RU2031400C1

RU2031400C1 - Device for indicating luminescence of biological membranes at room temperature

Info

Publication number: RU2031400C1
Authority: RU
Inventors: Виктор Михайлович Абашин; Николай Григорьевич Сергиенко; Виктор Иванович Жуков; Леонид Анатольевич Белоконь; Наталья Сергеевна Бондаренко; Владимир Иванович Мацкивский
Original assignee: Виктор Михайлович Абашин; Николай Григорьевич Сергиенко
Priority date: 1991-06-21
Filing date: 1991-06-21
Publication date: 1995-03-20

Abstract

FIELD: fluorimetric analysis. SUBSTANCE: four rotating disks are introduced into the phosphoroscope; disks are integrated into two pairs. Motionless plate is mounted between disks of each pair of disks. As a result photoelectric unit is protected against external illumination, and fluorescence and chemoluminescence may be indicated at photon counting mode. Phosphoroscope is provided with the second photoelectric unit for indication of fluorescence of specimen to be tested. Cylindrical dish is used which is made of melt quartz. The dish forms closed system together with the cap of port of the phosphoroscope which excludes external air to enter the dish. To detect solid, liquid transparent and non-transparent specimens the mirror is used which reflects exciting light to surface of the specimen when this surface is observed from photoelectric unit position. Liquid solutions are blended by capillary method. Program block is developed which provides alternation of detection in automatic mode of chemoluminescence, fluorescence and so on. Total information may be achieved of condition of technological membrane. EFFECT: improved efficiency. 6 cl, 10 dwg

Description

Изобретение относится к техническим средствам для проведения люминесцентного анализа при исследованиях в биологии, медицине и др. и может быть использовано преимущественно для изучения структурно-функциональной организации биологических мембран, в том числе для решения научно-практических и фундаментальных задач гигиены, фармакологии и токсикологии, сельского хозяйства, экологии и т.д. The invention relates to technical means for conducting luminescent analysis in studies in biology, medicine, etc. and can be used primarily to study the structural and functional organization of biological membranes, including for solving scientific, practical and fundamental problems of hygiene, pharmacology and toxicology, rural economy, ecology, etc.

Одним из важнейших направлений в биологии и медицине является изучение биологических мембран - многокомпонентных надмолекулярных систем, обеспечивающих структурную обособленность и целостность клеток и их внутриклеточных органелл. Практически все фундаментальные жизненные процессы - такие как биоэнергетика, деление клеток, транспорт веществ, возбудимость и проведение нервного импульса, иммунный ответ, двигательная активность и т.д. - осуществляются с прямым или косвенным участием биологических мембран. Как единое функциональное образование они определяют топографию и внутреннее устройство ферментов, полиферментных комплексов и через межмолекулярные взаимодействия регулируют уровень их каталитической активности и специфичности. Благодаря этому разнообразные аспекты функциональной активности мембран определяются их структурной организацией и прежде всего структурно-динамическим состоянием основных компонентов мембран - белков и липидов. Для изучения биологических мембран широко используются биофизические методы исследования. К ним относятся и люминесцентные методы: хемилюминесцентный, фосфоресцентный и метод флуоресцентных зондов. Указанные методы обладают исключительно высокой чувствительностью, быстротой анализа и возможностью исследовать мембраны, не вызывая разрушающего действия. Установлено, что биологические мембраны хемилюминесцируют и фосфоресцируют. Хемилюминесценцию связывают с перекисным окислением липидом и полагают, что она содержит информацию об уpовне радикально-цепных реакций, протекающих в мембранах, о степени насыщенности жирных кислот, входящих в состав липидов, об уровне антиоксидантной активности антиоксидантов, контролирующих интенсивность радикально-цепных реакций, и т.д. фосфоресценцию биологических мембран связывают с ароматическими аминокислотами: триптофаном, тирозином и фенилаланином, входящими в состав практически всех белков, в том числе и мембранных, и полагают, что она содержит информацию о временах жизни в триплетном состоянии вышеупомянутых аминокислот, о жесткости их микроокружения, о структурно-динамических свойств мембранных белков, о структурных перестройках в мембране, которые происходят при физико-химических и физиологических воздействиях на клетку, организм и т.д. Важную информацию дает и метод флуоресцентных зондов. С его помощью можно изучать заряд поверхности мембран, состояние воды в примембранном слое, микровязкость, белково-липидные взаимодействия в мембране и т.д. Таким образом, вышеперечисленные три люминесцентных метода дают возможность получить информацию о статистических и динамических аспектах структурной организации биологических мембран. Однако все это предполагает наличие у исследователя трех соответствующих приборов: хемилюминометра, флуориметра и устройства для регистрации фосфоресценции. Отсюда возникает необходимость в разработке такого устройства, в котором были бы совмещены все три вышеупомянутых прибора, т.е. с помощью данного прибора можно было бы регистрировать хемилюминесценцию, фосфоресценцию и флуоресценцию одного и того же образца и в одних и тех же условиях. One of the most important areas in biology and medicine is the study of biological membranes - multicomponent supramolecular systems that provide structural isolation and integrity of cells and their intracellular organelles. Almost all fundamental life processes - such as bioenergy, cell division, transport of substances, excitability and conduction of a nerve impulse, immune response, physical activity, etc. - are carried out with direct or indirect participation of biological membranes. As a single functional entity, they determine the topography and internal structure of enzymes, multienzyme complexes and, through intermolecular interactions, regulate the level of their catalytic activity and specificity. Due to this, various aspects of the functional activity of membranes are determined by their structural organization and, first of all, by the structural-dynamic state of the main components of the membranes - proteins and lipids. To study biological membranes, biophysical research methods are widely used. These include luminescent methods: chemiluminescent, phosphorescent and the method of fluorescent probes. These methods have extremely high sensitivity, rapid analysis and the ability to examine membranes without causing a destructive effect. It has been established that biological membranes chemiluminescent and phosphoresce. Chemiluminescence is associated with lipid peroxidation and is believed to contain information about the level of radical chain reactions occurring in membranes, the degree of saturation of fatty acids that make up lipids, the level of antioxidant activity of antioxidants that control the intensity of radical chain reactions, and t .d. phosphorescence of biological membranes is associated with aromatic amino acids: tryptophan, tyrosine and phenylalanine, which are part of almost all proteins, including membrane ones, and it is believed that it contains information about the lifetimes in the triplet state of the above amino acids, about the rigidity of their microenvironment, about structural -dynamic properties of membrane proteins, about the structural changes in the membrane that occur during physico-chemical and physiological effects on the cell, body, etc. Important information is also provided by the method of fluorescent probes. Using it, one can study the charge on the surface of membranes, the state of water in the near-membrane layer, microviscosity, protein-lipid interactions in the membrane, etc. Thus, the above three luminescent methods make it possible to obtain information on the statistical and dynamic aspects of the structural organization of biological membranes. However, all this suggests that the researcher has three appropriate devices: a chemiluminometer, a fluorimeter, and a device for recording phosphorescence. This necessitates the development of such a device in which all three of the above-mentioned devices would be combined, i.e. Using this device, chemiluminescence, phosphorescence, and fluorescence of one and the same sample could be recorded under the same conditions.

