RU2042358C1

RU2042358C1 - Method of preparing factor ix concentrate

Info

Publication number: RU2042358C1
Authority: RU
Inventors: А.М. Зейналов; М.А. Ажигирова; Е.П. Вязова; В.А. Лазарев
Original assignee: Товарищество с ограниченной ответственностью "Гемскан"
Priority date: 1992-02-20
Filing date: 1992-02-20
Publication date: 1995-08-27

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves sorption of factor IX on sorbent DEAE-Toyopearl from cryosupernatant of donor plasma, ion-exchanger washing, elution of factor IX, dialysis and concentration of the end product on the semipermeable hole fibers. EFFECT: improved quality of product, increased specific activity (units per mg protein), increased yield of product. 2 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к созданию препаратов крови на основе фракционирования донорской плазмы. The invention relates to medicine, in particular to the creation of blood products based on fractionation of donor plasma.

Известны способы получения концентрата фактора IX (протромбинового комплекса), являющегося антигемофильным препаратом, путем фракционирования криосупернатанта донорской плазмы с помощью таких адсорбентов, как фосфат кальция, гидроокись алюминия и сульфат бария. Однако низкая специфичность этих адсорбентов по отношению к протромбиновому комплексу не позволяет обеспечить достаточно полное удаление балластных белков, что отрицательно сказывается на качестве и выходе конечного продукта, вследствие чего данные адсорбенты не нашли широкого применения. Known methods for producing a concentrate of factor IX (prothrombin complex), which is an antihemophilic drug, by fractionation of the cryosupernatant of donor plasma using adsorbents such as calcium phosphate, aluminum hydroxide and barium sulfate. However, the low specificity of these adsorbents with respect to the prothrombin complex does not allow sufficiently complete removal of ballast proteins, which negatively affects the quality and yield of the final product, as a result of which these adsorbents are not widely used.

Наиболее близким к предлагаемому аналогом, решающим ту же задачу и нашедшим практические применение, в том числе и в производственных масштабах, является способ получения концентрата фактора IХ, основанный на анионообменной хроматографии, где в качестве адсорбента применяют анионообменник ДЕАЕ-Сефадекс А 50. Способ включает стадии сорбента протромбированного комплекса на носителе, промывки носителя, элюции сорбированного комплекса, его обессоливание гельфильтрацией и последующую стерильную фильтрацию и лиофилизацию. The closest to the proposed analogue, which solves the same problem and has found practical application, including on a production scale, is a method for producing a concentrate of factor IX based on anion exchange chromatography, where an DEAE-Sephadex A 50 anion exchanger is used as an adsorbent. The method includes the steps sorbent of a prothrombosed complex on a carrier, washing of the carrier, elution of the sorbed complex, its desalination by gel filtration and subsequent sterile filtration and lyophilization.

Недостатком способа являются значительные загрязнения получаемого продукта балластными белками, обусловленные недостаточной специфичностью сорбента по отношению к протромбиновому комплексу и снижающие эффективность и качество препарата. Это заставляет производителей искать дополнительные пути очистки, что неизбежно приводит к уменьшению выхода конечного продукта. Снижают выход также потери в процессе гельфильтрации на стадии обессоливания. The disadvantage of this method is significant contamination of the resulting product with ballast proteins, due to the lack of specificity of the sorbent with respect to the prothrombin complex and reducing the effectiveness and quality of the drug. This forces manufacturers to seek additional purification routes, which inevitably leads to a decrease in the yield of the final product. Losses during gel filtration at the stage of desalination also reduce the yield.

Цель предлагаемого изобретения улучшение качества получаемого концентрата фактора IX и увеличение выхода конечного продукта. The purpose of the invention is improving the quality of the resulting concentrate of factor IX and increasing the yield of the final product.

Для этого стадия фракционирования осуществляется на анионообменнике ДЕАЕ-Тойоперл вместо ДЕАЕ-Сефадекс А-50, что позволяет на первом же этапе получить высокоочищенный протромбиновый комплекс. Предлагаемый способ включает стадии сорбции, промывки, элюции протромбинового комплекса. При этом во избежание дополнительных потерь стадию обессоливания осуществляют не гельфильтрацией, а с использованием полых волокон с последующими стерильной фильтрацией и лиофилизацией. For this, the fractionation stage is carried out on a DEAE-Toyoperl anion exchanger instead of DEAE-Sephadex A-50, which allows one to obtain a highly purified prothrombin complex at the first stage. The proposed method includes the stage of sorption, washing, elution of the prothrombin complex. Moreover, in order to avoid additional losses, the desalination stage is carried out not by gel filtration, but using hollow fibers, followed by sterile filtration and lyophilization.

