RU2043362C1 - Method of solid-phase peptide synthesis - Google Patents

Method of solid-phase peptide synthesis Download PDF

Info

Publication number
RU2043362C1
RU2043362C1 SU5001257A RU2043362C1 RU 2043362 C1 RU2043362 C1 RU 2043362C1 SU 5001257 A SU5001257 A SU 5001257A RU 2043362 C1 RU2043362 C1 RU 2043362C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
protected
arg
side chain
group
protection
Prior art date
Application number
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Джозеф Нестор Джон (младший)
Левис МакКлюр Натали
Арзено Хумберто
Original Assignee
Синтекс (Ю-Эс-Эй) Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Синтекс (Ю-Эс-Эй) Инк. filed Critical Синтекс (Ю-Эс-Эй) Инк.
Priority to SU5001257 priority Critical patent/RU2043362C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2043362C1 publication Critical patent/RU2043362C1/en

Links

Abstract

FIELD: peptide chemistry. SUBSTANCE: method of solid-phase synthesis of peptides of the general formula (I) R1-R2-R3-Ser-Tyr-R4-heu-R5-Pro-R6, where R1= nupo-Glu, N-Ac D Nal; R2=His, Dp Cl Phe, Dp F Phe, R3=Trp, D-Trp; R4=D Nal(2); Dh Arg(Et)2, Dh Arg(Bu), Dh Arg(CH2CF3)2, R5=Arg, L-Arg(Et)2, L-hArg(Bu), L-hArg(CH2CF3)2; R6= GlyNH2; DAla NH2 involves addition of N-protected terminal amino acids to inert solid carrier followed by increment of N-protected amino acids to the joining peptide chain. Side chain of serine residue is protected temporarily with the group showing lability with relation to agents which were used for removal of alpha-aminoprotected groups. Side chain of histidine (if it is present) is protected with the group showing lability with relation to alpha-aminodeblocking agent. At the end of each cycle protected groups were removed, polypeptide is desplit from carrier, and aminolysis or ammonolysis is used, and synthesized compound of the formula (I). EFFECT: improved method of synthesis.

Description

Изобретение относится к твердофазному синтезу аналога гормона, высвобождающего лютеинизирующий гормон (ЛН-рилизинг гормона), путем метода минимальной защиты. The invention relates to the solid-phase synthesis of an analogue of a hormone releasing luteinizing hormone (LH-releasing hormone) by the method of minimal protection.

Аналоги ЛГ-рилизинг гормона (далее упоминается как ЛГ-РГ) представляют собой нона- или декапептиды, которые структурно связаны с ЛГ-РГ и проявляют биологическую активность, аналогичную активности ЛГ-PГ. Аналоги являются предметом широкого клинического исследования вследствие их продемонстрированной способности облегчать симптомы эндометриоза, рака предстательной железы, преждевременного полового созревания и других гормонально-опосредованных заболеваний. Несмотря на то, что определенные аналоги ЛГ-РГ в настоящее время пригодны для терапевтического использования, их синтез является сложным процессом, а следовательно, и дорогостоящая методика их получения повышает стоимость аналогов, так необходимых при лечении. Аналоги ЛГ-РГ традиционно описываются либо как агонисты, либо как антагонисты, в зависимости от образа их действия. Analogs LH-releasing hormone (hereinafter referred to as LH-RH) are non- or decapeptides that are structurally linked to LH-RH and exhibit biological activity similar to that of LH-RH. Analogs are the subject of extensive clinical research because of their demonstrated ability to alleviate the symptoms of endometriosis, prostate cancer, premature puberty, and other hormone-mediated diseases. Despite the fact that certain analogues of LH-RG are currently suitable for therapeutic use, their synthesis is a complex process, and consequently, an expensive method for their preparation increases the cost of analogues that are so necessary for treatment. LH-RG analogs are traditionally described as either agonists or antagonists, depending on their mode of action.

Аналоги ЛГ-РГ в соответствии с изобретением представляют собой нона- и декапептиды и включают как агонистов, так антагонистов. Примерами агонистов ЛГ-РГ, являющихся пригодными в настоящем изобретении, могут стать нафарелин, лейпрорелин, бусерелин, госерелин, гистерелин, трипторелин, и деслорелин, причем они отличаются от ЛГ-РГ природного происхождения замещением остатка глицина в положении 6 D-аминокислотой. Синтетические агонисты имеют заодно с гормоном природного происхождения, гистидин в положении 2, серин в положении 4, и тирозин в положении 5, причем все эти остатки имеют реакционоспособные боковые цепи, которые могут стать синтетическими трудностями. The LH-RG analogs of the invention are non- and decapeptides and include both agonists and antagonists. Examples of LH-RH agonists that are useful in the present invention include nafarelin, leuprorelin, buserelin, goserelin, hysterelin, triptorelin, and deslorelin, and they differ from LH-RH of natural origin by substituting the glycine residue at position 6 of the D-amino acid. Synthetic agonists are associated with a naturally occurring hormone, histidine at position 2, serine at position 4, and tyrosine at position 5, all of these residues having reactive side chains, which can become synthetic difficulties.

Антагонисты ЛГ-РГ отличаются от ЛГ-РГ природного происхождения, как правило, делецией или замещением остатка гистицидина в положении 2. С точки зрения синтетической перспективы делеция гистидина снижает вероятность возникновения нежелательных побочных реакций, однако, присутствие серина и тирозина все же требует принятия специальных мер с целью устранения возникновения побочных цепных реакций. LH-RH antagonists differ from naturally-occurring LH-RH, as a rule, by deletion or substitution of the histicidin residue at position 2. From a synthetic perspective, a histidine deletion reduces the likelihood of adverse reactions, however, the presence of serine and tyrosine still requires special measures in order to eliminate the occurrence of adverse chain reactions.

Аналоги ЛГ-РГ могут быть синтезированы различными методами, такими, как например, описанные ДжМ.Стюартом и Дж.Д.Янгом, Твердофазный Пептидный Синтез, Уи. Х. Фриман Ко. Сан-Франциско, 1969; Дж.Мейненхофером, Гормональные Белки и Пептиды, Том 2, стр.46, Академик Пресс (Нью-Йорк), 1973; и Е.Шредером и К.Любке, Пептиды, Том l", Академик Пресс (Нью-Йорк), 1965. Методы могут быть в широком смысле охарактеризованы либо как растворно-фазные, либо как твердо-фазные методики. Оба метода включают последовательное прибавление аминокислот в растущую пептидную цепь. Обычно, или амино-, или карбоксильную группу первой аминокислоты защищают посредством пригодной защитной группы. Защищенную аминокислоту затем можно либо присоединить к инертному твердому носителю либо использовать в растворе путем прибавления следующей защищенной аминокислоты в последовательности при условиях, пригодных для образования амидной связи. Защитную группу затем отщепляют от этого вновь прибавленного аминокислотного остатка, после чего осуществляют прибавление следующей аминокислтоы, и так далее. После того, как все требуемые аминокислоты присоединены в должной последовательности, любые оставшиеся защитные группы и любой твердый носитель удаляются с получением конечного полипептида. Путем простой модификации данной общей методики можно прибавить более одной аминокислоты за одно время в растущую цепь, например, путем сочленения защищенного трипептида с защищенным дипептидом, что позволяет получить пентапептид. LH-RH analogs can be synthesized by various methods, such as, for example, described by J.M. Stuart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Yi. H. Freeman Co. San Francisco, 1969; J. Meinenhofer, Hormone Proteins and Peptides, Volume 2, p. 46, Academician Press (New York), 1973; and E. Schroeder and C. Lyubke, Peptides, Volume l, Academician Press (New York), 1965. Methods can be broadly described as either solution-phase or solid-phase methods. Both methods include sequential addition amino acids into the growing peptide chain. Usually, either the amino or carboxyl group of the first amino acid is protected by a suitable protecting group. The protected amino acid can then either be attached to an inert solid carrier or used in solution by adding the following protected amine slots in sequence under conditions suitable for the formation of an amide bond.The protective group is then cleaved from this newly added amino acid residue, after which the next amino acid is added, and so on. After all the required amino acids are attached in the proper sequence, any remaining protective groups and any solid support is removed to give the final polypeptide. By simple modification of this general procedure, more than one amino acid can be added at a time to p a growing chain, for example, by combining a protected tripeptide with a protected dipeptide, which makes it possible to obtain a pentapeptide.

Более строгие условия твердофазного синтеза обычно требуют, чтобы любые реакционноспособные боковые цепи на аминокислотах были защищены во время образования амидной связи. Защитные группы боковой цепи обычно отщепляют в отдельной стадии после отщепления образованного полипептида от инертного носителя, или совместно с этим отщеплением. More stringent solid state synthesis conditions usually require that any reactive amino acid side chains be protected during the formation of the amide bond. Side chain protecting groups are usually cleaved in a separate step after cleavage of the formed polypeptide from an inert carrier, or together with this cleavage.

Один особенно пригодный метод твердофазного синтеза с целью получения аналогов ЛГ-РГ описан в патенте США N 4234571 (Нестор и др.), раскрытие которого введено в данное описание в качестве отсылки. При таком общем подходе функцию α -амино (Nα ) каждой аминокислоты защищают группой, чувствительной к кислоте или основанию, такой, как трет-бутилоксикарбонил (Вос); любые реакционноспособные боковые цепи, как например, присутствующие на серине, гистидине и тирозине, также защищают сильно связанными группами, которые требуют обработки фторoводородом (HF) или подобных радикальных методик, для их отщепления. Кроме того, отщепление -аминозащитных групп и защитных групп в боковой цепи обычно осуществляют в отдельной стадии. Данный подход является достаточным для получения исследовательских количеств пептидов, однако при крупномасштабном производстве пептидов эти методы являются недостаточными. Аминокислоты с полностью защищенными боковыми цепями являются дорогостоящими, а такие расходы могут стать существенным фактором при коммерческом производстве пептидов. Кроме того, использование фтороводорода, не говоря уже об отравлении окружающей среды, приводит к коммерчески неприемлемым потерям в выходе продукта. И что более важно, вследствие использования отдельной производственной стадии для отщепления защитных групп боковой цепи синтетический процесс требует дополнительного времени и стоимости.One particularly suitable solid phase synthesis method for the preparation of LH-RH analogues is described in US Pat. No. 4,243,571 (Nestor et al.), The disclosure of which is incorporated herein by reference. With this general approach, the function of the α-amino (N α ) of each amino acid is protected by an acid or base sensitive group, such as tert-butyloxycarbonyl (Boc); any reactive side chains, such as those present on serine, histidine, and tyrosine, are also protected by strongly bonded groups that require treatment with hydrogen fluoride (HF) or similar radical techniques to cleave them. In addition, the cleavage of β-amino protecting groups and protecting groups in the side chain is usually carried out in a separate step. This approach is sufficient to obtain research quantities of peptides, however, with large-scale production of peptides, these methods are insufficient. Amino acids with fully protected side chains are expensive, and such costs can be a significant factor in the commercial production of peptides. In addition, the use of hydrogen fluoride, not to mention environmental poisoning, leads to commercially unacceptable losses in product yield. And more importantly, due to the use of a separate production stage for the cleavage of the protective groups of the side chain, the synthetic process requires additional time and cost.