Известна импульсная фосфороскопическая установка для измерения люминесценции и поглощения [1] , в состав которой входят источник света, монохроматор, фосфороскоп (с дисками), ФЭУ-38, усилитель постоянного тока, самописец. При этом фосфороскоп содержит корпус с входным и выходным окнами, два диска, установленных на валу фосфороскопа и имеющих соответствующие окна, камеру для образца, установленную на оптическом пути возбуждающего света. Между ФЭУ и выходным оком фосфороскопа установлен светофильтр. Known pulsed phosphoroscopic installation for measuring luminescence and absorption [1], which includes a light source, a monochromator, a phosphoroscope (with disks), a PMT-38, a DC amplifier, a recorder. In this case, the phosphoroscope contains a housing with input and output windows, two disks mounted on the shaft of the phosphoroscope and having corresponding windows, a sample chamber mounted on the optical path of the exciting light. A light filter is installed between the PMT and the output window of the phosphoroscope.

К недостаткам данной установки следует отнести низкую светозащиту ФЭУ, невозможность регистрирования слабых сигналов хемилюминесценции и фосфоресценции невозможность регистрировать фосфоресценцию биологических мембран при комнатной температуре, отсутствие перемешивания суспензии биологических мембран. The disadvantages of this setup include the low photomultiplier of the PMT, the inability to register weak chemiluminescence and phosphorescence signals, the inability to record the phosphorescence of biological membranes at room temperature, and the lack of mixing of the suspension of biological membranes.

Наиболее близко по технической сущности к предлагаемому устройству является автоматизированная система для регистрации параметров фосфоресценции при комнатной температуре клеток и их компонентов [2], которая включает в себя осветитель - pтутную лампу ДРК-120 А, монохроматор ЗМГ-3, фосфороскоп с вращающимися дисками, двойной монохроматор ДФС-12, фотоумножитель ФЭУ-39 А, ультракриостат для охлаждения ФЭУ, резонансный усилитель опорного сигнала У2-6, усилитель-повторитель, логарифмический усилитель, быстродействующий потенциометр Н3021-1, АЦП, интерфейс, микроЭВМ "Электроника ДЗ-28", цифропечатающее устройство. The closest in technical essence to the proposed device is an automated system for recording phosphorescence parameters at room temperature of cells and their components [2], which includes a illuminator - a mercury lamp DRK-120 A, a monochromator ZMG-3, a phosphoroscope with rotating disks, double DFS-12 monochromator, FEU-39 A photomultiplier, ultra-cryostat for cooling the PMT, U2-6 resonant reference signal amplifier, repeater amplifier, logarithmic amplifier, H3021-1 high-speed potentiometer, ADC, int interface, microcomputer "Electronics DZ-28", digital printing device.

К недостаткам данной системы следует отнести следующее. Прибор регистрирует только фосфоресцентное излучение биологических мембран и не позволяет наблюдать хемилюминесценцию и флуоресценцию того же самого объекта исследования. Наблюдение фосфоресценции возможно лишь в прозрачных средах, так как прохождение возбуждающего света через исследуемый образец является сквозным, что не позволяет изучать мутные растворы и твердые непрозрачные объекты. Отсутствует механизм перемешивания жидких растворов. Нет приспособления для ввода в измерительную кювету в процессе регистрации фосфоресценции веществ-добавок, представляющих интерес для исследования. Для регистрации фосфоресценции необходимо из раствора с биологическим образцом удалить кислород - тушитель фосфоресценции и флуоресценции. The disadvantages of this system include the following. The device only records the phosphorescent radiation of biological membranes and does not allow to observe the chemiluminescence and fluorescence of the same object of study. Observation of phosphorescence is possible only in transparent media, since the passage of exciting light through the test sample is through, which does not allow the study of turbid solutions and solid opaque objects. There is no mechanism for mixing liquid solutions. There is no device for input into the measuring cell during the registration of phosphorescence of substances-additives of interest for research. To register phosphorescence, it is necessary to remove oxygen, a quencher of phosphorescence and fluorescence, from a solution with a biological sample.

