RU2040796C1

RU2040796C1 - Method for carrying out polarization analysis

Info

Publication number: RU2040796C1
Application number: RU92005657A
Authority: RU
Inventors: Дмитрий Борисович Берг
Original assignee: Дмитрий Борисович Берг
Priority date: 1992-11-24
Filing date: 1992-11-24
Publication date: 1995-07-25

Abstract

FIELD: measurement technology. SUBSTANCE: method involves placing a sample between two polarizers at an angle of 90 degrees and rotating them relative to the system optical axis. Dependance of the optical signal defined as the intensity of passed light in photometric examination or the image in case of microscopic examination on linear polarization rotation angle relative to the sample is investigated. In case of microscopic examination the received images are superimposed one over another, for example, by means of an image processing computer systems. The resulting image is undergone to the following quantitative analysis. In case of photometric examination a polarization curve is built. The area under the curve depends only on specific share of active optic phase. The curve shape depends only on the type (texture) of the active optic phase, relative disposition of its parts and brings information on the sample morphologic structure. EFFECT: high accuracy in determining the structure of anisotropic biologic liquids. 3 cl, 5 dwg

Description

Изобретение относится к изучению оптических свойств объектов, в частности поляризационной микроскопии и фотометрии, и может быть использовано для анализа анизотропных сред и, в частности, агрегационных структур биологических жидкостей. The invention relates to the study of the optical properties of objects, in particular polarizing microscopy and photometry, and can be used to analyze anisotropic media and, in particular, the aggregation structures of biological fluids.

Известны способы оптического поляризационного анализа, использующие линейнополяризованный свет и заключающиеся в определении характеристик оптической активности исследуемого образца [Ландсберг Г.С. Оптика. 5-е изд. М. 1976 (общий курс физики) с.370-399] Как метод микроскопического исследования поляризационная микроскопия дает возможность судить не только о физических свойствах тканевых (клеточных) структур, но и об их химической природе: определить содержание РНК цитоплазматического ретикулума, судить о степени деполимеризации и количестве ДНК клеток, определить состояние волокнистых структур и вещества соединительной ткани и др. [Серов В.В. "О возможностях метода поляризационной микроскопии в патологических исследованиях"/"Применение новых методов исследования в нормальной и патологической морфологии", Доклады I-й республиканской научной конференции патологоанатомов Молдавской ССР (тезисы), 3-5 октября 1961 г. г.Кишинев]
Взаимодействие линейнополяризованного света с оптически активным образцом (каковым является срез ткани или кристаллизационная проба биологической жидкости), установленным перпендикулярно направлению распространения световой волны, зависит от направления поляризации света по отношению к оптической оси образца [Шерклифф У. Поляризованный свет. пер. с англ. М. 1965. с. 56-57] Это направление в общем случае является произвольным вследствие установки образца на предметом столике микроскопа (или фотометра), что и отражается на результатах измерений: яркость одного и того же оптически активного объекта при различной ориентации может изменяться в широких пределах.Known methods of optical polarization analysis using linearly polarized light and consisting in determining the characteristics of the optical activity of the sample [Landsberg G.S. Optics. 5th ed. M. 1976 (general physics course) p.370-399] As a method of microscopic examination, polarization microscopy makes it possible to judge not only the physical properties of tissue (cell) structures, but also their chemical nature: to determine the RNA content of the cytoplasmic reticulum, to judge the degree depolymerization and the amount of DNA of cells, determine the state of fibrous structures and substances of connective tissue, etc. [Serov V.V. "On the possibilities of the method of polarization microscopy in pathological studies" / "Application of new research methods in normal and pathological morphology", Reports of the 1st Republican Scientific Conference of Pathologists of the Moldavian SSR (theses), October 3-5, 1961 Chisinau]
The interaction of linearly polarized light with an optically active sample (such as a tissue section or a crystallization sample of a biological fluid), set perpendicular to the direction of propagation of the light wave, depends on the direction of polarization of light with respect to the optical axis of the sample [Sherkliff U. Polarized light. trans. from English M. 1965. p. 56-57] This direction is generally arbitrary due to the installation of the sample on the microscope stage (or photometer), which is reflected in the measurement results: the brightness of the same optically active object with different orientations can vary within wide limits.