Альтернативные способы не более привлекательны. Тиен и др. Pept. Chem. 375-379, Т, Шиба и С.Сакакибара (Ред.), Организация по Исследованию Белков, Осака (1088), изложили синтез ЛГ-РГ с использованием тозил-защиты относительно гистидина и бензил-защиты относительно тирозина и серина. Данный подход устраняющий необходимость использования фтороводорода, все же предполагает наличие отдельной стадии дегидрирования с целью отщепления бензил-защитных групп; при этом происходит некоторое восстановление триптофана. Alternative methods are no more attractive. Thien et al. Pept. Chem. 375-379, T, Shiba, and S. Sakakibara (Ed.), Organization for the Study of Proteins, Osaka (1088), described the synthesis of LH-RG using tosyl protection against histidine and benzyl protection against tyrosine and serine. This approach, which eliminates the need to use hydrogen fluoride, still presupposes a separate dehydrogenation step in order to cleave the benzyl protective groups; in this case, some recovery of tryptophan occurs.

Кой Д.Х. и др. Int. I. Peptide Protein Res. 14, 339-343 (1979), приводят синтез антагонистов ЛГ-РГ, (D-Phe2, D-Trp3, D-Jhe6) ЛГ-РГ, с использованием целого ряда методов защиты боковой цепи, при этом все они предполагают освобождение HF от защиты; в результате чего обеспечивается бензил-защита боковой цепи только серина, тозил-защита боковой цепи только аргинина, защита боковой цепи серина и аргинина, а также защита боковой цепи серина, аргинина и тирозина (с 2-бромбензил-оксикарбонилом). Солевая защита аргинина (в виде Arg HCl) также используется в синтезе "только серина". Фтороводород используют для отщепления неочищенного пептида от его носителя, а также для отщепления защитных групп боковой цепи. Только когда пептид "полностью" незащищен (и только солевая защита относительно аргинина), тогда только авторы патента могут избежать фторидной обработки. Все виды синтеза с защитой приводят к плохим результатам по сравнению с синтезом с незащищенной боковой цепью.Coy D.H. et al. Int. I. Peptide Protein Res. 14, 339-343 (1979), summarize the synthesis of LH-RH antagonists, (D-Phe 2 , D-Trp 3 , D-Jhe 6 ) LH-RH, using a variety of side chain protection methods, all of which suggest HF exemption; as a result, benzene protection of the side chain of only serine is provided, tosyl protection of the side chain of only arginine, protection of the side chain of serine and arginine, as well as protection of the side chain of serine, arginine and tyrosine (with 2-bromobenzyl-hydroxycarbonyl). Salt protection of arginine (in the form of Arg HCl) is also used in the synthesis of "serine only". Hydrogen fluoride is used to cleave the crude peptide from its carrier, as well as to cleave side chain protecting groups. Only when the peptide is “completely” unprotected (and only salt protection relative to arginine), then only the authors of the patent can avoid fluoride treatment. All types of synthesis with protection lead to poor results compared to synthesis with an unprotected side chain.

Кой и др. далее приводят синтез агониста ЛГ-РГ: этиламида (D-Leu6, дес Gly-NH2 10)-ЛГ-РГ, с использованием защиты боковой цепи динитрофенилом относительно только гистидина, солевой защиты аргинина, но без обработки HF. Динитрофенильную защитную группу боковой цепи отщепляют во время отщепления пептида от его носителя с помощью раствора этиламина в диметилформамиде. Выход в результате синтеза с защитой только гистидина составляет лишь 34% по сравнению с выходом в результате синтеза с полной защитой и обработкой HF. Отсутствует сравнение с незащищенным синтезом.Coy et al. Further describe the synthesis of an LH-RH agonist: ethylamide (D-Leu 6 , des Gly-NH 2 10 ) -LH-RG, using side-chain protection with dinitrophenyl relative to histidine alone, salt protection of arginine, but without HF treatment. The side chain dinitrophenyl protecting group is cleaved off during cleavage of the peptide from its carrier with a solution of ethylamine in dimethylformamide. The yield from synthesis with the protection of histidine alone is only 34% compared to the yield from synthesis with full protection and HF treatment. There is no comparison with unprotected synthesis.

Известные технические решения предполагают, что среди различных стратегий минимальной защиты защита только гистидина может привести к повышению выхода по сравнению с синтезом на основе полной защиты в отношении некоторых антагонистов ЛГ-РГ, однако никакой определенной выгоды нельзя извлечь в результате рассмотрения приведенных подходов к защите боковой цепи в отношении агонистов ЛГ-РГ. Known technical solutions suggest that among the various strategies for minimal protection, the protection of only histidine can lead to an increase in yield compared to the synthesis based on full protection against some LH-RH antagonists, however, no definite benefit can be derived from the consideration of the above approaches to side chain protection against agonists of LH-RG.

Тем временем, как идеальный подход к устранению стадии освобождения от защиты HF можно осуществлять в отношении незащищенного синтеза, отсутствие защиты для гистидина приводит к избыточной рацемизации. В соответствии с доктриной Коя и др. заявитель, однако, обнаружил, что использование защиты только гистидина также приводит к получению высоких уровней примеси бис-серина, вследствие ацилирования остатка серина. С целью достижения синтеза с минимальной защитой в отношении аналогов ЛГ-РГ без проведения стадии освобождения от защиты необходимо значительное усовершенствование по сравнению с известными техническими решениями, которое может также обеспечить защиту для тех групп, которые, когда незащищены, оказывают отрицательное влияние на чистоту и выход пептида. Meanwhile, as the ideal approach to eliminating the HF deprotection step can be carried out with respect to unprotected synthesis, the lack of protection for histidine leads to excessive racemization. In accordance with the doctrine of Koy et al., The applicant, however, found that using only histidine protection also results in high levels of bis-serine impurities due to the acylation of the serine residue. In order to achieve synthesis with minimal protection in relation to LH-RH analogues without carrying out the stage of exemption from protection, a significant improvement is required in comparison with the known technical solutions, which can also provide protection for those groups that, when unprotected, adversely affect cleanliness and yield peptide.

Целью изобретения является создание способа синтеза аналогов ЛГ-РГ, в котором защищены боковые цепи только минимального числа аминокислотных остатков. The aim of the invention is to provide a method for the synthesis of LH-RH analogues in which side chains of only a minimum number of amino acid residues are protected.

Другой целью изобретения является создание способа синтеза аналогов ЛГ-РГ, который устраняет необходимость освобождения от защиты HF, а также необходимость использования токсичного HF-реагента, уменьшая токсичный отработанный поток, часто встречающийся в традиционных способах. Another objective of the invention is the creation of a method for the synthesis of LH-RH analogues, which eliminates the need for HF protection and the need to use a toxic HF reagent, reducing the toxic waste stream that is often found in traditional methods.

Упомянутые аспекты изобретения создают дополнительные преимущества, заключающиеся в снижении стоимости получения соединений лГ-РГ, а также в устранении дополнительной стадии отщепления защитных групп боковой цепи. The aforementioned aspects of the invention provide additional advantages, consisting in reducing the cost of obtaining compounds lH-RH, as well as in eliminating the additional stage of cleavage of the protective groups of the side chain.

Цели изобретения достигаются в отношении аналогов ЛГ-РГ с использованием способа временной минимальной защиты, при которой только гидроксильная боковая цепь аминокислотного остатка защищена группой, которую отщепляют сразу же после связывания серина с пептидной цепью. Защитная группа боковой цепи является группой, лабильной при тех же условиях, которые пригодны для отщепления α-амино защитных групп. Для тех аналогов ЛГ-РГ, которые содержат остаток гистидина, боковую цепь имидазола также можно защитить группой, лабильной в течение цикла связывания, преимущественно, лабильной для агента разблокировки α -аминогруппы, однако, по выбору, она может быть защищена группой, отщепляемой аминозилом или аммонолизом. The objectives of the invention are achieved in relation to analogues of LH-RG using a method of temporary minimal protection, in which only the hydroxyl side chain of the amino acid residue is protected by a group that is cleaved immediately after binding of serine to the peptide chain. The side chain protecting group is a labile group under the same conditions as are suitable for the removal of α-amino protecting groups. For those LH-RH analogues that contain a histidine residue, the side chain of imidazole can also be protected with a group labile during the binding cycle, predominantly labile for the unlocking agent of the α-amino group, however, it can optionally be protected with an amino-cleavable group or ammonolysis.

Временная защита боковой цепи серина и защита боковой цепи гистидина, если только имеется в наличии, минимизирует образование примесей и максимизирует выход продукта без необходимости в стадии освобождения от защиты HF. Temporary protection of the serine side chain and protection of the histidine side chain, if present, minimizes the formation of impurities and maximizes product yield without the need for a HF protection release step.

Способ временной минимальной защиты в соответствии с изобретением приемлем для твердофазного синтеза любого сериносодержащего полипептида, имеющего от нескольких до множества остатков, не взирая на остальную часть последовательности. Аналоги ЛГ-РГ, а также другие нона- и декапептиды являются предпочтительными синтетическими мишенями. The method of temporary minimal protection in accordance with the invention is acceptable for solid-phase synthesis of any serine-containing polypeptide having from several to many residues, regardless of the rest of the sequence. LH-RG analogs, as well as other nona- and decapeptides, are preferred synthetic targets.

Несмотря на то, что изобретение описано с учетом последовательного прибавления отдельных аминокислот, специалист в данной области техники поймет, что способ в равной мере приемлем для синтеза, в котором блоки меньших полипептидов связывают с образованием более крупных полипептидов, например, путем прибавления тетрапептида к пентапептиду, при условии, что боковая цепь остатков серина временно защищена в течение цикла связывания серина. Although the invention has been described with the sequential addition of individual amino acids, one skilled in the art will understand that the method is equally acceptable for synthesis in which blocks of smaller polypeptides are linked to form larger polypeptides, for example, by adding a tetrapeptide to a pentapeptide, provided that the side chain of serine residues is temporarily protected during the serine binding cycle.