В литературе есть указания на применение ДЕАЕ-Тойоперл для разделения методом аналитической колоночной хроматографии различных биополимеров в количествах не более 30 мг. Полые волокна находят применение в пищевой промышленности для ультрафильтрации жидкостей. Использование сорбента и полых волокон в производстве препаратов крови не известно. In the literature, there are indications of the use of DEAE-Toyoperl for the separation by method of analytical column chromatography of various biopolymers in quantities of not more than 30 mg. Hollow fibers are used in the food industry for ultrafiltration of liquids. The use of sorbent and hollow fibers in the production of blood products is not known.

Сравнение сорбционных характеристик анионообменников ДЕАЕ-Сефадекс А-50 и ДЕАЕ-Тойоперл проводилось экспериментальным путем. Результаты, полученные в серии на 5 опытов по взаимодействию исследуемых гелей с криосупернатантом донорской плазмы, представлены в таблице 1. A comparison of the sorption characteristics of the DEAE-Sephadex A-50 and DEAE-Toyoperl anion exchangers was carried out experimentally. The results obtained in a series of 5 experiments on the interaction of the studied gels with the cryosupernatant of donor plasma are presented in table 1.

Как следует из таблицы, оба геля обладают значительным средством к фактору IX (графа 2 и 4), однако ДЕАЕ-Сефадекс А-50 в силу своей высокой емкости по белку (графа 3) сорбирует и балластные по отношению к протромбиновому комплексу белки, что подтверждается значениями удельной специфической активности фактора IХ (графа 5), характеризующими качество получаемого продукта. As follows from the table, both gels have a significant tool for factor IX (columns 2 and 4), but DEAE-Sephadex A-50, due to its high protein capacity (column 3), also absorbs ballast proteins with respect to the prothrombin complex, which is confirmed the values of the specific specific activity of factor IX (column 5), characterizing the quality of the resulting product.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о большей специфичности ДЕАЕ-Тойоперл в качестве сорбента фактора IX. Thus, the results obtained indicate a greater specificity of DEAE-Toyoperl as a factor IX sorbent.

Обнаруженные специфические особенности ДЕАЕ-Тойоперл, заключающиеся в способности избирательно сорбировать на своей поверхности фактор IX неизвестны из литературы и выявлены экспериментально. The discovered specific features of DEAE-Toyoperl, which consist in the ability to selectively adsorb factor IX on its surface, are unknown from the literature and are experimentally identified.

Пригодность данного типа геля для технологических целей оценивали по двум параметрам: выход и кратность очистки выделяемого фактора IX. Кратность очистки определяли как отношение удельной специфической активности фактора (ед/мг белка) в элюате к удельной активности исходного криосупернатанта. Данные, полученные в экспериментальных условиях, представлены в табл. 2. The suitability of this type of gel for technological purposes was evaluated according to two parameters: the yield and the purity of purification of the released factor IX. The purification rate was determined as the ratio of the specific specific activity of the factor (u / mg protein) in the eluate to the specific activity of the initial cryosupernatant. The data obtained under experimental conditions are presented in table. 2.

Как следует из таблицы, большая специфичность ДЕАЕ-Тойоперл обеспечивает высокую кратность очистки целевого продукта и позволяет увеличить его выход на этой стадии в 1,5 раза. Выраженная специфичность данного типа геля в сочетании с такими известными из литературы характеристиками, как высокая механическая прочность, устойчивый размер частиц и высокая текучесть, обусловливают его преимущества для использования в технологических целях. As follows from the table, the high specificity of DEAE-Toyoperl provides a high degree of purification of the target product and allows to increase its yield at this stage by 1.5 times. The pronounced specificity of this type of gel in combination with such well-known from the literature characteristics as high mechanical strength, stable particle size and high fluidity, determine its advantages for use in technological purposes.

Поиск альтернативного гельфильтрации метода обессоливания белковых растворов, позволяющего избежать значительных механических потерь, осуществляли путем скрининга существующих методов диализа. В результате был избран метод с использованием полых волокон. Конструктивная особенность полых волокон позволяет извлекать конечный раствор практически без механических потерь, что положительно сказывается на величине общего выхода концентрата фактора IX. Кроме того, применение полупроницаемых волокон обеспечивает, помимо удаления избыточного количества солей, концентрирование полученного продукта что влечет за собой снижение объема раствора готового продукта, подлежащего фильтрации и лиофилизации, и приводит к упрощению процесса. The search for an alternative gel filtration method for desalting protein solutions, which avoids significant mechanical losses, was carried out by screening existing dialysis methods. As a result, a method using hollow fibers was chosen. The design feature of the hollow fibers allows the final solution to be extracted with virtually no mechanical loss, which positively affects the total yield of factor IX concentrate. In addition, the use of semipermeable fibers provides, in addition to removing excess salts, concentration of the resulting product, which entails a decrease in the volume of the solution of the finished product to be filtered and lyophilized, and simplifies the process.