Целью изобретения является расширение функциональных возможностей устройства за счет совмещения в нем трех соответствующих устройств для регистрации при комнатной температуре фосфоресценции, хемилюминесценции и флуоресценции с автоматизацией всех процессов регистрации, что позволяет уменьшить динамическую ошибку измерения путем регистрации с одного образца трех характеристик люминесценции, а также снижение расхода экспериментального материала и материалоемкости. The aim of the invention is to expand the functionality of the device by combining in it three appropriate devices for recording phosphorescence, chemiluminescence and fluorescence at room temperature with automation of all registration processes, which allows to reduce the dynamic measurement error by registering three luminescence characteristics from one sample, as well as reducing consumption experimental material and material consumption.

Цель достигается тем, что в устройстве для регистрации при комнатной температуре фосфоресценции, хемилюминесценции и флуоресценции биологических мембран, включающий источник возбуждающего света, монохроматор, фосфороскоп с вращающимися дисками, кварцевую кювету, фотоэлектронный умножитель (ФЭУ), измерительную электрическую систему, в фосфороскопе дополнительно установлены зеркало, два диска, которые с имеющимися дисками образуют две пары. Эти пары дисков установлены на вращающемся валу фосфороскопа, причем пара дисков со стороны монохроматора формирует импульсы возбуждающего света, а пара со стороны ФЭУ позволяет регистрацию фосфоресценции в промежутке между импульсами возбуждающего света. При этом между дисками в каждой паре введена неподвижная пластина с соответствующим оптическим окном, обеспечивающая защиту ФЭУ от внешнего света и регистрацию фосфоресценции и хемилюминесценции в режиме счета фотонов. Кроме того, фосфороскоп дополнительно снабжен вторым ФЭУ для регистрации флуоресценции, установленным перпендикулярно оптической оси возбуждающего света. Кювета выполнена цилиндрической из плавленого кварца и снабжена устройствами перемешивания и дозатором вводимого реагента. При этом фосфороскоп снабжен блоком автоматики с программным управлением. The goal is achieved by the fact that in a device for recording at room temperature phosphorescence, chemiluminescence and fluorescence of biological membranes, including an exciting light source, a monochromator, a phosphoroscope with rotating disks, a quartz cell, a photomultiplier tube (PMT), a measuring electric system, an additional mirror is installed in the phosphoroscope , two disks that form two pairs with existing disks. These pairs of disks are mounted on a rotating shaft of a phosphoroscope; moreover, a pair of disks from the side of the monochromator generates pulses of exciting light, and a pair from the side of a photomultiplier allows registration of phosphorescence in the interval between pulses of exciting light. In this case, a fixed plate with a corresponding optical window was introduced between the disks in each pair, which ensures PMT protection from external light and registration of phosphorescence and chemiluminescence in the photon counting mode. In addition, the phosphoroscope is additionally equipped with a second PMT for detecting fluorescence mounted perpendicular to the optical axis of the exciting light. The cuvette is made cylindrical of fused quartz and is equipped with mixing devices and a dispenser of the introduced reagent. At the same time, the phosphoroscope is equipped with a programmable automation unit.

То, что в фосфороскопе дополнительно установлено зеркало, обеспечивает регистрацию фосфоресценции твердых, жидких, прозрачных, непрозрачных и мутных образцов, что расширяет круг задач, решаемых на практике. The fact that an additional mirror is installed in the phosphoroscope ensures the registration of phosphorescence of solid, liquid, transparent, opaque and turbid samples, which expands the range of tasks that can be solved in practice.

То, что дополнительно введены два диска, которые с имеющимися дисками образуют две пары, установленные на вращающемся валу фосфороскопа, при этом между дисками в каждой паре введена неподвижная пластина с соответствующим оптическим окном, обеспечивает абсолютную светозащиту ФЭУ. Именно данный признак позволяет использовать режим регистрации счета фотонов, тем самым измерять хемилюминесценцию и фосфоресценцию биологических мембран, поскольку для них характерны исключительно низкие уровни хемилюминесценции и фосфоресценции. The fact that two disks are additionally introduced, which, with the existing disks, form two pairs mounted on the rotating shaft of the phosphoroscope, while a fixed plate with a corresponding optical window is introduced between the disks in each pair, which ensures absolute photomultiplier protection. It is this feature that makes it possible to use the photon counting registration mode, thereby measuring the chemiluminescence and phosphorescence of biological membranes, since they are characterized by extremely low levels of chemiluminescence and phosphorescence.

То, что фосфороскоп дополнительно снабжен вторым ФЭУ для регистрации флуоресценции, установленным перпендикулярно оптической оси возбуждающего света, расширяет возможности предлагаемого устройства при решении широкого круга практических задач и с применением флуоресцентных зондов обеспечивает комплексное исследование структурно-функционального состояния биологических мембран, взаимно дополняя информацию, получаемую с помощью фосфоресценции. The fact that the phosphoroscope is additionally equipped with a second photomultiplier for detecting fluorescence installed perpendicular to the optical axis of the exciting light expands the capabilities of the proposed device for solving a wide range of practical problems and using fluorescence probes provides a comprehensive study of the structural and functional state of biological membranes, complementing the information obtained from using phosphorescence.

То, что кювета выполнена цилиндрической из плавленого кварца, обеспечивает регистрацию хемилюминесценции, фосфоресценции и флуоресценции с одного образца. Плавленый кварц характеризуется минимальной фосфоресценцией в спектральной области, где наблюдается фосфоресценция биологических мембран. The fact that the cuvette is made cylindrical of fused quartz provides the registration of chemiluminescence, phosphorescence, and fluorescence from one sample. Fused silica is characterized by minimal phosphorescence in the spectral region where phosphorescence of biological membranes is observed.