Временная защита означает, что боковая цепь серина защищена в течение относительно короткого периода синтетического цикла. Защитная группа боковой цепи и α-амино и карбоксильная защитная группа отщепляются одновременно после осуществления связывания серина. Как правило, решающим критерием отбора защитной группы боковой цепи серина является тот факт, чтобы группа была устойчивой к условиям связывания, однако лабильной к условиям освобождения от защиты α-аминогруппы. В одном варианте настоящего изобретения с использованием α-аминозащиты боковую цепь серина предпочтительно защищают группой, выбранной из трет-бутила, трет-бутилдиметилсилила, триметилсилила, тритила, пивалила и тетрагидропиран-2-ила. Temporary protection means that the serine side chain is protected for a relatively short period of the synthetic cycle. The side chain protecting group and the α-amino and carboxy protecting group are cleaved off simultaneously after serine binding. As a rule, the decisive criterion for the selection of the protective group of the serine side chain is the fact that the group is resistant to the binding conditions, but labile to the conditions of the release of the protection of the α-amino group. In one embodiment of the present invention, using α-amino protection, the serine side chain is preferably protected with a group selected from tert-butyl, tert-butyldimethylsilyl, trimethylsilyl, trityl, pivalyl and tetrahydropyran-2-yl.

Для тех аналогов ЛГ-РГ, которые имеют остатки гистидина, как правило, желательно защищать боковую цепь имидазола. Эта защита также может иметь разновидность временной, то есть лабильной во время цикла связывания, или может оставаться на месте до тех пор, пока пептид не будет отщеплен от своего носителя. Предпочтительно, аминолиз или аммонолиз используют для отщепления полимера от своего носителя, и одновременно отщепляют защитную группу для гистидина. For those LH-RH analogues that have histidine residues, it is generally desirable to protect the side chain of imidazole. This protection may also be temporary, that is, labile during the binding cycle, or may remain in place until the peptide is cleaved from its carrier. Preferably, aminolysis or ammonolysis is used to cleave the polymer from its carrier, and at the same time, the histidine protecting group is cleaved.

В другом варианте изобретения агент разблокировки выбирают из растворов хлористого водорода в С3-С6-спиртах и дихлорметане. Предпочтительно, отношение спирта к дихлорметану составляет от 0,1 до 10,0 (об.), а концентрация кислоты составляет от 2 до 9 н. Наиболее предпочтительно, спиртом является изопропанол.In another embodiment of the invention, the unlocking agent is selected from solutions of hydrogen chloride in C 3 -C 6 alcohols and dichloromethane. Preferably, the ratio of alcohol to dichloromethane is from 0.1 to 10.0 (vol.), And the concentration of acid is from 2 to 9 N. Most preferably, the alcohol is isopropanol.

Сокращения и Определения
Для изобретения выражение "ЛГ-РГ" относится к гормону, высвобождаемому лютеинизирующий гормон, и "аналоги Лг-РГ" подразумевают сам ЛГ-РГ, а также другие полипептиды, которые структурно связаны с ЛГ-РГ или происходят от него, и которые проявляют биологическую активность, аналогичную активности ЛГ-РГ.Abbreviations and Definitions
For the invention, the expression "LH-RH" refers to the hormone released by the luteinizing hormone, and "Lg-RH analogs" mean LH-RH itself, as well as other polypeptides that are structurally associated with or derived from LH-RH, and which exhibit biological activity similar to the activity of LH-RG.

Сокращения для различных традиционных аминокислот рекомендованы Комиссией по Биохимической Номенклатуре Международного союза теоретической и прикладной химии Международного биохимического союза (ИЮПАК-МБС), Биохимия, 11, 1726 (1972). Все упоминаемые здесь пептидные последовательности написаны в соответствии с общепринятой конвенцией, где N концевая аминокислота находится слева и С-концевая аминокислота находится справа. Abbreviations for various traditional amino acids are recommended by the Commission on Biochemical Nomenclature of the International Union of Theoretical and Applied Chemistry of the International Biochemical Union (IUPAC-MBS), Biochemistry, 11, 1726 (1972). All peptide sequences mentioned herein are written in accordance with the generally accepted convention, where the N-terminal amino acid is on the left and the C-terminal amino acid is on the right.

Сокращения, приводимые здесь, представляют L-аминокислоты, за исключением ахирального аминокислотного глицина, и за другим исключением любой ненатуральной аминокислоты, которая является ахиральной, или же аминокислоты обозначены как D- или D, L-. Et обозначает этил. Bu обозначает бутил и iPr обозначают изопропил. Другие сокращения, пригодные при описании изобретения, включают замещения аминокислот в натуральном пептиде ЛГ-РГ следующими аминокислотными остатками:
Аминокислотный Сокращение
остаток 3-(2-нафтил)аланил Nal (2) 3-(п-фторфенил)аланил р-F-Phe 3-(п-хлорфенил)аланил р-Cl-Phe 3-(3-пиридил)аланил Pal (3)
NG,NG'-бис(этил)гомо- аргинил hArg (Et)2
NG,NG'-бис(2,2,2-
трифторэтил)гомо- аргинил hArg (CH2CF3)2 NG-бутил-гомоаргинил hArg (Bu) NE-Изопропил-лизил Lys (iPr) (бензил)гистидил His (Bzl)
Термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к солям, которые сохраняют требуемую биологическую активность родственного соединения без побочных токсикологических эффектов. Примерами таких солей являются кислые аддитивные соли, образованные неорганическими кислотами, например, хлористоводородной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой и так далее; и соли, образованные органическими кислотами, такими, как, например, уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, глюконовая кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталинсульфокислота, нафталиндисульфокислота, полигалактуроновая кислота и так далее.The abbreviations given here represent L-amino acids, with the exception of achiral amino acid glycine, and with the exception of any unnatural amino acid that is achiral, or the amino acids are designated as D- or D, L-. Et is ethyl. Bu is butyl and iPr is isopropyl. Other abbreviations useful in describing the invention include amino acid substitutions in the natural LH-RH peptide with the following amino acid residues:
Amino Acid Reduction
residue 3- (2-naphthyl) alanyl Nal (2) 3- (p-fluorophenyl) alanyl p-F-Phe 3- (p-chlorophenyl) alanyl p-Cl-Phe 3- (3-pyridyl) alanyl Pal (3 )
N G , N G ' bis (ethyl) homo-arginyl hArg (Et) 2
N G , N G ' bis (2,2,2-
trifluoroethyl) homo-arginyl hArg (CH 2 CF 3 ) 2 N G -butyl-homoarginyl hArg (Bu) N E -Isopropyl-lysyl Lys (iPr) (benzyl) histidyl His (Bzl)
The term "pharmaceutically acceptable salts" refers to salts that retain the desired biological activity of a related compound without toxicological side effects. Examples of such salts are acid addition salts formed by inorganic acids, for example, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, and so on; and salts formed by organic acids, such as, for example, acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, gluconic acid, citric acid, malic acid, ascorbic acid, alginic acid, polyglutamic acid, naphthalene sulfonic acid , naphthalene disulfonic acid, polygalacturonic acid and so on.

Сокращение "N-Ac" относится конкретно к N-ацетил-защитной группе, то есть, ацетильной группе, присоединенной к концевому аминокислотному осстатку на аминном азоте, в соответствии с общепринятой номенклатурой. The abbreviation "N-Ac" refers specifically to the N-acetyl protecting group, that is, the acetyl group attached to the terminal amino acid residue on amine nitrogen, in accordance with generally accepted nomenclature.

Предпочтительные варианты
В одном варианте осуществления изобретения предлагается усовершенствованный способ минимальной защиты для твердофазного синтеза соединения, имеющего аминокислотную последовательность формулы:
R1-R2-R3-Ser-Tyr-R4-Leu-R5-Rro-R6 (1) где R1 выбирают из (пиро) Glu и N-Ac-D-Nal (2); R2 выбирают из His. D-p-Cl-Phe и D-p-F-Phe; R3 выбирают из Trp. D-Trp. R4 выбирают из D-Nal- (2), D-hArg (Et)2. D-hArg (Bu), D-hArg (CH2CF3)2. R5 выбирают из Arg, L-hArg (Et)2, D-hArg (Bu), D-hArg- (CH2CF3)2. R6 выбирают из Cly-NH2, D-Ala-NH2, причем аминокислоты обеспечены Nα -защитой, отличающийся тем, что осуществляют (а) временную защиту боковой цепи серина в положении 4, пригодно, с помощью группы, лабильной к тем агентам, которые пригодны для отщепления α-аминозащитных групп, без проведения рацемизации, побочных реакций или отщепления растущего пептида от его полимерного носителя, и (b) защиту боковой цепи гистидина, если присутствует, с помощью группы, лабильной к агенту разблокировки α-аминогруппы или к аминолизу или аммонолизу.Preferred Options
In one embodiment, the invention provides an improved method of minimum protection for solid-phase synthesis of a compound having the amino acid sequence of the formula:
R 1 -R 2 -R 3 -Ser-Tyr-R 4 -Leu-R 5 -Rro-R 6 (1) where R 1 is selected from (pyro) Glu and N-Ac-D-Nal (2); R 2 selected from His. Dp-Cl-Phe and DpF-Phe; R 3 selected from Trp. D-Trp. R 4 is selected from D-Nal- (2), D-hArg (Et) 2 . D-hArg (Bu), D-hArg (CH 2 CF 3 ) 2 . R 5 is selected from Arg, L-hArg (Et) 2 , D-hArg (Bu), D-hArg- (CH 2 CF 3 ) 2 . R 6 is selected from Cly-NH 2 , D-Ala-NH 2 , and the amino acids are provided with N α -protection, characterized in that they carry out (a) temporary protection of the serine side chain at position 4, suitably with a group labile to those agents that are suitable for cleavage of the α-amino protecting groups without racemization, adverse reactions or cleavage of the growing peptide from its polymer carrier, and (b) protecting the histidine side chain, if present, with a group labile to the α-amino group release agent or to aminolysis or ammonolysis.

