RU2034026C1

RU2034026C1 - Cryoprotecting agent for mammalian cells

Info

Publication number: RU2034026C1
Application number: RU93019966A
Authority: RU
Inventors: Л.А. Елякова; Г.Н. Лихацкая; Т.Н. Звягинцева; Д.Л. Аминин
Original assignee: Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН
Priority date: 1993-04-19
Filing date: 1993-04-19
Publication date: 1995-04-30

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves the use of laminarin or product of its enzymatic transformation - translam as a cryoprotecting agent for mammalian cells. In the presence of these β-1,3;1,6-glucanes from 60 to 90% of mammalian cells are viable after their defrosting. Except for high cryoprotective properties important advantage of laminarin and translam is their inability to penetrate into cells and absence of toxicity. EFFECT: enhanced quality of cryoprotecting agent. 1 dwg, 1 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, биологии и касается криопротекторов животных клеток. The invention relates to medicine, biology and relates to cryoprotectants of animal cells.

Цель изобретения расширение арсенала криопротекторов животных клеток, обеспечивающих получение более высокого процента жизнеспособных клеток после их размораживания. The purpose of the invention is the expansion of the arsenal of cryoprotectants of animal cells, providing a higher percentage of viable cells after thawing.

Для этого используют ламинарин или продукт его ферментативной трансформации транслам в качестве криопротектора животных клеток. В присутствии этих β-1,3; 1,6-глюканов сохраняются жизнеспособными от 60 до 90% животных клеток после их размораживания. Кроме высоких криопротекторных свойств важным достоинством ламинарина или продукта его ферментативной трансформации транслама является то, что эти глюканы, как вещества с высокой молекулярной массой (М. М. 5000 и 8000), не проникают внутрь клетки. Как показали эксперименты, эти вещества не токсичны для клеток в концентрации 100 мг/мл в течение 2 ч после их введения без замораживания клеток, а также в течение 2 ч после размораживания клеток, замороженных в присутствии глюканов. To do this, use laminarine or the product of its enzymatic transformation to translam as a cryoprotector of animal cells. In the presence of these β-1,3; 1,6-glucans remain viable from 60 to 90% of animal cells after thawing. In addition to the high cryoprotective properties, an important advantage of laminarin or the product of its enzymatic transformation of translam is that these glucans, as substances with a high molecular weight (M.M. 5000 and 8000), do not penetrate into the cell. As experiments showed, these substances are not toxic to cells at a concentration of 100 mg / ml for 2 hours after their administration without freezing the cells, and also for 2 hours after thawing of cells frozen in the presence of glucans.

Транслам получают путем ферментативного гидролиза ламинарина и применяют как иммуностимулятор [1]
Криопротекторную активность ламинарина или транслама определяют по жизнеспособности животных клеток после их замораживания и размораживания по стандартной методике [2] В качестве модели используют клетки мышиной карциномы Эрлиха в стационарной фазе роста на 8-9 день после инокуляции.Translam is obtained by enzymatic hydrolysis of laminarin and is used as an immunostimulant [1]
The cryoprotective activity of laminarin or translam is determined by the viability of animal cells after freezing and thawing according to a standard method [2] As a model, Ehrlich murine carcinoma cells are used in the stationary growth phase 8–9 days after inoculation.

П р и м е р 1. Применение ламинарина в качестве криопротектора животных клеток. PRI me R 1. The use of laminarine as a cryoprotector of animal cells.

Клетки мышиной карциномы Эрлиха трижды промывают на холоду фосфатно-солевым буфером (ФСБ), рН 7,4. Исходную суспензию клеток готовят в культуральной среде, состоящей из среды Игла и 300 мкг/мл глютамина. Суспензию клеток разливают по 50 мкл в 96-луточную микроплату "Limbro" и добавляют 50 мкл раствора ламинарина в ФСБ в конечных концентрациях 12,5; 25 и 50 мг/мл. В качестве контроля на микроплату наносят 50 мкл ФСБ, а в качестве положительного контроля 50 мкл сахарозы в тех же конечных концентрациях. Суспензию клеток с криопротекторами перемешивают. Затем плату помещают в пенопластовый контейнер и ставят в холодильник на -20^оС. Через 16 ч плату помещают на 20 мин в сухой термостат при 37^оС. После размораживания клеток проводят оценку их жизнеспособности методом окрашивания трипановым синим. Оказалось, что в суспензии, не содержащей криопротектора, жизнеспособных клеток нет. В присутствии же в суспензии ламинарина сохраняется 60% жизнеспособных клеток, а в присутствии сахарозы сохраняется 50% жизнеспособных клеток.Ehrlich murine carcinoma cells are washed three times in the cold with phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4. An initial cell suspension is prepared in a culture medium consisting of Eagle's medium and 300 μg / ml glutamine. The cell suspension is poured into 50 μl into a 96-day Limbro microplate and 50 μl of a solution of laminarine in PBS at a final concentration of 12.5 are added; 25 and 50 mg / ml. As a control, 50 μl of FSB is applied to the microplate, and 50 μl of sucrose at the same final concentrations as a positive control. The cell suspension with cryoprotectants is mixed. Then the charge was placed in a plastic foam container and placed in a refrigerator at -20 ° ^C. After 16 hours the charge was placed for 20 minutes in a dry oven at 37 ^C. After thawing, the cells assess their viability by trypan blue staining. It turned out that in a suspension containing no cryoprotectant, there are no viable cells. In the presence of laminarine in the suspension, 60% of viable cells are retained, and in the presence of sucrose, 50% of viable cells are retained.