Большинство образцов имеют поликристаллическую структуру; отдельные оптически активные кристаллиты могут быть ориентированы произвольно [Р.И.Минц, Е.В.Кононенко, "Жидкие кристаллы (мезофазы) в организме человека"//Архив патологии, 1981, Т. XLIII, вып. 7, с. 3-12] Поэтому существует проблема нахождения такого положения образца, при котором все его кристаллиты видны одновременно и одинаково ярко. Most samples have a polycrystalline structure; individual optically active crystallites can be oriented arbitrarily [R.I. Mints, E. V. Kononenko, “Liquid crystals (mesophases) in the human body” // Archive of Pathology, 1981, T. XLIII, no. 7, p. 3-12] Therefore, there is the problem of finding such a position of the sample in which all its crystallites are visible simultaneously and equally brightly.

Таким образом применение описанных способов ограничивает аналитические возможности поляризационных методов исследования. Thus, the application of the described methods limits the analytical possibilities of polarization research methods.

Наиболее близким к заявленному изобретению по сущности используемых методов является "Способ определения индивидуальной чувствительности к лазерному воздействию" (Р.И.Минц, С.А.Скопинов, С.В.Яковлева, В.М.Лисиенко, О.В. Дробинина, М.В.Северин, а.с. N 1635999, опубл. 23.03.91, Бюлл. N 11). Способ заключается в том, что плазму крови больного облучают гелий-неоновым излучением, пробу кристаллизуют между предметным и покровным стеклами и проводят поляризационно-оптическое исследование, при котором измеряют интенсивность света облученной и необлученной плазмы. По разнице интенсивностей устанавливают индивидуальную чувствительность к лазерному излучению. Интенсивность прошедшего света зависит от присутствия в образце оптически активной фазы. Closest to the claimed invention by the essence of the methods used is the "Method for determining individual sensitivity to laser exposure" (R.I. Mints, S. A. Skopinov, S. V. Yakovleva, V. M. Lisienko, O. V. Drobinina, M.V.Severin, A.S. N 1635999, publ. 23.03.91, Bull. N 11). The method consists in the fact that the patient’s blood plasma is irradiated with helium-neon radiation, the sample is crystallized between a glass slide and a cover slip and a polarization-optical study is carried out in which the light intensity of the irradiated and unirradiated plasma is measured. By the difference in intensities, individual sensitivity to laser radiation is established. The intensity of transmitted light depends on the presence of an optically active phase in the sample.

Недостатком этого способа является искажение диагностически важной информации вследствие невыявления части оптически активной фазы. Действительно, обнаружено, что вся оптически активная фаза может быть выявлена только при исследовании образца в пучке света, имеющем переменную линейную поляризацию. The disadvantage of this method is the distortion of diagnostically important information due to the failure to identify part of the optically active phase. Indeed, it was found that the entire optically active phase can be detected only by examining the sample in a light beam having a variable linear polarization.

Техническим результатом данного изобретения является извлечение ранее недоступной информации и получение дополнительных количественных данных о структуре исследуемого образца, что позволяет дать более точное диагностическое заключение о состоянии биологического объекта. Для этого в способе поляризационного анализа тонкослойного образца, предусматривающем воздействие на оптически активный образец биологического объекта линейнополяризованным светом, регистрацию оптического сигнала (изображения оптически активных структур или интегральной интенсивности прошедшего света) после взаимодействия света с образцом и последующий анализ состояния биологического объекта по характеристикам оптического сигнала, отличительной особенностью является то, что регистрацию проводят при нескольких различных направлениях поляризации света относительно образца, а о состоянии биологического объекта судят по результатам совместной обработки сигналов. При поляризационной микроскопии проводят совмещение полученных изображений, а при поляризационной фотометрии строят кривую зависимости интенсивности регистрируемых сигналов от угла поворота. The technical result of this invention is to extract previously inaccessible information and obtain additional quantitative data on the structure of the test sample, which allows you to give a more accurate diagnostic conclusion about the state of the biological object. To do this, in the method of polarization analysis of a thin-layer sample, involving exposure to an optically active sample of a biological object with linearly polarized light, recording an optical signal (image of optically active structures or the integrated intensity of transmitted light) after the light interacts with the sample and subsequent analysis of the state of the biological object according to the characteristics of the optical signal, a distinctive feature is that registration is carried out at several different points. leniyah polarization of light relative to the sample, and the status of the biological object is judged by the results of the joint processing of signals. When polarizing microscopy, the obtained images are combined, and when polarizing photometry, a curve is built of the dependence of the intensity of the recorded signals on the angle of rotation.