В другом варианте осуществления изобретения предлагается способ временной минимальной защиты для твердофазного синтеза соединения формулы (l), в котором (а) защищают α-аминогруппы аминокислот в полипептиде, (b) защищают боковую цепь серина с помощью группы, лабильной к тем агентам, которые пригодны для отщепления α-аминозащитной группой, (с) защищают боковую цепь гистидина, если присутствует, с помощью группы, лабильной к основным агентам разблокировки или группе отщепляемой аминолизом или аммонолизом, (d) привязывают С-концевую аминокислоту к инертному твердому носителю, (е) последовательно связывают, с помощью пригодного связующего средства, одну или более отобранных аминокислот одна с другой в последовательных циклах, начиная с С-конца, (f) отщепляют, к концу каждого цикла, защитные группы путем обработки агентом разблокировки, причем указанный агент разблокировки выбирают из агентов, способных отщеплять как α -аминозащитную группу, так и защитную группу боковой цепи, без рацемизации, побочных реакций или отщепления растущего пептида от полимера, (g) повторяют стадии связывания и отщепления с образованием нона- и декапептида, (h) отщепляют полипептид от носителя аминолизом или аммонолизом и (i) выделяют и очищают полученный полипептид. In another embodiment, the invention provides a temporary minimal protection method for solid-phase synthesis of a compound of formula (l), in which (a) protecting the α-amino groups of amino acids in a polypeptide, (b) protecting the serine side chain with a group labile to those agents that are suitable for cleavage by an α-amino protecting group, (c) protect the side chain of histidine, if present, by using a group labile to the main unlocking agents or a group cleavable by aminolysis or ammonolysis, (d) a C-terminal amino acid is attached to an inert solid carrier, (e) sequentially bind, using a suitable binder, one or more selected amino acids to each other in successive cycles, starting at the C-terminus, (f) the protective groups are cleaved off at the end of each cycle by treatment an unlocking agent, wherein said unlocking agent is selected from agents capable of cleaving both the α-amino protecting group and the side chain protecting group without racemization, side reactions or cleavage of the growing peptide from the polymer, (g) the coupling steps are repeated anija and cleaving to form a nona- and decapeptide, (h) polypeptide is cleaved from the support by aminolysis or ammonolysis, and (i) isolated and purified polypeptide obtained.

В другом варианте осуществления изобретения предлагается способ твердофазного синтеза соединения формулы l, в котором (а) связывают твердофазным синтезом соответствующий Вос-защищенный и трет-бутил-защищенный серин в последовательных циклах и в порядке справа налево относительно аминокислотной последовательности соединения формулы l, начиная с Вос-R6-O-, ковалентно связанного с инертным твердым носителем, (b) отщепляют, в начале каждого цикла, Вос-защитную группу и одновременно трет-бутиловую группу от серина или D-серина путем обработки агентом разблокировки, выбранным из HCl/CH2Cl2 HCl (низший алканоил) СH2Cl2, с образованием полипептидной связи с ука- занным твердым носителем, (с) отщепляют полипептид от носителя аммонолизом и (d) выделяют полученный полипептид.In another embodiment, the invention provides a method for solid-phase synthesis of a compound of formula l, in which (a) solid-phase synthesis is associated with the corresponding Boc-protected and tert-butyl-protected serine in sequential cycles and from right to left with respect to the amino acid sequence of the compound of formula l, starting with Boc -R6-O-, covalently bound to an inert solid support, (b) the Boc-protecting group and, at the same time, tert-butyl group are removed from the serine or D-serine by treatment of a an unlocking agent selected from HCl / CH 2 Cl 2 HCl (lower alkanoyl) CH 2 Cl 2 to form a polypeptide bond with said solid support, (c) the polypeptide is cleaved from the support by ammonolysis and (d) the resulting polypeptide is isolated.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагается способ, описанный выше, для получения полипептида, имеющего приведенную выше формулу, где R1 обозначает (пиро) Glu или N-Ac-D-Nal (2); R2обозначает His или D-p-Cl-Phe; R3 обозначает Trp; R4 обозначает D-Nal (2), D-hArg (Et)2; R5 обозначает Arg или L-hArg (Et)2 и R6 обозначает Gly-NH2, или D-Ala-NH2.In a preferred embodiment of the invention, there is provided a method described above for preparing a polypeptide having the above formula, wherein R 1 is (pyro) Glu or N-Ac-D-Nal (2); R 2 is His or Dp-Cl-Phe; R 3 is Trp; R 4 is D-Nal (2), D-hArg (Et) 2 ; R 5 is Arg or L-hArg (Et) 2 and R 6 is Gly-NH 2 or D-Ala-NH 2 .

В предпочтительном варианте осуществления изобретения функцию α-амино (Nα) аминокислот защищают группой, чувствительной к кислоте или основанию. Защитная группа устойчива к условиям образования пептидной связи, хотя легко отщепляется без разрушения растущей пептидной цепи или рацемизизации любого из хиральных центров, содержащихся в ней. Пригодными защитными группами являются трет-бутоксикарбонил (Вос), бифенилизопропилоксикарбонил, трет-амилоксикарбонил, изоборнилоксикарбонил, α, α -диметил, 3,5-диметоксибензилоксикарбонил, о-нитрофенилсульфенил, 2-циано-трет-бутилоксикарбонил, 9-фторэнилметилоксикарбонил (Fmoc) и так далее. Предпочтительно α -аминозащитной группой является трет-бутоксикарбонил (Вос). Когда желательно получить пептид такой, как бусерелин или госерелин, в котором R4 в Формуле (1) выше обозначает D-Ser (трет-Bu), Fmoc является предпочтительным для Nα -защиты в циклах связывания, включающих и следующих за прибавлением D-Ser (tBu). Fmoc является лабильным и к основным реагентам (рН 8,5), таким как пиперидин, который не отщепляет tBu от D-Ser (tBu). В последних циклах после прибавления D-Ser (tBu) необходимо использовать чувствительную к основанию Nα -защиту. Боковую цепь серина в положении 4 защищают группой, которая может быть отщеплена, например, мягкой фторидной обработкой. Предпочтительной защитной группой боковой цепи серина является трет-бутилдиметилсилил.In a preferred embodiment, the function of the α-amino (N α ) amino acids is protected by an acid or base sensitive group. The protective group is resistant to the conditions of formation of the peptide bond, although it can easily be cleaved without breaking the growing peptide chain or racemizing any of the chiral centers contained therein. Suitable protecting groups are tert-butoxycarbonyl (Boc), biphenylisopropyloxycarbonyl, tert-amyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, α, α-dimethyl, 3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, o-nitrophenylsulfenyl, 2-cyano-tert-butyloxycarbonyl, 9-fluoroenyl etc. Preferably, the α-amino protecting group is tert-butoxycarbonyl (Boc). When it is desired to obtain a peptide such as buserelin or goserelin in which R 4 in Formula (1) above is D-Ser (tert-Bu), Fmoc is preferred for N α -protection in binding cycles including and following the addition of D- Ser (tBu). Fmoc is also labile to basic reagents (pH 8.5), such as piperidine, which does not cleave tBu from D-Ser (tBu). In the last cycles after the addition of D-Ser (tBu), it is necessary to use base sensitive N α protection. The serine side chain at position 4 is protected by a group that can be cleaved, for example, by soft fluoride treatment. A preferred protecting group of the serine side chain is tert-butyldimethylsilyl.

Гидроксильную боковую цепь остатка серина защищают во время связывания серина с растущим пептидом, как описано для общего варианта настоящего изобретения. Защитную группу боковой цепи отщепляют после связывания и перед прибавлением следующей аминокислоты. Защитную группу боковой цепи серина отщепляют тем же реагентом, который используют для отщепления Nα -защитной группы. Предпочтительными защитными группами боковой цепи серина являются трет-бутил, трет-бутилдиметилсилил, триметилсилил, тритил, пивалил и тетрагидропиран-2-ил.The hydroxyl side chain of the serine residue is protected during the binding of serine to the growing peptide, as described for a general embodiment of the present invention. The side chain protecting group is cleaved after binding and before the addition of the next amino acid. The serine side chain protecting group is cleaved off with the same reagent that is used to cleave the N α -protecting group. Preferred serine side chain protecting groups are tert-butyl, tert-butyldimethylsilyl, trimethylsilyl, trityl, pivalyl and tetrahydropyran-2-yl.

Кроме того, также защищают имидазоловую боковую цепь гистидина, обычно присутствующего в агониcтах ЛГ-РГ. Защитная группа боковой цепи гистидина может быть также лабильной во время цикла связывания, например, лабильной к агенту разблокировки Nα -группы, однако, необязательно, ее отщепление может быть осуществлено, когда пептид отщеплен от его носителя. Предпочтительными защитными группами боковой цепи для гистидина являются п-толуолсульфонил и 2,4-динитрофенил.In addition, the imidazole side chain of histidine, usually present in LH-RH agonists, is also protected. The protective group of the side chain of histidine can also be labile during the binding cycle, for example, labile to the unlocking agent of the N α group, however, optionally, its cleavage can be carried out when the peptide is cleaved from its carrier. Preferred side chain protecting groups for histidine are p-toluenesulfonyl and 2,4-dinitrophenyl.

Для инициации синтеза первую аминокислоту, которой, как правило, является С-концевая аминокислота в конечном продукте, присоединяют к пригодному твердому носителю. Пригодными твердыми носителями в вышеуказанном синтезе являются те материалы, которые инертны к реагентам и реакционным условиям ступенчатых реакций конденсации-разблокировки, а также нерастворимы в используемых средах. Примерами коммерчески приемлемых полимеров являются стирол/дивинилбензоловые полимеры, модифицированные реакционноспособной группой, например хлорметилированный стирол-дивинилбензоловый сополимер, гидроксиметилированный стирол/дивинилбензоловый сополимер и так далее. Пpедпочтительным является полимер Merrifield (1% сшитый хлорметилированный сополимер стирола и дивинилбензола). To initiate the synthesis, the first amino acid, which is typically the C-terminal amino acid in the final product, is attached to a suitable solid support. Suitable solid carriers in the above synthesis are those materials that are inert to the reagents and reaction conditions of stepwise condensation-unlocking reactions, and also insoluble in the media used. Examples of commercially acceptable polymers are styrene / divinylbenzene polymers modified with a reactive group, for example, a chloromethylated styrene-divinylbenzene copolymer, a hydroxymethylated styrene / divinylbenzene copolymer, and so on. A preferred polymer is Merrifield (1% crosslinked chloromethylated copolymer of styrene and divinylbenzene).