Способ осуществляют следующим образом. The method is as follows.

Криосупернатант плазмы размораживали при +4^оС и смешивали с гелем в соотношении 20-30 мл геля на 1 л плазмы при комнатной температуре. Смесь выдерживали 40-60 мин при 25^оС. После отделения геля с сорбированным белком его промывали 2-3-кратным объемом (по отношению к гелю) физиологического раствора (0,15 М NaCl) для удаления неадсорбированных белков. Элюцию протромбинового комплекса осуществляли последовательным увеличением молярности NaCl от 0,8 М до 2,0 М.Cryosupernatant plasma was thawed at 4 ^{° C} and mixed with the gel in a ratio of 20-30 ml of gel per 1 liter of plasma at room temperature. The mixture was incubated 40-60 min at 25 ° ^C. After separation of the gel with protein sorbed it was washed with a 2-3-fold volume (relative to the gel) saline (0.15M NaCl) to remove non-adsorbed proteins. The prothrombin complex was eluted by sequentially increasing the molarity of NaCl from 0.8 M to 2.0 M.

Элюат диализовали на полых волокнах против 3-кратного объема 0,15 М раствора NaCl, содержащего 0,03 М цитрата натрия и 0,05 М глицина. Отдиализованный раствор концентрировали в 4-5 раз. Выделенный и сконцентрированный раствор протромбинового комплекса подвергали стерилизующей фильтрации через фильтры 0,22 мк системы Миллипор, разливали в стерильные флаконы по 10-20 мл и подвергали лиофилизации. The eluate was dialyzed on hollow fibers against a 3-fold volume of a 0.15 M NaCl solution containing 0.03 M sodium citrate and 0.05 M glycine. The dialyzed solution was concentrated 4-5 times. The isolated and concentrated solution of the prothrombin complex was subjected to sterilizing filtration through 0.22 micron filters of the Millipore system, poured into sterile 10-20 ml vials and lyophilized.

Качественные показатели полученного протромбинового комплекса по предлагаемому способу исследовали методом перекрестного иммуноэлектрофореза против антисыворотки к белкам плазмы человека. Полученные иммуноэлектрофореграммы свидетельствуют о значительно более высокой очистке продукта, выделенного по предлагаемому способу. Число пиков преципитатов, соответствующее числу сывороточных белков, содержащихся в исследуемом образце, значительно меньше в случае использования ДЕАЕ-Тойоперл, причем большая их часть присутствует в следовых количествах. Qualitative indicators of the obtained prothrombin complex according to the proposed method was investigated by cross-immunoelectrophoresis against antiserum to human plasma proteins. The obtained immunoelectrophoregrams indicate a significantly higher purification of the product isolated by the proposed method. The number of precipitate peaks corresponding to the number of whey proteins contained in the test sample is significantly less in the case of DEAE-Toyoperl, and most of them are present in trace amounts.

П р и м е р 1. 9,25 л криосупернатанта плазмы смешивали с 14 г сухого ДЕАЕ-Сефадекс и перемешивали в течение 45 мин. Гель промывали 5 раз по 1 л 0,15 М раствором NaCl. Смыв протромбинового комплекса с геля проводили с порциями по 200 мл 7 раз М NaCl с добавлением 0,015 М глицина и 0,015 М среднего цитрата натрия. Концентрация белка в элюате до концентрирования составила 1,13% специфическая активность 2 ед/мл; после концентрирования 3,3% и 5 ед/мл соответственно. После стерильной фильтрации удельная специфическая активность конечного продукта составила 0,2 ед/мг, выход 24%
П р и м е р 2. 24,7 л криосупернатанта плазмы смешивали с 500 мл ДЕАЕ-Тойоперл и перемешивали в течение 50 мин. Гель, содержащий сорбированный фактор IX, промывали порциями 10 л 0,15 М раствора NaCl. Элюцию протромбинового комплекса осуществляли 3,5 л раствора 2,0 М NaCl, содержащего 0,015 М глицина и 0,015 М среднего цитрата натрия. Концентрация белка в элюате составила 0,43% а специфическая активность фактора IX-5,5 ед/мл.Example 1. 9.25 L of plasma cryosupernatant was mixed with 14 g of dry DEAE-Sephadex and stirred for 45 minutes. The gel was washed 5 times with 1 L of 0.15 M NaCl solution. The prothrombin complex was washed off the gel with 200 ml portions of 7 times M NaCl with the addition of 0.015 M glycine and 0.015 M average sodium citrate. The concentration of protein in the eluate before concentration was 1.13%; specific activity 2 u / ml; after concentration, 3.3% and 5 u / ml, respectively. After sterile filtration, the specific specific activity of the final product was 0.2 u / mg, 24% yield
Example 2. 24.7 L of plasma cryosupernatant was mixed with 500 ml of DEAE-Toyoperl and stirred for 50 minutes. The gel containing sorbed factor IX was washed in portions of 10 L of a 0.15 M NaCl solution. The prothrombin complex was eluted with 3.5 L of a solution of 2.0 M NaCl containing 0.015 M glycine and 0.015 M average sodium citrate. The concentration of protein in the eluate was 0.43% and the specific activity of factor IX-5.5 units / ml.