При этом выполняют следующие операции. The following operations are performed.

Образец помещают между двумя скрещенными поляризаторами. Затем вращают относительно оптической оси системы и получают различные положения (ориентацию) образца по отношению к направлению линейной поляризации. После прохождения светом через образец регистрируется оптический сигнал (изображение или интегральная интенсивность светового потока), соответствующий различным углам поворота. A sample is placed between two crossed polarizers. Then they rotate about the optical axis of the system and obtain different positions (orientation) of the sample with respect to the direction of linear polarization. After light passes through the sample, an optical signal (image or integrated light intensity) is recorded corresponding to various angles of rotation.

Затем либо каждое из полученных изображений накладывают друг на друга, например, при фотографировании или с использованием компьютерных систем обработки изображения. На итоговом изображении оказываются визуализированы все оптически активные участки образца, которые подвергают последующему количественному анализу. Then, either each of the obtained images is superimposed on each other, for example, when photographing or using computer image processing systems. On the final image, all optically active sections of the sample are visualized, which are subjected to subsequent quantitative analysis.

В другом случае получают поляpизационную кривую, которая представляет собой зависимость интенсивности светопропускания образца от угла поворота направления линейной поляризации. Площадь под кривой не зависит от положения при начальной установке образца в фотометр и относительной ориентации кристаллизатов образца, по значению площади может быть рассчитана удельная доля оптически активной фазы. Формы кривой зависит от типа (текстуры) оптически активной фазы, взаимного расположения ее частей и несет информацию о морфологической структуре образца. Могут быть реализованы как дискретное, так и непрерывное вращение направления линейной поляризации. In another case, a polarization curve is obtained, which is the dependence of the light transmission intensity of the sample on the angle of rotation of the direction of linear polarization. The area under the curve does not depend on the position during the initial installation of the sample in the photometer and the relative orientation of the crystallizates of the sample; the specific fraction of the optically active phase can be calculated from the area. The shape of the curve depends on the type (texture) of the optically active phase, the relative position of its parts and carries information about the morphological structure of the sample. Both discrete and continuous rotation of the linear polarization direction can be realized.

Способ реализуется следующим образом. The method is implemented as follows.

Принципиальная оптическая схема представлена на фиг. 1. Образец 1 помещается между двумя поляризационными фильтрами: поляризатором 2 и анализатором 3, плоскости поляризации которых скрещены под углом 90 градусов. Позади анализатора устанавливается детектор 4, регистрирующий интенсивность прошедшего света. В отсутствие образца, имеющего оптически активную фазу, интенсивность прошедшего света равна нулю. A schematic optical circuit is shown in FIG. 1. Sample 1 is placed between two polarization filters: polarizer 2 and analyzer 3, the polarization planes of which are crossed at an angle of 90 degrees. Behind the analyzer, a detector 4 is installed that records the intensity of transmitted light. In the absence of a sample having an optically active phase, the transmitted light intensity is zero.

На поляризатор падает параллельный пучок света 5. После поляризатора пучок становится линейнополяризованным 6 и имеет интенсивность 1о. При взаимодействии с образцом меняется направление плоскости поляризации части светового потока 7 и его интенсивность становится равной 1р. После прохождения анализатора световой поток 8 имеет интенсивность 1k, что и регистрируется детектором. A parallel light beam 5 is incident on the polarizer. After the polarizer, the beam becomes linearly polarized 6 and has an intensity of 1 °. When interacting with the sample, the direction of the plane of polarization of the part of the light flux 7 changes and its intensity becomes equal to 1p. After passing through the analyzer, the light flux 8 has an intensity of 1k, which is recorded by the detector.

Поляризатор и анализатор вращают синхронно, сохраняя скрещенное положение. При этом меняется светопропускание образца, регистрируемое детектором. The polarizer and analyzer rotate synchronously, maintaining a crossed position. In this case, the light transmission of the sample recorded by the detector changes.