Присоединение к полимеру, например, хлорметилированному стирол-дивинилбензоловому полимеру, осуществляют при помощи взаимодействия Nα -защищеннoй С-концевой аминокислоты, особенно, Nα -Вос аминокислоты, в виде ее цезиевой, тетраметиламмониевой, триэтиламмониевой, 1,5-диазабицикло(5.4.0)ундец-5-еновой или аналогичной соли в этаноле, ацетонитриле, N,N-диметилформамиде (ДМФ) и так далее, особенно, цезиевой соли в ДМФ, с хлорметилированным полимером при повышенной температуре, например, около 40-60оС, предпочтительно, около 50оС, в течение периода времени около 12-72 часов, предпочтительно, около 48 часов.Attachment to a polymer, e.g., a chloromethylated styrene-divinylbenzene polymer, is carried out by the interaction of an N α -protected C-terminal amino acid, especially an N α -Boc amino acid, in the form of its cesium, tetramethyl ammonium, triethyl ammonium, 1,5-diazabicyclo (5.4. 0) undec-5-ene, or similar salt in ethanol, acetonitrile, N, N-dimethylformamide (DMF) and so on, especially the cesium salt in DMF, with the chloromethylated resin at an elevated temperature, e.g., about 40-60 ° C, preferably about 50 C, for a period bp it takes about 12-72 hours, preferably about 48 hours.

Связывание последующих защищенных аминокислот осуществляют хорошо известными методами, обычно в автоматизированном пептидном синтезаторе. Каждую защищенную аминокислоту интродуцируют приблизительно при 1,5-2,5-кратном молярном избытке, и связывание осуществляют в инертном, неводном, полярном растворителе, таком как дихлорметан, ДМФ или их смеси, предпочтительно, в дихлорметане, при температуре почти комнатной. Связующий агент выбирают из N, N'-дициклогексилкарбодимида (ДЦК), N,N'-ди-изо-пропилкарбодиимида (ДИК) или другого карбодиимида, либо в отдельности, либо в присутствии 1-гидроксибензотриазола (HBt), О-ацилмочевин, бензотриазол-Δ-ил-окси-трис(пирролидино фосфоний) гексафторфосфата (РуВор), N-гидроксисукцинимида, других N-гидроксиимидов или оксимов. Альтернативно, могут быть использованы активные сложные эфиры защищенных аминокислот (например, п-нитрофенил, пентафторфенил и тому подобное) или симметрические ангидриды. The binding of the subsequent protected amino acids is carried out by well-known methods, usually in an automated peptide synthesizer. Each protected amino acid is introduced at about 1.5-2.5 fold molar excess, and binding is carried out in an inert, non-aqueous, polar solvent such as dichloromethane, DMF, or mixtures thereof, preferably in dichloromethane, at almost room temperature. The coupling agent is selected from N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N, N'-di-iso-propylcarbodiimide (DIC) or another carbodiimide, either individually or in the presence of 1-hydroxybenzotriazole (HBt), O-acylurea, benzotriazole -Δ-yl-hydroxy-tris (pyrrolidino phosphonium) hexafluorophosphate (RuBor), N-hydroxysuccinimide, other N-hydroxyimides or oximes. Alternatively, active esters of protected amino acids (e.g. p-nitrophenyl, pentafluorophenyl and the like) or symmetric anhydrides can be used.

Пептидный полимер проверяют на полное связывание с использованием Теста Кайзера (Anal. Biochem. 34, 595 (1970) за исключением того, что в случае связывания с пролином используют Тест Хлоранила (Anal. Biochem. 117, 145 (1981)) или Тест Изатина (Anal. Chim. 118, 149 (1980)). The peptide polymer is checked for complete binding using the Kaiser Test (Anal. Biochem. 34, 595 (1970) except that in the case of binding to proline, the Chloranil Test (Anal. Biochem. 117, 145 (1981)) or the Isatin Test ( Anal. Chim. 118, 149 (1980)).

Если тест (ы) на полноту показывают, что реакция не завершена, связывание повторяют с использованием дополнительной аминокислоты, однако, опуская разблокировку дополнительной кислоты. Когда последнее связывание завершено, полимер промывают метанолом или метанолом, содержащим дихлорметан, и сушат при максимальной температуре 60оС.If the test (s) for completeness shows that the reaction is not completed, the binding is repeated using an additional amino acid, however, omitting the unlocking of the additional acid. When the last binding is completed, the polymer is washed with methanol or methanol containing dichloromethane and dried at a maximum temperature of 60 about C.

В конце каждого цикла, то есть, после каждого прибавления следующей Nα -защищенной аминокислоты в растущую полипептидную цепь, защитную группу отщепляют путем обработки агентом разблокировки. При добавлении серина агент разблокировки удаляет как N -Вос-защитную группу, так и серин-защитную группу. Среди предпочтительных агентов разблокировки следует упомянуть хлорoводород в дихлорметане (HCl/-CH2Cl2), трифторуксусную кислоту в дихлорметане (ТФК/СH2Cl2) и хлороводород, растворенный в С3-С6-спирте, предпочтительно, изопропаноле, смешанном с дихлорметаном. как правило, концентрация HCl составляет от 2 н. до 9 н. предпочтительно от 4 н. до 5 н. Отношение CH2Cl2 к С3-С6-спирту составляет 0,1-10 (объемн.); предпочтительно, около 1:1. Особенно предпочтительным агентом разблокировки является 4,5 н. раствор HCl в i-PrOH: CH2Cl2 (1:1). Стадия разблокировки обычно имеет место при температурах от 0 до 45оС, предпочтительно при температурах окружающей среды (от 20 до 27оС).At the end of each cycle, that is, after each addition of the next N α -protected amino acid to the growing polypeptide chain, the protective group is cleaved by treatment with an unlocking agent. When serine is added, the unlocking agent removes both the N-Boc-protecting group and the serine-protecting group. Among the preferred unlocking agents, mention should be made of hydrogen chloride in dichloromethane (HCl / -CH 2 Cl 2 ), trifluoroacetic acid in dichloromethane (TFA / CH 2 Cl 2 ) and hydrogen chloride dissolved in a C 3 -C 6 alcohol, preferably isopropanol, mixed with dichloromethane. as a rule, the concentration of HCl is from 2 N. up to 9 n. preferably from 4 n. up to 5 n. The ratio of CH 2 Cl 2 to C 3 -C 6 alcohol is 0.1-10 (vol.); preferably about 1: 1. A particularly preferred unlocking agent is 4.5 n. a solution of HCl in i-PrOH: CH 2 Cl 2 (1: 1). Step release usually takes place at temperatures from 0 to 45 ° C, preferably at ambient temperatures (20 to 27 ° C).

Специалист в данной области техники поймет, что отбор протокола связывания/разблокировки с использованием агентов иных, нежели, описаны выше, является правильным при условии, что остаток серина освобожден от защиты с помощью агента, который отвечает целям изобретения. Можно использовать методику с применением HCl/iPrOH/CH2Cl2 для каждого цикла освобождения от защиты. Альтернативно, также приемлем смешанный метод, в котором ТФК/CH2Cl2 используют для определенных циклов, а HCl/iPrOH/CH2Cl2 для других. Специалисту станут понятны и другие циклы.One skilled in the art will understand that selecting a binding / unlocking protocol using agents other than those described above is correct provided that the serine residue is deprotected with an agent that is consistent with the objectives of the invention. A method using HCl / iPrOH / CH 2 Cl 2 can be used for each deprotection cycle. Alternatively, a mixed method is also acceptable in which TFA / CH 2 Cl 2 is used for certain cycles and HCl / iPrOH / CH 2 Cl 2 for others. The specialist will also understand other cycles.

В конце твердофазного синтеза полипептид отщепляют от полимерного носителя. Отщепление проводят с помощью аммонолиза насыщенным раствором аммиака в пригодном растворителе для пептидов с С-концом аланина или глицина; для пептидов, имеющих С-конец пролина, отщепление осуществляют при помощи аминолиза алкиламином или фторалкиламино. Отщепление проводят при температуре приблизительно от 10 до 50оС, предпочтительно, около 25оС, в течение периода времени около 12-24 ч, предпочтительно, около 18 ч. Пригодные растворители включают метанол, этанол, изопропанол, диметилформамид, тетрагидрофуран, N,N-диметилэтаноламин, гексаны и их смеси. Предпочтительно, используют насыщенный раствор аммиака в метаноле. Альтернативно, пептид может быть отщеплен от полимера путем трансэстерификации основанием с последующим аминолизом. Затем полипептид очищают с использованием последовательности хроматографических стадий, применяя любой или все следующие типы: ионообменная хроматография на слегка основной смоле в ацетатной форме; гидрофобная абсорбционная хроматография или недериватизированная полистирол-дивинил-бензоловая (например, Amberlite

Figure 00000001
XAD) хроматография; абсорбционная хроматография на силикагеле; ионообменная хроматография на карбоксиметилцеллюлозе; распределительная хроматография (например, на Sephadex
Figure 00000002
G-25) или противоточное распределение; жидкостная хроматография высокого разрешения (ЖХВР), особенно, обращеннофазная ЖХВР на колонке с октил- или октадецилсилил-кремнеземом.At the end of the solid phase synthesis, the polypeptide is cleaved from the polymer carrier. Cleavage is carried out by ammonolysis with a saturated solution of ammonia in a suitable solvent for peptides with the C-terminus of alanine or glycine; for peptides having the C-terminus of proline, cleavage is carried out by aminolysis with alkylamine or fluoroalkylamino. Cleavage is carried out at a temperature of from about 10 to about 50 C, preferably about 25 ° C, for a time period of about 12-24 hours, preferably about 18 hours. Suitable solvents include methanol, ethanol, isopropanol, dimethylformamide, tetrahydrofuran, N, N-dimethylethanolamine, hexanes and mixtures thereof. Preferably, a saturated solution of ammonia in methanol is used. Alternatively, the peptide may be cleaved from the polymer by transesterification with a base followed by aminolysis. The polypeptide is then purified using a sequence of chromatographic steps using any or all of the following types: ion exchange chromatography on a slightly basic resin in acetate form; hydrophobic absorption chromatography or non-derivatized polystyrene-divinyl-benzene (e.g. Amberlite
Figure 00000001
XAD) chromatography; silica gel absorption chromatography; ion exchange chromatography on carboxymethyl cellulose; distribution chromatography (e.g. Sephadex
Figure 00000002
G-25) or countercurrent distribution; high-performance liquid chromatography (HPLC), especially reverse phase HPLC on an octyl or octadecylsilyl silica column.

Если рацемическую аминокислоту используют в одном или более положениях 1, 2, 3 или 6, и отдельные изомерные продукты представляют интерес, диастереомерные нонапептидные или декапептидные конечные продукты подвергают разделению после чего искомый полипептид, содержащий D-аминокислоту в соответствующем положении, выделяют и очищают, предпочтительно, во время осуществления вышеописанной хроматографической методики. Выделенный и очищенный полипептид, необязательно, превращают в фармацевтически приемлемую соль. If the racemic amino acid is used in one or more positions 1, 2, 3, or 6, and individual isomeric products are of interest, the diastereomeric nonapeptide or decapeptide end products are separated, after which the desired polypeptide containing the D-amino acid at the appropriate position is isolated and purified, preferably , during the implementation of the above chromatographic techniques. The isolated and purified polypeptide is optionally converted into a pharmaceutically acceptable salt.