После 4-кратного концентрирования элюата на аппарате АР-0,05, включающем полые волокна, и диализа против 5-кратного объема 0,15 М раствора NaCl, содержащего также 0,015 М глицина и 0,015 М среднего цитрата натрия, выделили концентрат фактора IX с концентрацией белка 1,22% и специфической активностью 10 ед/мл. After a 4-fold concentration of the eluate on an AP-0.05 apparatus, including hollow fibers, and dialysis against a 5-fold volume of a 0.15 M NaCl solution containing also 0.015 M glycine and 0.015 M average sodium citrate, a factor IX concentrate was isolated with a concentration protein 1.22% and specific activity of 10 units / ml.

После стерильной фильтрации и лиофилизации величина удельной специфической активности конечного продукта составила 1,28 ед/мг, выход 43%
П р и м е р 3. 41 л криосуперантанта плазмы смешивали с 1 л ДЕАЕ-Тойоперл и выдерживали в течение 50 мин. Гель промывали 0,15 М раствором NaCl. Элюцию протромбинового комплекса осуществляли 5 мл 2,0 М раствором NaCl, содержащего 0,015 М глицина и 0,015 М среднего цитрата. Концентрация белка в элюате составила 0,40% а специфическая активность фактора IX 3,3 ед/мл.After sterile filtration and lyophilization, the specific specific activity of the final product was 1.28 u / mg, yield 43%
PRI me R 3. 41 l of plasma cryosuperant was mixed with 1 l of DEAE-Toyoperl and kept for 50 minutes. The gel was washed with 0.15 M NaCl. The prothrombin complex was eluted with 5 ml of a 2.0 M NaCl solution containing 0.015 M glycine and 0.015 M average citrate. The protein concentration in the eluate was 0.40% and the specific activity of factor IX was 3.3 u / ml.

После 4-кратного по объему концентрирования элюата и 5-кратого диализа на полых волокнах против 0,15 М раствора NaCl с добавкой 0,015 М глицина и 0,015 среднего цитрата концентрация белка возросла до 1,3% и специфическая активность до 16 ед/мл. After concentration of the eluate 4-fold by volume and 5-fold dialysis on hollow fibers versus 0.15 M NaCl with the addition of 0.015 M glycine and 0.015 average citrate, the protein concentration increased to 1.3% and the specific activity to 16 units / ml.

Удельная специфическая активность стерильного и лиофильно высушенного конечного продукта составила 1,23 ед/мг. выход 51%
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать концентрат фактора IX с улучшенным за счет увеличения удельной специфической активности качеством и повысить выход конечного продукта благодаря сочетанию двух операций проведению адсорбции фактора IX на анионообменнике ДЕАЕ-Тойоперл с повышенным, как было установлено, сродством к протромбиновому комплексу и осуществлению диализа и концентрирования на полупроницаемых полых волокнах.The specific specific activity of the sterile and freeze-dried final product was 1.23 u / mg. yield 51%
Thus, the proposed method allows to obtain a factor IX concentrate with improved quality by increasing specific specific activity and to increase the yield of the final product due to a combination of two operations for the adsorption of factor IX on the DEAE-Toyoperl anion exchanger with an increased affinity for prothrombin complex and implementation dialysis and concentration on semipermeable hollow fibers.

Claims

METHOD FOR PRODUCING A CONCENTRATE OF FACTOR IX of a blood coagulation system, including sorption of factor IX from cryosupernatant of donor plasma on an anion exchanger, washing of an anion exchanger, elution of factor IX, dialysis and concentration of the target product followed by sterile filtration and lyophilization, characterized in that sorption is performed on DEA Toyopearl, and dialysis and concentration are carried out on semipermeable hollow fibers.