Для использования в поляризационной микроскопии и фотометрии был собран следующий узел (фиг. 2). For use in polarization microscopy and photometry, the following assembly was assembled (Fig. 2).

Образец закрепляется на столике 9 и помещается между поляризатором и анализатором, зафиксированными в скрещенном положении с помощью скобы 10, которая соединена со столиком подвижным шарниром 11, позволяющим скобе свободно вращаться относительно оси столика. Угол поворота скобы контролируется по гониометрической шкале 12 столика. Последний может быть зафиксирован на опоре 13 с установленным на ней детектором. The sample is fixed on the stage 9 and placed between the polarizer and the analyzer, fixed in the crossed position using the bracket 10, which is connected to the table with a movable hinge 11, allowing the bracket to rotate freely relative to the axis of the table. The angle of rotation of the bracket is controlled by the goniometric scale of 12 tables. The latter can be fixed on the support 13 with a detector mounted on it.

П р и м е р 1. Гониометрическая поляризационная микроскопия. PRI me R 1. Goniometric polarization microscopy.

Для использования в поляризационной микроскопии данный узел (фиг. 2) устанавливается вместо предметного столика микроскопа. Последовательное считывание изображений при повороте скобы проводится телевизионной камерой, сопряженной с микроскопом, или фотографируется фотоаппаратом. При анализе изображения суммируются накладываются друг на друга. Полученное в результате изображение несет объективную информацию об оптически активной компоненте образца. Измерение интегральных параметров (напр. удельной площади), проведенные на каждом из промежуточных изображений, позволяют построить зависимость этих параметров от угла поворота, что будет отражать взаимную ориентацию кристаллитов образца. For use in polarizing microscopy, this node (Fig. 2) is installed instead of the microscope stage. The sequential reading of the images when the bracket is rotated is carried out by a television camera, coupled with a microscope, or photographed by a camera. When analyzing the images are summed stacked on top of each other. The resulting image carries objective information about the optically active component of the sample. Measurement of integral parameters (e.g., specific area) carried out on each of the intermediate images allows us to plot the dependence of these parameters on the rotation angle, which will reflect the relative orientation of the crystallites of the sample.

В качестве объекта был взят образец общих липидов сыворотки крови. Анализ фракции липидов широко применяется в клинике для определения нарушений липидного обмена при различных заболеваниях. A sample of total serum lipids was taken as an object. Analysis of the lipid fraction is widely used in the clinic to determine lipid metabolism disorders in various diseases.

На микроскопе ПОЛАМ Р-211 (ЛОМО) с фотографической насадкой МФН-12 телевизионной камерой КТП-82 были засняты два изображения закристаллизованного образца (объектив микроскопа х10), различающиеся ориентацией плоскости поляризации относительно образца на угол 45 градусов, что выявляет максимум различий в его поляризационных свойствах. Данные изображения были оцифрованы и введены в компьютер IBM PC/AT-286 с использованием интерфейсной платы ввода изображения "МEGAFRAME-1" фирмы МЕGAPIXEL (г.Москва) и обработаны по методике [Микрокомпьютеры в физиологии. М. Мир, 1990 г. с. 180-212] Обработка заключалась в получении полной объективной картины распределения оптически активной фазы образца (реконструкция) по двум исходным изображениям путем их бинаризации и последующего сложения (логическая операция "OR") для дальнейшего расчета геометрических параметров оптически активной фазы. On a POLAM R-211 microscope (LOMO) with an MFN-12 photographic attachment, a KTP-82 television camera, two images of a crystallized sample (x10 microscope objective) were taken, differing in the orientation of the plane of polarization relative to the sample by an angle of 45 degrees, which reveals a maximum of differences in its polarization properties. The image data were digitized and entered into the IBM PC / AT-286 computer using the MEGAFRAME-1 image input interface board from MEGAPIXEL (Moscow) and processed according to the method [Microcomputers in Physiology. M. Mir, 1990 p. 180-212] Processing consisted of obtaining a complete objective picture of the distribution of the optically active phase of the sample (reconstruction) over two initial images by binarization and subsequent addition (logical operation "OR") for further calculation of the geometric parameters of the optically active phase.

