760C1 (en) |
-
1991
- 1991-12-27 RU SU5025861/14A patent/RU2045760C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WO 87/01129, кл. C 12N 5/00, 1987. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SU943282A1 (en) | Process for producing l-treonine | |
| RU2208640C2 (en) | Methof for preparing l-arginine, strain escherichia coli as producer of l-arginine | |
| JPS63164891A (en) | Production of human tumor necrosis factor by yeast | |
| Goebel et al. | Generation of higher multiple circular DNA forms in bacteria. | |
| JPH06169785A (en) | Production of aromatic amino acid | |
| US7479381B1 (en) | Production of itaconic acid by Pseudozyma antarctica | |
| CA2063511C (en) | Method for producing human serum albumin | |
| JPS6115695A (en) | Preparation of l-isoleucine by fermentation method | |
| RU2089216C1 (en) | Method of removing endotoxin from the strain bordetella pertussis cultural fluid phase i | |
| RU2045760C1 (en) | Method for preparing of recombinant surface antigen of hepatitis b | |
| US5416019A (en) | Rhodococcus microorganisms that produce phenylalanine dehydroganase | |
| US3440142A (en) | Production of asparaginase | |
| RU2045073C1 (en) | Method of preparing recombinant surface antigen of hepatitis b | |
| EP0123903A2 (en) | Method for producing L-aspartic acid | |
| US4407953A (en) | Fermentation process for production of alpha-isopropylmalic acid | |
| JPH10127298A (en) | Fermentation by controlling osmol concentration for preparation of acarbose | |
| JP2952604B2 (en) | Production of amino acids by fermentation | |
| EP0071485B1 (en) | Novel microorganisms derived from microorganisms of the genus escherichia by mutation and their use in the preparation of glutathione | |
| SU974817A1 (en) | Method of producing l-treonin | |
| US3116218A (en) | Process for the production of penicillin-splitting enzyme preparations | |
| KR890003714B1 (en) | Process for preparing l-phenylalanine by microorganism of gene manipulation | |
| CA1192157A (en) | Fermentative preparation of l-leucine | |
| CA1192156A (en) | Fermentative preparation of l-leucine | |
| JPH03198791A (en) | Augmentation and expression of differentiated protein by recombinant host in nonnutritive medium | |
| JP2001517429A (en) | Fermentation method for producing valuable biological substances using continuous mass culture of ciliates (protozoa) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20041228 |