То, что кювета снабжена устройством перемешивания, обеспечивает воспроизводимость результатов, так как процесс перемешивания исключает осаждение клеток и внутриклеточных структур в суспензии. Дозатор вводимого реагента позволяет в любой момент регистрации люминесценции биологического образца ввести реагент, представляющий интерес для исследователя, в частности, при изучении индуцированной хемилюминесценции, что расширяет функциональные возможности предлагаемого устройства. The fact that the cuvette is equipped with a mixing device ensures reproducible results, since the mixing process eliminates the deposition of cells and intracellular structures in suspension. The dispenser of the introduced reagent allows at any time to register the luminescence of a biological sample to introduce a reagent of interest to the researcher, in particular, when studying induced chemiluminescence, which extends the functionality of the proposed device.

То, что фосфороскоп снабжен блоком автоматики с программным управлением, обеспечивает очередность регистрации хемилюминесценции, фосфоресценции и флуоресценции, стандартизацию измерения, снижение трудозатрат, проведение опытов в динамическом режиме и т.д. The fact that the phosphoroscope is equipped with a programmable automation unit ensures the sequence of registration of chemiluminescence, phosphorescence and fluorescence, standardization of measurement, reduction of labor costs, conducting experiments in dynamic mode, etc.

Новым также является то, что введенное зеркало выполнено с алюминиевым покрытием для отражения импульсов возбуждающего света на поверхность образца, просматриваемой со стороны ФЭУ. Данный признак исключает собственную фосфоресценцию зеркала, что нежелательно для регистрации слабых потоков фосфоресценции от биологических мембран. Also new is that the introduced mirror is made with an aluminum coating to reflect pulses of exciting light on the surface of the sample viewed from the PMT side. This feature excludes intrinsic phosphorescence of the mirror, which is undesirable for recording weak phosphorescence fluxes from biological membranes.

Кроме того, новым является и то, что кювета совместно с крышкой люка фосфороскопа образует замкнутую систему, что обеспечивает воспроизводимость опытов, так как влияние кислорода внешнего воздуха практически исключается, при этом устройство перемешивания выполнено в виде капилляра, введенного внутрь кюветы. Для перемешивания в кювете жидких растворов применен способ, лежащий в основе барботирования жидкостей газов (воздухом), однако в данном случае борботирование полностью исключается благодаря использования тонкого капилляра, погруженного в раствор кюветы, в котором столбик жидкости полностью не вытесняется воздухом, поступающим импульсами по резиновому шлангу от резиновой груши с клапаном (от пульверизатора) и приводом для формиpования импульсов давления, в результате чего столбик жидкости в капилляре ведет себя как поршенек, сообщая окружающей капилляр жидкости импульс и таким способом осуществляя необходимое перемешивание раствора, при этом капилляр в силу малых размеров не оказывает существенного влияния на сигнал фосфоресценции изучаемого раствора. Применение капилляра вызвано тем, что все твердые вещества в большинстве своем сильно фосфоресцируют под действием ультрафиолета, поэтому непpименим в качестве перемешивающего материала. In addition, it is new that the cuvette, together with the phosphoroscope manhole cover, forms a closed system, which ensures the reproducibility of experiments, since the influence of oxygen from external air is practically eliminated, while the mixing device is made in the form of a capillary introduced into the cuvette. To mix liquid solutions in a cuvette, the method underlying the bubbling of gas liquids (by air) was used, however, in this case, bubbling is completely eliminated due to the use of a thin capillary immersed in the cell solution, in which the column of liquid is not completely replaced by air coming in by pulses from the rubber hose from a rubber bulb with a valve (from a spray gun) and a drive for generating pressure pulses, as a result of which the column of liquid in the capillary behaves like a piston, reporting an impulse circulating the capillary and thus performing the necessary mixing of the solution, while the capillary, due to its small size, does not significantly affect the phosphorescence signal of the studied solution. The use of the capillary is due to the fact that all solids, for the most part, strongly phosphoresce under the influence of ultraviolet radiation, therefore it is not suitable as a mixing material.

Кроме того, с целью исследования характера влияния на параметры люминесценции изучаемого образца различных веществ-добавок в крышке люка фосфороскопа вмонтирована труба для ввода иглы дозатора. При этом конструкция крышки выполнена такой, чтобы полностью исключить попадание внешнего света внутрь камеры фосфороскопа. In addition, in order to study the nature of the influence on the luminescence parameters of the studied sample of various additive substances, a tube for introducing the dispenser needle is mounted in the lid of the phosphoroscope. Moreover, the cover design is made so as to completely exclude the ingress of external light into the phosphoroscope chamber.

Новым является также то, что используется ФЭУ, предназначенный для измерения пороговых потоков света, причем ФЭУ работает в режиме счета фотонов, что позволяет работать вблизи теоретического предела чувствительности, а это дает возможность анализировать тонкие измерения в структурно-функциональной организации биомембран. Also new is the use of PMTs designed to measure threshold light fluxes, and PMTs operate in the photon counting mode, which allows working near the theoretical sensitivity limit, and this makes it possible to analyze subtle measurements in the structural and functional organization of biomembranes.

Новым также является то, что второй ФЭУ соединен с фосфороскопом через блок, содержащий сменный светофильтр и регулируемую щель. При этом ФЭУ используется в режиме аналогового усиления. Использование таких признаков технического решения обеспечивает оптимальную компоновку трех каналов, соответственно измеряющих хемилюминесценцию, фосфоресценцию и флуоресценцию. Also new is the fact that the second PMT is connected to the phosphoroscope through a unit containing a replaceable light filter and an adjustable slit. In this case, the PMT is used in analog amplification mode. The use of such features of a technical solution provides an optimal arrangement of three channels, respectively, measuring chemiluminescence, phosphorescence and fluorescence.