Следующие примеры сравнивают способ временной защиты настоящего изобретения с незащищенным способом как для агониста ЛГ-КРГ, так и для антагониста ЛГ-РГ. Эти примеры представлены для целей только лишь специфичности и не должны ограничивать объем заявленного изобретения. The following examples compare the temporary protection method of the present invention with an unprotected method for both an LH-HRH agonist and an LH-RH antagonist. These examples are presented for purposes of specificity only and should not limit the scope of the claimed invention.

В обоих продуктах примеров 1 и 3, использующих способ минимальной защиты изобретения, находится значительно меньшее количество примесей по сравнению с продуктами, полученными в примерах 2 и 4, использующих незащищенный синтез. In both products of examples 1 and 3, using the minimum protection method of the invention, there is a significantly lower amount of impurities in comparison with the products obtained in examples 2 and 4 using unprotected synthesis.

Кроме меньшего числа примесей, способ настоящего изобретения отличается дополнительными преимуществами в смысле более высоких выходов продукта и использования менее опасных реагентов, в течение более короткого периода времени и с меньшими расходами энергии при выделении и очистке аналогов ЛГ-РГ. Дополнительным преимуществом является производство меньших количеств значительно менее токсичного отработанного потока. In addition to fewer impurities, the method of the present invention has additional advantages in terms of higher product yields and the use of less hazardous reagents, for a shorter period of time and with lower energy consumption for the isolation and purification of LH-RH analogues. An additional advantage is the production of smaller amounts of significantly less toxic waste stream.

Получение А. Getting A.

Получение Вос-Gly-O-Полимера. Obtaining Vos-Gly-O-Polymer.

4,9 г Nα -Вос-глицина растворяют в смеси 50 мл метанола и 50 мл дистиллированной воды. рН раствора доводят до 7,5 водным бикарбонатом цезия. Затем растворитель удаляют в вакууме. Через 18 ч сушки под высоким вакуумом остаток растворяют в 150 мл сухого ДМФ. Прибавляют 25 г в 1% хлорметилированного полистирол/дивинилбензолового (Merrifield) полимера (соответствует 25 ммоль хлорида). Смесь встряхивают при 50оС течение 24 ч, фильтруют и полимер промывают последовательно ДМФ, водой и этанолом. Полимер сушат в вакууме в течение 3 дней с получением 28,34 г Boc-Gly-О-Полимера.4.9 g of N α -Boc-glycine are dissolved in a mixture of 50 ml of methanol and 50 ml of distilled water. The pH of the solution was adjusted to 7.5 with aqueous cesium bicarbonate. Then the solvent is removed in vacuo. After 18 hours of drying under high vacuum, the residue is dissolved in 150 ml of dry DMF. 25 g of a 1% chloromethylated polystyrene / divinylbenzene (Merrifield) polymer (corresponding to 25 mmol of chloride) are added. The mixture was shaken at 50 ° C for 24 hours, filtered and the resin washed sequentially with DMF, water and ethanol. The polymer was dried in vacuo for 3 days to obtain 28.34 g of a Boc-Gly-O-Polymer.

Получение В. Getting B.

Получение Вос-Ala-О-Полимера. Obtaining Vos-Ala-O-Polymer.

В соответствии с методикой Получения A Nα-Boc-D-аланин прибавляют к 1% полимеру Merrifield с получением Nα-Boc-D-Ala-O-Полимера.According to the Preparation Procedure, AN α- Boc-D-Alanine is added to a 1% Merrifield polymer to obtain the N α -Boc-D-Ala-O-Polymer.

П р и м е р 1. Синтез нафарелина с использованием минимальной защиты серина. PRI me R 1. Synthesis of nafarelin using minimal serine protection.

В данном примере нафарелин получают с использованием следующего метода защиты боковой цепи: солевая защита относительно аргинина (в виде хлорида), тозиловая защита относительно гистидина и трет-бутиловая защита относительно серина. In this example, nafarelin is prepared using the following side chain protection method: salt protection against arginine (as chloride), tosyl protection against histidine, and tert-butyl protection against serine.

Nα-Вос-аминокиcлоты получают из Бачем (Торанс, Калифорния) (Leu, Tyr, His (Tos), Arg, Trp и Gly). Стар Биокемикал (Торранс, Калифорния) (Pro и Ser (tBu), Свинте Тех (Олбани, Орегон), (D-Nal (2).N α -Boc amino acids are obtained from Bachem (Thorens, California) (Leu, Tyr, His (Tos), Arg, Trp and Gly). Star BioChemical (Torrance, CA) (Pro and Ser (tBu), Swint Tech (Albany, Oregon), (D-Nal (2).

4,0-4,5 н. растворы HCl в i-PrOH/CH2Cl2 (1/1) получают барботажем HСl в холодный i-PrOH. После насыщения раствора (определено титрованием: приблизительно 9 н.) его сохраняют при комнатной температуре не более 3 дней и разбавляют равным объемом CH2Cl2 перед использованием.4.0-4.5 n HCl solutions in i-PrOH / CH 2 Cl 2 (1/1) are obtained by bubbling HCl into cold i-PrOH. After saturation of the solution (determined by titration: approximately 9 N), it is stored at room temperature for no more than 3 days and diluted with an equal volume of CH 2 Cl 2 before use.

1,0 ммоль Nα-Boc-Gly-O-полимера из Получения А помещают в реактор автоматизированного твердофазного пептидного синтезатора Века 296 объемом 5,0 л, снабженного вспомогательными пробирками и колбами для прибавления реагентов и для создания повышенного давления, сбрасывания давления и поддержания инертной атмосферы азота.1.0 mmol of the N α -Boc-Gly-O-polymer from Preparation A was placed in a reactor of a Veka 296 automated solid-phase peptide synthesizer of 5.0 l capacity, equipped with auxiliary tubes and flasks to add reagents and to create increased pressure, relieve pressure and maintain inert atmosphere of nitrogen.

Следующие аминокислоты прибавляют к Nα -Boc-Gly-O-полимеру путем DIC или HBt содействующего DIC -связывания в течение 3 ч: Nα-Boc-Pro (2,0 экв,); Nα-Boc-Arg. HCl (2,0 экв. ); Nα-Boc-Leu, H2O (2,0 экв.); Nα-Boc-D-Nal (2) (1-5 экв.)/HBt; Nα-Boc-Tyr (1,5 экв,)/HBt; Nα-Boc-Ser (tBu) (2,0 экв)/HBt; N -Bic-Trp (1,75 экв.)/-HBt; Nα-Boc-His (Tos) (1,75 экв.)/HBt; (пиро) Glu (2,5 экв.)/-HBt.The following amino acids are added to the N α -Boc-Gly-O-polymer by DIC or HBt promoting DIC-binding for 3 hours: N α -Boc-Pro (2.0 eq); N α -Boc-Arg. HCl (2.0 equiv.); N α -Boc-Leu, H 2 O (2.0 equiv.); N α -Boc-D-Nal (2) (1-5 equiv.) / HBt; N α -Boc-Tyr (1.5 eq.) / HBt; N α -Boc-Ser (tBu) (2.0 eq) / HBt; N-Bic-Trp (1.75 equiv.) / - HBt; N α -Boc-His (Tos) (1.75 equiv.) / HBt; (pyro) Glu (2.5 equiv.) / - HBt.

Для отщепления Nα -защитной группы после каждого прибавления используют следующие методики.The following methods are used to remove the N α -protecting group after each addition.

Программа А: полимер вначале промывают CH2Cl2 1 х 1 мин, ТФК СH2Cl2 (40/60) 1 х 1 мин, ТФК СH2Cl2 (40/60) 1 х 30 мин, CH2Cl2 5 х 1 мин, Et3 N CH2Cl2 (5/95) 3 х 1 мин, CH2Cl2 4 х 1 мин.Program A: the polymer is first washed with CH 2 Cl 2 1 x 1 min, TFA CH 2 Cl 2 (40/60) 1 x 1 min, TFA CH 2 Cl 2 (40/60) 1 x 30 min, CH 2 Cl 2 5 x 1 min, Et 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 x 1 min, CH 2 Cl 2 4 x 1 min.

Программа В: полимер вначале промывают CH2Cl2 1 х 1 мин, 4,0-4,5 н HCl в CH2CL2/i-PrOH (1/1) 1 х 1 мин, 4,0-4,5 н. HCl в CH2Cl2/i-PrOH (1/1) 1 х 30 мин, CH2Cl2 3 х 1 мин, ДМФ 1 х 1 мин, Еt3 N CH2Cl2 (5/95) 3 x 1 мин, ДМФ 1 x 1 мин, СH2Cl2 4 х 1 мин.Program B: the polymer is first washed with CH 2 Cl 2 1 x 1 min, 4.0-4.5 n HCl in CH 2 CL 2 / i-PrOH (1/1) 1 x 1 min, 4.0-4.5 n HCl in CH 2 Cl 2 / i-PrOH (1/1) 1 x 30 min, CH 2 Cl 2 3 x 1 min, DMF 1 x 1 min, Et 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 x 1 min, DMF 1 x 1 min, CH 2 Cl 2 4 x 1 min.

Программу А используют для отщепления Nα-защитных групп на Gly, Pro, Arg, Leu, D-Nal (2) и Tyr. Программу В используют для отщепления Nα-защитных групп на Ser, Trp и His, а также для отщепления защитной группы боковой цепи серина.Program A is used to cleave N α -protecting groups into Gly, Pro, Arg, Leu, D-Nal (2) and Tyr. Program B is used to cleave the N α -protective groups on Ser, Trp and His, as well as to cleave the protective group of the serine side chain.

После осуществления каждой стадии освобождения от защиты и промывки в соответствии с Пpотоколом А или В, следующую аминокислоту в последовательности прибавляют к полипептидной цепи и полимер промывают CH2Cl2 3 х 1 мин, MeOH 4 х 1 мин, ДМФ 2 х 1 мин и CH2Cl2 4 х 1 мин. После построения последовательности пептид отщепляют от полимера путем обработки насыщенным раствором аммиака в метаноле при температуре около 25оС в течение 18 ч.After each protection and washing step is carried out in accordance with Protocol A or B, the next amino acid in the sequence is added to the polypeptide chain and the polymer is washed with CH 2 Cl 2 3 x 1 min, MeOH 4 x 1 min, DMF 2 x 1 min and CH 2 Cl 2 4 x 1 min. After constructing the peptide sequence is cleaved from the resin by treatment with a saturated solution of ammonia in methanol at a temperature of about 25 ° C for 18 hours.