На фиг. 3 представлены распечатки обоих изображений. Черным цветом показана оптически активная фаза, фон показан белым. Для изображения 3а удельная доля оптически активной фазы составляет 14,3% для изображения 3б-21% При сложении обоих изображений имеем реальное распределение оптически активных структур образца, представленное на фиг. 4. Для него удельная доля оптически активной фазы составляет 29% что соответствует структуре реального объекта. In FIG. 3 shows prints of both images. The optically active phase is shown in black; the background is shown in white. For image 3a, the specific fraction of the optically active phase is 14.3% for image 3b-21%. When both images are combined, we have a real distribution of optically active sample structures, shown in FIG. 4. For him, the specific fraction of the optically active phase is 29%, which corresponds to the structure of a real object.

Изменение условий съемки и обработки изображений может потребовать использования для представления полной поляризационной картины более чем двух исходных изображений. Поэтому при практической реализации предлагаемого способа невозможно заранее указать необходимое количество используемых для одновременного рассмотрения изображений, позволяющих выявить полную поляризационную картину. Changing the conditions of shooting and image processing may require the use of more than two source images to represent the complete polarization picture. Therefore, in the practical implementation of the proposed method, it is impossible to indicate in advance the necessary number of images used for simultaneous consideration, allowing to reveal the complete polarization picture.

Таким образом, применение гониометрической операции с последующей реконструкцией изображения путем сложения исходных позволяет объективизировать изображения исследуемых образцов и получить количественные данные о морфологии и текстуре их оптически активных фаз. Thus, the use of a goniometric operation with subsequent reconstruction of the image by adding the original allows you to objectify the image of the studied samples and to obtain quantitative data on the morphology and texture of their optically active phases.

П р и м е р 2. Гониометрическая поляризационная фотометрия. PRI me R 2. Goniometric polarization photometry.

В поляризационной фотометрии данный узел (фиг. 2) устанавливается на пути хода лучей между источником излучения и детектором светового сигнала. Поворот осуществляется с помощью скобы. Анализируется поляризационная кривая образца. По ней рассчитывается количественный интегральный показатель оптической активности образца. In polarization photometry, this node (Fig. 2) is installed on the path of the rays between the radiation source and the light signal detector. The rotation is carried out using a bracket. The polarization curve of the sample is analyzed. According to it, a quantitative integral indicator of the optical activity of the sample is calculated.

Для реализации данного метода использовался спектрофотометр СФ-26 (ЛОМО) на длине волны l 520 нм, что соответствует максимуму поляризационных характеристик используемых поляризационных светофильтров ПФ Загорского оптико-механического завода. Поляроиды скрещивали и между ними помещали исследуемый образец. Проводили относительные измерения. За 100% был принят световой сигнал, когда на месте образца был установлен третий светофильтр ПФ, ось пропускания которого ориентирована под углом 45 градусов к оси пропускания каждого из пары скрещенных поляризаторов. Отсчет интенсивности светопропускания производили через каждые 3 градуса поворота направления линейной поляризации. Результаты замеров приведены в таблице и иллюстрируются графиком фиг. 3. Точность измерения ± 2% свет, проходящий оптическую систему прибора при отсутствии образца имеет интенсивность около 3% что объясняется неидеальностью светофильтров. Искомый интеграл, рассчитанный по формуле прямоугольников [Бронштейн И.Н. Семендяев К.А. Справочник по математике. М. Наука, 1964 г. с. 390] равен π/60 * (601 ± 40). To implement this method, an SF-26 spectrophotometer (LOMO) was used at a wavelength of l 520 nm, which corresponds to the maximum polarization characteristics of the PF polarizing optical filters used at the Zagorsk Optical and Mechanical Plant. The polaroids were crossed and the test sample was placed between them. Conducted relative measurements. A light signal was adopted for 100% when the third PF filter was installed at the sample site, the transmission axis of which is oriented at an angle of 45 degrees to the transmission axis of each of the pair of crossed polarizers. The light transmission intensity was counted every 3 degrees of rotation of the direction of linear polarization. The measurement results are shown in the table and are illustrated in the graph of FIG. 3. The measurement accuracy is ± 2%; the light passing through the optical system of the device in the absence of a sample has an intensity of about 3%, which is explained by the imperfection of light filters. The desired integral calculated by the formula of rectangles [Bronstein I.N. Semendyaev K.A. Math reference. M. Science, 1964 p. 390] is π / 60 * (601 ± 40).