Новым является и то, что блок автоматики включает в себя скоростной и медленный электродвигатели, связанные с валом фосфороскопа, два электромагнита, один из которых соединен со шторкой, перекрывающей в нужный момент времени доступ возбуждающего света к образцу, а друг соединен с муфтой, обеспечивающей в заданный момент времени связь медленного электродвигателя с валом фосфороскопа, при этом скоростной электродвигатель снабжен регулятором и счетчиком оборотов. New is the fact that the automation unit includes high-speed and slow electric motors connected to the phosphoroscope shaft, two electromagnets, one of which is connected to the shutter, which blocks the access of the exciting light to the sample at the right time, and the other is connected to the coupling, which provides a predetermined point in time is the connection of a slow electric motor with a phosphoroscope shaft, while the high-speed electric motor is equipped with a regulator and a rev counter.

Для обеспечения очередности и стандартизации условий регистрации хемилюминесценции, фосфоресценции и флуоресценции изучаемого образца разработан на базе шагового искателя ШИ-25/8 блок программы, который позволяет осуществить пять режимов регистрации в следующей последовательности: регистрацию фосфоресценции кварцевой кюветы без образца; регистрацию спонтанной хемилюминесценции введенного в кювету образца, возбуждающий свет при этом перекрыт шторкой; регистрацию фосфоресценции образца; регистрацию индуцированной хемилюминесценции (введение в кювету индуктора, например двухвалентного железа, перекиси водорода и др.), возбуждающий свет перекрыт шторкой; регистрацию фосфоресценции образца в присутствии вещества (индуктора), введенного в предыдущем режиме. Регистрация флуоресценции образца осуществляется во втором и четвертом режимах по окончании регистрации хемилюминесценции, при этом параллельно регистрируются темновой ток первого ФЭУ и флуоресценция вторым ФЭУ, шторка открыта. В третьем и пятом режимах флуоресценция регистрируется одновременно с фосфоресценцией. To ensure the sequence and standardization of the conditions for the registration of chemiluminescence, phosphorescence and fluorescence of the studied sample, a program block was developed on the basis of the step finder SHI-25/8, which allows five recording modes in the following sequence: registration of phosphorescence of a quartz cell without a sample; registration of spontaneous chemiluminescence of the sample introduced into the cuvette, while the exciting light is blocked by a curtain; registration of phosphorescence of a sample; registration of induced chemiluminescence (introduction of an inducer, for example, ferrous iron, hydrogen peroxide, etc.) into the cuvette, the exciting light is blocked by a curtain; registration of the phosphorescence of the sample in the presence of a substance (inductor) introduced in the previous mode. The fluorescence of the sample is recorded in the second and fourth modes at the end of the chemiluminescence registration, while the dark current of the first PMT and the fluorescence of the second PMT are simultaneously recorded, the shutter is open. In the third and fifth modes, fluorescence is recorded simultaneously with phosphorescence.

Команды блока программы исполняет блок автоматики, в функции которого входят во втором и четвертом режимах регистрации закрыть (регистрация темнового тока) и открыть первый ФЭУ (регистрация хемилюминесценции исследуемого образца), исполнительными элементами служат медленный электродвигатель и электромагнит, осуществляющий в нужный момент времени с помощью муфты связь между медленным электродвигателем и валом фосфороскопа; в первом, третьем и пятом режимах обеспечить вращение дисков фосфороскопа с заданной скоростью с помощью регулятора скорости, а также закрыть (регистрация фона) и открыть доступ возбуждающего света к образцу (регистрация фосфоресценции и флуоресценции). Исполнительными механизмами служат скоростной электродвигатель и электромагнит, связанный со шторкой. Commands of the program block are executed by the automation unit, whose functions are to close (registration of dark current) and open the first PMT (registration of the chemiluminescence of the test sample) in the second and fourth recording modes, the executive elements are a slow electric motor and an electromagnet, which carries out at the right time using a coupling the relationship between the slow electric motor and the phosphoroscope shaft; in the first, third and fifth modes, ensure that the phosphoroscope disks rotate at a given speed using the speed controller, and also close (background registration) and allow access of the exciting light to the sample (registration of phosphorescence and fluorescence). The executive mechanisms are a high-speed electric motor and an electromagnet connected to the shutter.

Таким образом, в предлагаемом техническом решении все перечисленные признаки отличаются как от известного устройства-прототипа, так и от аналогов. Поэтому в предлагаемом устройстве благодаря новым признакам обеспечиваются критерии "Существенные отличия", "Новизна" и "Положительный эффект". Thus, in the proposed technical solution, all of the listed features differ both from the known prototype device and from analogues. Therefore, in the proposed device, thanks to new features, the criteria "Significant differences", "Novelty" and "Positive effect" are provided.

На фиг. 1 представлена структурно-функциональная схема устройства для регистрации при комнатной температуре фосфоресценции, хемилюминесценции и флуоресценции биологических мембран; на фиг.2 изображен фосфороскоп, разрез по вертикальной плоскости через ось вала; на фиг.3 - вид А на фиг.2; на фиг. 4 - вид Б на фиг.2; на фиг.5 показана камера фосфороскопа; на фиг.6 - втулка и связанные с нею вращающиеся диски; на фиг.7 и 8 - кварцевая кювета и крышка люка фосфороскопа в отдельности и в рабочем состоянии соответственно; на фиг. 9 показано перемешивающее устройство; на фиг.10 представлены блок программы и блок автоматики (электрическая функциональная схема). In FIG. 1 is a structural and functional diagram of a device for detecting phosphorescence, chemiluminescence, and fluorescence of biological membranes at room temperature; figure 2 shows a phosphoroscope, a section along a vertical plane through the axis of the shaft; figure 3 is a view a in figure 2; in FIG. 4 - view B in figure 2; figure 5 shows the camera phosphoroscope; figure 6 - sleeve and associated with it rotating discs; Figures 7 and 8 show a quartz cuvette and a phosphoroscope manhole cover separately and in working condition, respectively; in FIG. 9 shows a mixing device; figure 10 presents the program block and the automation unit (electrical functional diagram).