Неочищенный пептид растворяют в 2М уксусной кислоте и превращают в ацетатную соль, пропуская через колонку смолы AG3-Х4А (Био-Рад), после чего ацетат растворяют в минимальном количестве метанола, и прибавляют ацетон с целью преципитации пептида. Обращеннофазовую ЖХВР (Partisil ODS-3, 40 мкм, ацетонитрил с 0,5% уксусной кислотой) используют для удаления полярных и неполярных примесей. Фракции, содержащие по крайней мере 97% наферелин-ацетата, объединяют и разбавляют водой, после чего перегружают на колонку обращеннофазовой ЖХВР и промывают 1% уксусной кислотой в воде. Остаток преципицируют, фильтруют, промывают и сушат под вакуумом. Аминокислотный анализ осуществляют на аминокислотном анализаторе Бекман 119СL. Пробы для аминокислотного анализа гидролизуют 4 н. раствором CH3SO3H (0,2% -3-(2-аминометилиндол)HCl) в течение 20 часов при температуре 110оС.The crude peptide is dissolved in 2M acetic acid and converted to the acetate salt by passing through a column of resin AG3-X4A (Bio-Rad), after which the acetate is dissolved in a minimal amount of methanol, and acetone is added to precipitate the peptide. Reverse phase HPLC (Partisil ODS-3, 40 μm, acetonitrile with 0.5% acetic acid) is used to remove polar and non-polar impurities. Fractions containing at least 97% naferelin acetate are combined and diluted with water, then loaded onto a reverse phase HPLC column and washed with 1% acetic acid in water. The residue was precipitated, filtered, washed and dried in vacuo. Amino acid analysis is carried out on a Beckman 119CL amino acid analyzer. Samples for amino acid analysis hydrolyze 4 N. a solution of CH 3 SO 3 H (0.2% -3- (2-aminomethylindole) HCl) for 20 hours at a temperature of 110 about C.

Аналитическую ЖХВР осуществляют на хроматографе Спектра Физикс 8800 с использованием колонки ODS-11 из Олтех, 5 мкм, 4,6 х 250 мм, 10 мкл впрыска, расход 1,5 мл/мин, 27,5% CH3CN, 72,5% 0,16 М КР2РО4, рН 5,1, температура 40оС. ЖХВР анализ неочищенного пептида показывает основной пик с временем удерживания 18 мин в отношении нафарелина и отсутствие примесей в присутствии 1% при величине времени удерживания 14 мин.Analytical HPLC was carried out on a Spectra Physix 8800 chromatograph using an ODS-11 column from Oltech, 5 μm, 4.6 x 250 mm, 10 μl injection, flow rate 1.5 ml / min, 27.5% CH 3 CN, 72.5 % 0.16M KP 2 PO 4, pH 5.1, temperature 40 C. HPLC analysis of the crude peptide shows a major peak with a retention time of 18 min in relation to nafarelin and no impurity in the presence of 1% at the value of retention time 14 min.

П р и м е р 2. Синтез нафарелина без защиты серина. PRI me R 2. Synthesis of nafarelin without protection of serine.

Повторяют методику примера 1 за исключением того, что вместо Nα-Boc-Ser (tBu) используют Nα-Boc-Ser.The procedure of Example 1 except that instead of N α -Boc-Ser (tBu) using N α -Boc-Ser.

ЖХВР -анализ показывает основной пик со временем удерживания 18 минут в отношении нафарелина, а также от 8,1 до 11,5% примеси при времени удерживания (ву) 14 мин. HPLC analysis shows the main peak with a retention time of 18 minutes in relation to nafarelin, as well as from 8.1 to 11.5% of the impurity at a retention time (w) of 14 minutes.

Кроме того, выход в результате этого "незащищенного" синтеза приблизительно равен выходу в результате полностью защищенного синтеза с использованием обработки фтороводородом; в последнем случае выход продукта значительно ниже того, который достигнут в результате синтеза с временной защитой Примера 1. In addition, the yield resulting from this “unprotected” synthesis is approximately equal to the yield resulting from a fully protected synthesis using hydrogen fluoride treatment; in the latter case, the product yield is significantly lower than that achieved as a result of synthesis with temporary protection of Example 1.

П р и м е р 3. Синтез антагонистов ЛГ-РГ с использованием временной защиты серина. PRI me R 3. Synthesis of LH-RH antagonists using temporary serine protection.

В данном примере антагонисты ЛГ-РГ, N-Ac-D-Nal (2) D-pCl-Phe-Pal (3) Ser-Tyr-D-hArg (Et2) Leu-hArg (Et2) Prp-D-Ala NH2, получают с использованием следующего протокола защиты боковой цепи: солевая защита относительно L- и D-hArg (Et2) (в качестве хлорида) и трет-бутиловая защита серина. Nα-Вос-аминокислоты получают из Бачем (Торранс, Калифорния) )D-Ala, Arg и Leu); Стар Биокемикалз (Торранс, Калифорния), (Pro); Синте Тех (Олбани, Орген) (D-Nal (2)), Инцель (Милуоки, Висконсин) (D-Pal (3)) и UCB Бaйопродактс (Бельгия) (p-Cl-Phe).In this example, LH-RH antagonists, N-Ac-D-Nal (2) D-pCl-Phe-Pal (3) Ser-Tyr-D-hArg (Et 2 ) Leu-hArg (Et 2 ) Prp-D- Ala NH 2 was prepared using the following side chain protection protocol: salt protection relative to L- and D-hArg (Et 2 ) (as chloride) and tert-butyl protection of serine. N α -Boc amino acids are obtained from Bachem (Torrance, California)) D-Ala, Arg and Leu); Star Biochemicals (Torrance, California), (Pro); Sinte Tech (Albany, Organ) (D-Nal (2)), Inzel (Milwaukee, Wisconsin) (D-Pal (3)) and UCB Bioproducts (Belgium) (p-Cl-Phe).

Аминокислоты прибавляют к Naα-Boc-D-Ala-полимеру Получения В в следующей последовательности: N -Boc-Pro (2,3 экв.); Naα-Boc-hAtg (Et)2. HCl (1 экв. )/HBt; Naα-Boc-Leu, H2O (2,3 экв.); Naα-Boc-D-hArg (Et)2. HCl (1,6 экв.)/-HBt; Naα-Boc-Tyr (2,1 экв.)/HBt; Naα -Boc-Ser (tBu) (2,0 экв.); Naα-Boc-D-Pal (3) (1,8 экв.)/HBt; Naα -Boc-D-p-Cl-Phe (2,0 экв.); Naα-Boc-D-Nal (2) (2,1 экв)/HBt; уксусный ангидрид.Amino acids are added to the Na α -Boc-D-Ala polymer of Preparation B in the following sequence: N -Boc-Pro (2.3 equiv.); Na α -Boc-hAtg (Et) 2 . HCl (1 equiv.) / HBt; Na α -Boc-Leu, H 2 O (2.3 equiv.); Na α -Boc-D-hArg (Et) 2 . HCl (1.6 equiv.) / - HBt; Na α -Boc-Tyr (2.1 eq.) / HBt; Na α -Boc-Ser (tBu) (2.0 eq.); Na α -Boc-D-Pal (3) (1.8 eq.) / HBt; Na α -Boc-Dp-Cl-Phe (2.0 equiv.); Na α -Boc-D-Nal (2) (2.1 eq) / HBt; acetic anhydride.

Ацетилирование осуществляют после Ala, Pro и Leu. Избыток HBt (2 экв.), используют для связывания основных аминоокислот, hArg (Ey)2 и Pal (3). Аминокислоты присоединяют путем DIC или HBt опосредованного DIC -связывания в течение 3 часов, и полимер последовательно промывают CH2Cl2 3 х 1 мин, MeOH 4 х 1 мин, ДМФ 2 х 1 мин и СН2Сl2 4 х 1 мин.Acetylation is carried out after Ala, Pro and Leu. Excess HBt (2 equiv.) Is used to bind the basic amino acids, hArg (Ey) 2 and Pal (3). Amino acids are joined by DIC or HBt-mediated DIC-binding for 3 hours, and the polymer is washed successively with CH 2 Cl 2 3 x 1 min, MeOH 4 x 1 min, DMF 2 x 1 min and CH 2 Cl 2 4 x 1 min.

Следующий протокол используют для отщепления Nα -защитной группы после каждого прибавления аминокислот.The following protocol is used to cleave the N α -protecting group after each addition of amino acids.

Программа А: полимер вначале промывают с помощью CH2Cl2 1 х 1 мин, ТФК CH2Cl2 (40/60) 1 х 1 мин, ТФК CH2Cl2 (40/60) 1 х 30 мин, CH2Cl25 х 1 мин, Et3 N CH2Cl2 (5/95) 3 х 1 мин, CH2Cl2 4 х 1 мин.Program A: the polymer is first washed with CH 2 Cl 2 1 x 1 min, TFA CH 2 Cl 2 (40/60) 1 x 1 min, TFA CH 2 Cl 2 (40/60) 1 x 30 min, CH 2 Cl 2 5 x 1 min, Et 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 x 1 min, CH 2 Cl 2 4 x 1 min.

Программа B: полимер вначале промывают с помощью CH2Cl2 1 х 1 мин, 4,0-4,5 н. HCl в CH2Cl2/-iPrOH (1/1) 1 х 1 мин, 4,0-4,5 н. HCl в CH2Cl2/i-PrOH (1/1) 1 х 30 мин, СH2Cl2 3 х 1 мин, ДМФ 1 х 1 мин, Et3 N CH2Cl2 (5/95) 3 х 1 мин, ДМФ 1 х 1 мин, CH2Cl2 4 х 1 мин.Program B: the polymer is first washed with CH 2 Cl 2 1 x 1 min, 4.0-4.5 N. HCl in CH 2 Cl 2 / -iPrOH (1/1) 1 x 1 min, 4.0-4.5 N. HCl in CH 2 Cl 2 / i-PrOH (1/1) 1 x 30 min, CH 2 Cl 2 3 x 1 min, DMF 1 x 1 min, Et 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 x 1 min, DMF 1 x 1 min, CH 2 Cl 2 4 x 1 min.