В связи с необходимостью расширения методов извлечения диагностической информации из биологических жидкостей и тканей организма человека растет интерес к кругу ингредиентов, входящих в состав организма человека, которые могут характеризовать то или иное функциональное его состояние или сигнализировать о наступлении в организме патологических сдвигов. [Н.В.Семенов. Биохимические компоненты и константы жидких сред и тканей человека. Справочник. М. Медицина, 1971 г. с. 6-8] Поэтому в качестве одной из наиболее часто используемых в диагностической практике биологических жидкостей была взята проба мочи. In connection with the need to expand the methods for extracting diagnostic information from biological fluids and tissues of the human body, there is growing interest in the range of ingredients that make up the human body, which can characterize a particular functional state or signal the onset of pathological changes in the body. [N.V. Semenov. Biochemical components and constants of liquid media and human tissues. Directory. M. Medicine, 1971 with. 6-8] Therefore, a urine sample was taken as one of the most frequently used biological fluids in diagnostic practice.

Оптически активная фаза кристаллизационной пробы N 1 была монокристаллитной и занимала 37% ± 3% площади по данным поляризационной микроскопии. Результаты замеров приведены в таблице и иллюстрируются поляризационной кривой 4. Искомый интеграл (по формуле прямоугольников) равен π/60 * (1501 ± 45). The optically active phase of crystallization sample No. 1 was single-crystalline and occupied 37% ± 3% of the area according to polarization microscopy. The measurement results are shown in the table and are illustrated by the polarization curve 4. The desired integral (according to the rectangle formula) is π / 60 * (1501 ± 45).

Тогда удельная доля оптически активной фазы, определенная (реконструированная) по предлагаемому методу, равна 601/1501 40 ± 4, что находится в согласии с данными оптической микроскопии (в пределах погрешности измерений). Then the specific fraction of the optically active phase, determined (reconstructed) by the proposed method, is equal to 601/1501 40 ± 4, which is in agreement with the data of optical microscopy (within the measurement error).

Форма кривой (один максимум) показывает, что образец N 1 имел монокристаллитную структуру. The shape of the curve (one maximum) shows that sample No. 1 had a single-crystalline structure.

Кристаллический образец N 2 состоял из двух кристаллитов примерно одинаковых размеров, ориентированных под углом 42 градуса друг к другу (по данным микроскопии). Результаты замеров приведены в таблице и фиг. 5. Каждый максимум поляризационной кривой соответствует кристаллиту: интенсивность пика пропорциональна размеру кристаллита, взаимное расположение пиков показывает ориентацию кристаллитов друг относительно друга. The crystalline sample N 2 consisted of two crystallites of approximately the same size, oriented at an angle of 42 degrees to each other (according to microscopy). The measurement results are shown in the table and FIG. 5. Each maximum of the polarization curve corresponds to a crystallite: the peak intensity is proportional to the crystallite size, the mutual arrangement of the peaks shows the orientation of the crystallites relative to each other.

Таким образом, применение в поляризационной фотометрии гониометрической операции с последующим анализом поляризационной кривой позволяет объективизировать результаты исследования и получить количественные характеристики оптической активности образца. Thus, the use of a goniometric operation in polarization photometry with the subsequent analysis of the polarization curve makes it possible to objectify the results of the study and to obtain quantitative characteristics of the optical activity of the sample.

Claims

1. METHOD FOR POLARIZING ANALYSIS OF A THIN-LAYER SAMPLE, providing for the action of linearly polarized light on an optically active sample of a biological object, registration of the optical signal after the interaction of the light with the sample and subsequent analysis of the state of the biological object according to the characteristics of the optical signal, characterized in that the registration is carried out for several different directions of polarization light relative to the sample, and the state of a biological object is judged by the results of joint processing signal tk.

2. The method according to claim 1, characterized in that when polarizing microscopy conduct a combination of the obtained images.

3. The method according to p. 1, characterized in that when polarizing photometry build a curve of the dependence of the intensity of the recorded signals from the angle of rotation.