Предлагаемое устройство (фиг. 1) состоит из источника 1 возбуждающего света, монохроматора 2, служащего для выделения спектрального участка возбуждения фосфоресценции и флуоресценции изучаемого образца, фосфороскопа 3, который обеспечивает разделение во времени процессов облучения образца, находящегося в кварцевой кювете 4, и регистрации его фосфоресценции, ФЭУ 5, служащего для регистрации флуоресценции образца и подсоединенного к фосфороскопу 3 перпендикулярно направлению распространения возбуждающего света с помощью блока 6, содержащего регулируемую оптическую щель 7 и сменный светофильтр 8, аналогового усилителя 9, сигнал с которого поступает на самописец 10, второго ФЭУ 11, предназначенного для регистрации в режиме счета фотонов хемилюминесценции и фосфоресценции изучаемого образца, электрической измерительной системы 12, состоящей из широкополосного усилителя 13, анализатора 14 импульсов, поступающих от усилителя 13, счетчика 15 импульсов с цифропечатающим устройство 16, блока 17 программы, обеспечивающего очередность регистрации хемилюминесценции, фосфоресценции и флуоресценции, блока 18 автоматики, выполняющего команды блока 17 программы, регулятора 19 скорости вращения дисков фосфороскопа, измерителя 20 скорости вращения дисков, мешалки 21. The proposed device (Fig. 1) consists of a source of exciting light 1, a monochromator 2, which serves to isolate the spectral portion of the excitation of phosphorescence and fluorescence of the studied sample, phosphoroscope 3, which provides a separation in time of the irradiation processes of the sample located in the quartz cuvette 4, and its registration phosphorescence, PMT 5, used to register the fluorescence of the sample and connected to the phosphoroscope 3 perpendicular to the direction of propagation of the exciting light using block 6, containing an adjustable optical slit 7 and a replaceable light filter 8, an analog amplifier 9, the signal from which is fed to the recorder 10, the second PMT 11, intended for registration in the photon counting mode of chemiluminescence and phosphorescence of the sample under study, an electrical measuring system 12, consisting of a broadband amplifier 13, the analyzer 14 pulses from the amplifier 13, the counter 15 pulses with digital printing device 16, block 17 of the program, providing the sequence of registration of chemiluminescence, phosphorescence and fluo rescence, block 18 automation, executing the commands of block 17 of the program, the regulator 19 of the speed of rotation of the disks of the phosphoroscope, meter 20 speed of rotation of the disks, mixer 21.

Фосфороскоп (фиг. 2) содержит вал 22 с подшипниками 23 и 24, два идентичных набора в определенной последовательности металлических квадратных пластин 25. ..38 размером 170х170 мм, крепящихся с помощью винтов к основе 39, представляющей собой полый параллелепипед 170х170х50 мм, выполненный из металлических пластин толщиной 8 мм. Набор состоит из наружной пластины 25 (26) толщиной 8 мм с центральным отверстием для подшипника 23 (24) и оптическим окном 40 (41), двух пластин 27 и 28 (29 и 30) толщиной 3 мм с центральным отверстием диаметром 134 мм, причем внутри пластин 27 и 28 (29 и 30) располагаются светонепроницаемые с оптическим окном вращающиеся диски 31 и 32 (33 и 34) диаметром 130 мм, пластины 35 (36) толщиной 1 мм с центральным отверстием 24 мм и окном, соответствующим по размерам и форме окну наружной пластины 25 (26), пластина 35 (36) разделяет пластины 27 и 28 (29 и 30) и соответственно вращающиеся диски 31 и 32 (33 и 34), обеспечивая надежную защиту ФЭУ 11 от засветки, пластины 37 (38) толщиной 2 мм с центральным отверстием диаметром 14 мм и окном, соответствующим размерам и форме окна наружной пластины 25 (26) набора, при чем пластины 37 и 38 с помощью втулки 42 (см. также фиг.5) совместно образуют кюветное отделение. Диски 31 и 32 (33 и 34) объединены в пары с помощью втулки 43 (фиг.6), насаженной на вал 22. Такая связь обеспечивает диском 31 и 32 (33 и 34) вращательное движение. Назначение дисков 31 и 32 (33 и 34) следующее: в режиме регистрации хемилюминесценции они выполняют функцию шторки: открывают-закрывают ФЭУ 11, обеспечивая при этом надежную светозащиту; в режиме регистрации фосфоресценции они вращаются (скорость вращения дисков регулируется от 10 до 120 об/с) и делают возможным разделение во времени процессов облучения образца и регистрации его фосфоресценции. Диски 31 и 32 и 33 и 34 выполнены из алюминиевой фольги толщиной 0,1 мм. The phosphoroscope (Fig. 2) contains a shaft 22 with bearings 23 and 24, two identical sets in a specific sequence of metal square plates 25. ..38 170x170 mm in size, fastened with screws to the base 39, which is a hollow parallelepiped 170x170x50 mm, made of metal plates 8 mm thick. The set consists of an outer plate 25 (26) 8 mm thick with a central hole for the bearing 23 (24) and an optical window 40 (41), two plates 27 and 28 (29 and 30) 3 mm thick with a central hole with a diameter of 134 mm, and inside the plates 27 and 28 (29 and 30) there are rotating disks 31 and 32 (33 and 34), light-tight with an optical window, with a diameter of 130 mm, plates 35 (36) 1 mm thick with a central hole of 24 mm and a window corresponding in size and shape the window of the outer plate 25 (26), the plate 35 (36) separates the plates 27 and 28 (29 and 30) and, accordingly, the rotating disks 31 32 (33 and 34), providing reliable protection of the PMT 11 from exposure to light, plates 37 (38) 2 mm thick with a central hole with a diameter of 14 mm and a window corresponding to the size and shape of the window of the outer plate 25 (26) of the set, with the plate 37 and 38 by means of a sleeve 42 (see also FIG. 5) together form a cuvette compartment. The disks 31 and 32 (33 and 34) are paired with the sleeve 43 (Fig.6), mounted on the shaft 22. This connection provides the disk 31 and 32 (33 and 34) rotational motion. The purpose of the disks 31 and 32 (33 and 34) is as follows: in the chemiluminescence recording mode, they perform the function of a shutter: they open and close the PMT 11, while ensuring reliable light protection; In the phosphorescence recording mode, they rotate (the rotation speed of the disks is regulated from 10 to 120 r / s) and make it possible to separate in time the processes of sample irradiation and registration of its phosphorescence. The disks 31 and 32 and 33 and 34 are made of aluminum foil with a thickness of 0.1 mm.