Программу А используют для отщепления защитных групп на Ala. Pro, D-hArg (Et)2, Leu и D-Nal (2), Программу В используют для отщепления защитных групп на D-hArg (Et)2, Tyr, Ser, D-Pal (3) и p-Cl-Phe. После каждого освобождения от защиты и промывки, в соответствии с протоколом А или В, прибавляют следующую аминокислоту в последовательности и полимер промывают с помощью CH2Cl2 3 х 1 мин, MeOH 4 х 1 мин, ДМФ 2 х 1 мин, CH2Cl2 4 х 1 мин. После завершения cоставления последовательности пептид отщепляют от полимерного носителя путем обработки насыщенным раствором аммиака в метаноле в течение приблизительно 18 ч при температуре около 25оС. Неочищенный пептид вначале растворяют в 2М уксусной кислоте и превращают в его ацетатную соль, пропуская через колонку смолы AG3-X4A (Био-Рад). Ацетат подвергают хроматографии на колонке силикагеля (CH2Cl2/i-PrOH/MeOH/H2O/HOAc в качестве растворителя); ацетатные фракции растворяют в воде и загружают на обращеннофазную колонку (Vydec c-18, 15-20 мкм) и очищают с использованием ацетонитрила/ТЕАР (рН 3,0). Фракции желательной степени чистоты объединяют и разбавляют водой, после чего перегружают на колонку обращеннофазовой ЖХВР, затем промывают 1% уксусной кислотой в воде. Пептид десорбируют смесью MeOH/CH3CN/HOAc/H2O (44/50/1/5). Остаток растворяют в метаноле или уксусной кислоте и преципицируют в присутствии простого эфира, фильтруют, промывают простым эфиром и сушат в вакууме. Аминокислотный анализ осуществляют на анализаторе аминокислотном Бекман 119CL. Пробы для аминокислотного анализа гидролизуют с помощью 6 н. раствора HCl при температуре 110оС в течение 20 ч. Аналитическую ЖХВР осуществляют на хроматографе Спектра Физикс 8800 с использованием Spherisord C-8 (Олтех), 5 мкм, 4,6 х 250 мм, 10 мкл впрыск, расход 1,5 мл/мин, 30% СР3CN. 70% NH4H2PO4 0,04 М, диметилоктиламин 4,3 х 10-3, температура 40оС. Синтез антагониста подтверждают наличием основного пика при времени удерживания 18 мин; других пиков при 1% не обнаружено при времени удерживания 16 мин.Program A is used to cleave protecting groups on Ala. Pro, D-hArg (Et) 2 , Leu and D-Nal (2), Program B is used to cleave the protective groups on D-hArg (Et) 2 , Tyr, Ser, D-Pal (3) and p-Cl- Phe. After each release from protection and washing, in accordance with Protocol A or B, the following amino acid is added in sequence and the polymer is washed with CH 2 Cl 2 3 x 1 min, MeOH 4 x 1 min, DMF 2 x 1 min, CH 2 Cl 2 4 x 1 min. After completion Compilation peptide sequence is cleaved from the polymeric support by treatment with a saturated solution of ammonia in methanol for about 18 hours at about 25 C. The crude peptide was first dissolved in 2M acetic acid and converted to its acetate salt by passage through a resin column AG3-X4A (Bio-Rad). The acetate was subjected to silica gel column chromatography (CH 2 Cl 2 / i-PrOH / MeOH / H 2 O / HOAc as solvent); the acetate fractions were dissolved in water and loaded onto a reverse phase column (Vydec c-18, 15-20 μm) and purified using acetonitrile / TEAP (pH 3.0). Fractions of the desired degree of purity are combined and diluted with water, after which they are loaded onto a reverse phase HPLC column, then washed with 1% acetic acid in water. The peptide is desorbed with a mixture of MeOH / CH 3 CN / HOAc / H 2 O (44/50/1/5). The residue was dissolved in methanol or acetic acid and precipitated in the presence of ether, filtered, washed with ether and dried in vacuo. Amino acid analysis is carried out on a Beckman 119CL amino acid analyzer. Samples for amino acid analysis are hydrolyzed using 6 N. HCl solution at a temperature of 110 ° C for 20 hours. Analytical HPLC was performed on a Spectra Physics 8800 chromatograph, using Spherisord C-8 (Alltech), 5 micron, 4.6 x 250 mm, 10 .mu.l of injection, flow rate 1.5 ml / min, 30% CP 3 CN. 70% NH 4 H 2 PO 4 0.04M, dimetiloktilamin 4.3 x 10 -3, the temperature 40 ° C. Synthesis of the antagonist confirm the presence of a main peak at a retention time 18 min; other peaks at 1% were not detected with a retention time of 16 minutes

П р и м е р 4. Синтез антагониста ЛГ-РГ без временной защиты серина
Повторяют пример 3 с использованием Nα-Boc-Ser вместо Nα-Boc-Ser (tBu). ЖХВР -анализ показывает присутствие основного пика при времени удерживания 18 мин относительно антагониста и присутствие примеси при концентрации 6,5% в отношении времени удержания 16 мин.PRI me R 4. Synthesis of an LH-RH antagonist without temporary protection of serine
Example 3 is repeated using N α -Boc-Ser instead of N α -Boc-Ser (tBu). HPLC analysis shows the presence of the main peak at a retention time of 18 minutes relative to the antagonist and the presence of an impurity at a concentration of 6.5% with respect to the retention time of 16 minutes

Следующая формула изобретения раскрывает и заявляет предмет технического решения, которое заявитель считает своим изобретением. Приведенная формула изобретения нацелена на полный диапазон эквивалентных решений, признаваемых специалистами в данной области техники, относящейся к твердофазному пептидному синтезу. The following claims disclose and claim the subject of a technical solution, which the applicant considers to be his invention. The claims are aimed at the full range of equivalent solutions recognized by those skilled in the art related to solid phase peptide synthesis.

Claims (1)

СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА ПЕПТИДОВ общей формулы
R1 R2 R3 Ser Tyr R4 Leu R5 - Pro R6,
где R1 выбирают из группы пиро-Glu, N-AcD Nal;
R2 His, DpClPhe, DpFPhe;
R3 Trp, DTrp;
R4 DNal(2), DhArg(Et)2, DhArg (Bu), DhArg (CH2CF3)2;
R5 Arg, L-Arg (Et)2, L h Arg(Bu), L h Arg(CH2CF3)2;
R6 GlyNH2, DAla NH2,
который включает следующие стадии: присоединение Nα защищенных концевых аминокислот к инертному твердому носителю; последующее добавление других Nα защищенных аминокислот к наращиваемой пептидной цепи; удаление в конце каждого цикла защитной группы; отщепление полипептида от носителя; выделение образующегося полипептида, отличающийся тем, что боковую цепь серина временно защищают группой, лабильной по отношению к агентам, используемым для удаления α аминозащитных групп, а боковую цепь гистидина, если она присутствует, защищают группой, лабильной по отношению к агенту для удаления a аминозащитных групп, при этом группу, защищающую боковую цепь гистидина, можно удалить либо путем аминолиза или аммонолиза по мере того, как пептид отщепляется от носителя.METHOD OF SOLID-PHASE SYNTHESIS OF PEPTIDES of general formula
R 1 R 2 R 3 Ser Tyr R 4 Leu R 5 - Pro R 6 ,
where R 1 selected from the group pyro-Glu, N-AcD Nal;
R 2 His, DpClPhe, DpFPhe;
R 3 Trp, DTrp;
R 4 DNal (2), DhArg (Et) 2 , DhArg (Bu), DhArg (CH 2 CF 3 ) 2 ;
R 5 Arg, L-Arg (Et) 2 , L h Arg (Bu), L h Arg (CH 2 CF 3 ) 2 ;
R 6 GlyNH 2 , DAla NH 2 ,
which includes the following steps: attaching N α protected terminal amino acids to an inert solid carrier; subsequent addition of other N α protected amino acids to the expandable peptide chain; removal at the end of each cycle of the protective group; cleavage of the polypeptide from the carrier; isolation of the resulting polypeptide, characterized in that the serine side chain is temporarily protected by a group labile with respect to the agents used to remove α amino protecting groups, and the histidine side chain, if present, is protected by a group labile with respect to the agent for removing a amino protecting groups while the group protecting the side chain of histidine can be removed either by aminolysis or ammonolysis as the peptide is cleaved from the carrier.
SU5001257 1991-08-12 1991-08-12 Method of solid-phase peptide synthesis RU2043362C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU5001257 RU2043362C1 (en) 1991-08-12 1991-08-12 Method of solid-phase peptide synthesis

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU5001257 RU2043362C1 (en) 1991-08-12 1991-08-12 Method of solid-phase peptide synthesis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2043362C1 true RU2043362C1 (en) 1995-09-10

Family

ID=21585040

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU5001257 RU2043362C1 (en) 1991-08-12 1991-08-12 Method of solid-phase peptide synthesis

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2043362C1 (en)

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Патент США N 4234571, кл. A 61K 37/00, опублик. 1980. *
Шредер Э., Любке К. Пептиды, М.: Мир, 1967, т.1, с.398. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6008058A (en) Cyclic peptide mixtures via side chain or backbone attachment and solid phase synthesis
AU744812B2 (en) Process for the preparation of resin-bound cyclic peptides
US5602231A (en) Process for making peptides
WO2011000848A1 (en) Solid phase peptide synthesis of peptide alcohols
US5212288A (en) Temporary minimal protection synthesis of serine-containing polypeptides
EP0518656B1 (en) Solid phase peptide synthesis
US3988307A (en) Solid phase synthesis of peptides with carboxyl-terminal amides
CA2432708C (en) Process for the synthesis of a peptide having a trp residue
RU2043362C1 (en) Method of solid-phase peptide synthesis
CA2036657C (en) Temporary minimal protection synthesis of lh-rh analogs
US6448031B1 (en) Process for producing LH-RH derivatives
US4301066A (en) Preparation of (D-Trp 6)-LH-RH via the heptapeptide H-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
AU2002222439A1 (en) Process for the synthesis of a peptide having a tryptophan residue
US5432263A (en) Process for producing peptides with side chains containing imidazolinylamino, tetrahydropyrimidinylamino, or alkylguanidinyl groups
IL97216A (en) Temporary minimal protection solid phase synthesis of lh-rh analogs
US4212797A (en) Synthetic pentapeptide having opiate agonist activity
JP3249915B2 (en) Method for producing LH-RH derivative
Yonezawa et al. SOLID PHASE SYNTHESIS OF PORCINE LH‐RELEASING HORMONE WITH HYDROGEN CHLORIDE IN FORMIC ACID AS THE DEBLOCKING REAGENT
Hardy Amino-acids and peptides
KR20010022632A (en) Process for Producing LH-RH Derivatives