П р и м е р 2. Применение транслама в качестве криопротектора животных клеток. PRI me R 2. The use of translam as a cryoprotector of animal cells.

Получение, замораживание и размораживание клеток проводят как описано в примере 1. В качестве добавки в культуральную среду вводят 50 мкл раствора транслама в ФСБ в конечных концентрациях 12,5; 25 и 50 мг/мл. В качестве контроля на микроплату наносят 50 мкл ФСБ, а в качестве положительного контроля 50 мкл глюкозы в тех же конечных концентрациях. Оценка жизнеспособности клеток после размораживания клеток показала, что в контроле в отсутствии криопротектора жизнеспособных клеток нет. Использование в качестве криопротектора транслама позволяет сохранить жизнеспособными до 90% клеток, тогда как использование глюкозы сохраняет жизнеспособными только 50% клеток. Obtaining, freezing and thawing of cells is carried out as described in example 1. As an additive, 50 μl of a solution of translam in FSB at a final concentration of 12.5 are introduced into the culture medium; 25 and 50 mg / ml. As a control, 50 μl of FSB is applied to the microplate, and as a positive control, 50 μl of glucose at the same final concentrations. Assessment of cell viability after thawing cells showed that in the control in the absence of a cryoprotectant there are no viable cells. Using translam as a cryoprotectant allows up to 90% of the cells to be viable, while the use of glucose keeps only 50% of cells viable.

Результаты определения жизнеспособности клеток мышиной карциномы Эрлиха после их замораживания и размораживания представлены в таблице. The results of determining the viability of Ehrlich murine carcinoma cells after freezing and thawing are presented in the table.

Как видно из таблицы, при использовании одинаковых с сахарозой и глюкозой концентраций (50 мг/мл) применение в качестве криопротектора ламинарина дает лучшие на 10% а транслама на 40% лучшие результаты. As can be seen from the table, when using the same concentrations of sucrose and glucose (50 mg / ml), the use of laminarine as a cryoprotectant gives the best 10% and translama 40% better results.

П р и м е р 3. Применение транслама в смеси с 4%-ным глицерином в качестве криопротектора животных клеток. PRI me R 3. The use of translam in a mixture with 4% glycerol as a cryoprotector of animal cells.

Получение, замораживание и размораживание клеток проводят как описано в примере 1. В культуральную среду вводят 50 мкл смеси транслама и 4%-ного глицерина в ФСБ. Концентрацию глицерина не изменяют, а транслам вводят в конечной концентрации 1,5-12,5 мг/мл. Obtaining, freezing and thawing the cells is carried out as described in example 1. Into the culture medium is injected 50 μl of a mixture of translam and 4% glycerol in PBS. The glycerol concentration is not changed, and translam is administered at a final concentration of 1.5-12.5 mg / ml.

На чертеже представлены результаты определения жизнеспособности клеток после замораживания и размораживания. The drawing shows the results of determining the viability of cells after freezing and thawing.

В качестве криопротекторов в культуральную среду вводили: 1 глицерин в ФСБ в конечной концентрации 4% 2 транслам в ФСБ в конечной концентрации 12,5 мг/мл; 3 глицериновый препарат транслама 14% глицерин и транслам в ФСБ в разных конечных концентрациях 1,5-12,5 мг/мл). As cryoprotectants, the following were introduced into the culture medium: 1 glycerol in FSB at a final concentration of 4%; 2 translam in FSB at a final concentration of 12.5 mg / ml; 3 glycerol drug translama 14% glycerol and translam in FSB in different final concentrations of 1.5-12.5 mg / ml).

Как видно из чертежа, в сочетании с 4%-ным глицерином транслам сохраняет более 50% жизнеспособных клеток, начиная с концентрации 1,5 мг/мл, а в концентрации 12,5 мг/мл сохраняет жизнеспособными 80-90% клеток. Кроме того, оба глюкана не проникают в клетки и не токсичны для них. As can be seen from the drawing, in combination with 4% glycerol, translam retains more than 50% of viable cells, starting from a concentration of 1.5 mg / ml, and at a concentration of 12.5 mg / ml it keeps viable 80-90% of the cells. In addition, both glucans do not penetrate into the cells and are not toxic to them.

Claims

The use of traslam as a cryoprotector of animal cells.