Чтобы совместить требования регистрации хемилюминесценции, фосфоресценции и флуоресценции в качестве кюветы 4 применена цилиндрическая пробирка из плавленого кварца высотой 70 мм и диаметром 20 мм. С помощью шлифа 44 из фторопластовой трубки пробирка присоединяется к крышке 45, закрывающей сверху люк 46 фосфороскопа 3. В таком исполнении кварцевая пробирка 4 и крышка 45 в рабочем состоянии представляют собой замкнутую систему (фиг.7 и 8), исключающую доступ внутрь кюветы внешнего воздуха, что обеспечивает воспроизводимость опытов, так как влияние кислорода внешнего воздуха практически исключается. In order to combine the requirements for the registration of chemiluminescence, phosphorescence, and fluorescence, a cylindrical tube made of fused silica with a height of 70 mm and a diameter of 20 mm was used as cell 4. Using a thin section 44 from a fluoroplastic tube, the test tube is attached to the lid 45, which covers the hatch 46 of the phosphoroscope 3 from above. In this design, the quartz test tube 4 and the lid 45 in a working state are a closed system (Figs. 7 and 8), which excludes access to the external cell , which ensures reproducibility of experiments, since the influence of oxygen from external air is practically eliminated.

Люк 46 фосфороскопа 3 представляет собой полый цилиндр диаметром 35 мм, жестко вмонтированный в основу 39 и выступающий над ней на высоту 30 мм (см. также фиг.4). При закрывании люка 46 крышкой 45 люк 46 входит в паз 47 крышки 45 и тем самым в процессе регистрации люминесценции предохраняется ФЭУ от засветки. Аналогично трубка 48 входит в паз дозатора 49 с вводимой иглой 50, и здесь исключается засветка ФЭУ. The hatch 46 of the phosphoroscope 3 is a hollow cylinder with a diameter of 35 mm, rigidly mounted in the base 39 and protruding above it to a height of 30 mm (see also figure 4). When closing the hatch 46 with the lid 45, the hatch 46 enters the groove 47 of the lid 45 and thereby, the PMT is protected from exposure during luminescence recording. Similarly, the tube 48 enters the groove of the dispenser 49 with the introduced needle 50, and the PMT illumination is excluded here.

Существенной деталью фосфороскопа 3 является зеркало 51 с алюминиевым покрытием (фиг. 2 и 3), используемое для отражения возбуждающего света на поверхность изучаемого образца, просматриваемой со стороны ФЭУ 11. Применение зеркала 51 позволяет изучать фосфоресценцию прозрачных и непрозрачных жидких и твердых образцов, а также мутных растворов, каковыми являются растворы, содержащие суспензии живых клеток, их внутриклеточных органелл, (ядра, митохондрии и др.). An essential detail of the phosphoroscope 3 is a mirror 51 with an aluminum coating (FIGS. 2 and 3), used to reflect exciting light onto the surface of the sample under study viewed from the PMT side 11. The use of mirror 51 allows the phosphorescence of transparent and opaque liquid and solid samples to be studied, as well as turbid solutions, which are solutions containing suspensions of living cells, their intracellular organelles, (nuclei, mitochondria, etc.).

На фиг.9 представлено устройство 21 для перемешивания жидких растворов суспензий в малых объемах. Электродвигатель 52 с помощью кривошипно-ползунного механизма 53 приводит в колебательное движение пластину 54 и через нее резиновую грушу 55 (от пульвеpизатора), генерируя в резиновом шланге 56 пульсовое давление воздуха. Противоположный конец шланга 56 надевается на штуцер 57, жестко вмонтированного в крышку 45 (фиг.2, 6, 7), к которому подсоединяется полиэтиленовый капилляр 58. Применение капилляра полностью исключает барботирование раствора, содержащегося в кювете 4, и в то же время осуществляется необходимое перемешивание. Figure 9 presents the device 21 for mixing liquid solutions of suspensions in small volumes. The electric motor 52, using a crank-slide mechanism 53, vibrates the plate 54 and through it the rubber bulb 55 (from the atomizer), generating a pulse air pressure in the rubber hose 56. The opposite end of the hose 56 is put on the fitting 57, rigidly mounted in the cover 45 (Fig.2, 6, 7), to which the polyethylene capillary 58 is connected. The use of the capillary completely eliminates the bubbling of the solution contained in the cuvette 4, and at the same time, the necessary stirring.

Блок 17 программы (фиг.10) содержит шаговый искатель 59, группу реле 60...64, индикацию 66 и имеет электрическую связь со счетчиком 15 импульсов и регистратором 10 (в момент регистрации флуоресценции включает, а по окончании регистрации отключает самописец 10). Блок 18 автоматики (см. также фиг. 3 и 4) включает в себя скоростной 67 и медленный 68 электродвигатели, связанные с валом 22 фосфороскопа 3, и два электромагнита 69 и 70. Электромагнит 69 соединен со шторкой 71, перекрывающей доступ возбуждающего света к кювете 4, электромагнит 70 соединен с муфтой 72, обеспечивающий в заданный момент времени связь медленного электродвигателя 68 с валом 22. Скоростной электродвигатель 67 снабжен регулятором 19 и счетчиком 20 оборотов. Существенными элементами блока 18 автоматики являются жестко связанный с валом 22 диск 73 с отверстием 74 и три пары: осветительная лампочка 75 - светодиод 76, осветительная лампочка 77 - светодиод 78, осветительная лампочка 79 - светодиод 80. Первые две пары 75-76 и 77-78 в режиме регистрации хемилюминесценции (фиг.2) обеспечивают позиции "закрыто ФЭУ 11" и "открыто ФЭУ 11" соответственно. Третья пара 79-80 (фиг.3) контролирует скорость вращения вала 22 и, следовательно, дисков 31 и 32, 33 и 34. The program block 17 (Fig. 10) contains a step finder 59, a relay group 60 ... 64, an indication 66, and is in electrical communication with a pulse counter 15 and a recorder 10 (turns on the recorder at the time of fluorescence recording and disables the recorder 10 at the end of registration). The automation unit 18 (see also Figs. 3 and 4) includes high-speed 67 and slow 68 electric motors connected to the shaft 22 of the phosphoroscope 3, and two electromagnets 69 and 70. The electromagnet 69 is connected to a shutter 71 that blocks the access of exciting light to the cell 4, the electromagnet 70 is connected to the coupling 72, which provides at a given point in time the connection of the slow motor 68 with the shaft 22. The high-speed motor 67 is equipped with a regulator 19 and a counter 20 revolutions. The essential elements of the automation unit 18 are a disk 73 rigidly connected to the shaft 22 with an aperture 74 and three pairs: a light bulb 75 — LED 76, a light bulb 77 — LED 78, a light bulb 79 — LED 80. The first two pairs 75-76 and 77- 78 in the mode of registration of chemiluminescence (figure 2) provide the position of "closed PMT 11" and "open PMT 11", respectively. The third pair 79-80 (figure 3) controls the speed of rotation of the shaft 22 and, therefore, the disks 31 and 32, 33 and 34.

Электрическая функциональная схема, представленная на фиг.10, работает следующим образом. The electrical functional diagram presented in figure 10, operates as follows.

Для запуска блоков программы 17 и автоматики 18 служит команда, поступающая с таймера счетчика 15 одновременно на цифропечатающее устройство 16 (на перевод каретки на новую строку) и маломощное электромагнитное реле 60. Сигнал с реле 60 поступает на реле 61, содержащее две группы контактов. Однако группа контактов реле 61 включена в цепь питания электромагнита шагового искателя 59, другая группа контактов - в цепь реле 62 времени, назначение которого состоит в том, чтобы обеспечить очередность включения электромагнита шагового искателя 59 (первым), электромагнита 70 (вторым) в режиме регистрации хемилюминесценции, так как питание электродвигателя 68 находится под контролем шагового искателя 59 и фотоэлектронного реле 63. Поступивший импульс от реле 61 на электромагнит шагового искателя 59 вызывает переход щетки искателя на очередную группу контактов, подключая к ним соответствующие исполнительные механизмы, обеспечивающие режим регистрации в данный момент либо хемилюминесценции, либо фосфоресценции. To start the blocks of the program 17 and automation 18, a command is sent from the timer of the counter 15 simultaneously to the digital printing device 16 (to transfer the carriage to a new line) and a low-power electromagnetic relay 60. The signal from the relay 60 is transmitted to the relay 61, which contains two groups of contacts. However, the contact group of the relay 61 is included in the power circuit of the electromagnet of the step finder 59, the other group of contacts is in the circuit of the time relay 62, the purpose of which is to ensure the sequence of switching on the electromagnet of the step finder 59 (first), the electromagnet 70 (second) in registration mode chemiluminescence, since the power of the electric motor 68 is controlled by the step finder 59 and the photoelectronic relay 63. The received pulse from the relay 61 to the electromagnet of the step finder 59 causes the transfer of the brush of the finder to the next a group of contacts, connecting to them the appropriate actuators that provide the registration mode at the moment either chemiluminescence or phosphorescence.

Работа устройства. Вначале включается питание ФЭУ 5 и 11, электрической измерительной системы 12, блоков программы 17 и автоматики 18. Нажатием кнопки 65, связанной с шаговым искателем 59, устройство приводится в исходное состояние (ФЭУ 11 закрыто дискетами 35 и 34, доступ возбуждающего света к кювете 4 закрыт шторкой 71). После этого кварцевая кювета 4 заполняется рабочим раствором (без изучаемого образца), подсоединяется к крышке 45 (фиг.7 и 8) и, закрывая люк 46, вводится внутрь камеры фосфороскопа 3 (фиг. 2). Затем на счетчике 15 устанавливается время регистрации отдельного измерения (время выдержки), количество измерений, записываемых в одной строке цифропечатающего устройства 16, и кнопкой 65 диски 31 и 32, 33 и 34 фосфороскопа 3 приводятся в быстрое вращение. Скорость вращения устанавливается исследователем с помощью регулятора 19 и счетчика 20. Включается счетчик 15 и устройство регистрирует фосфоресценцию кварцевой кюветы 4 с рабочим раствором (первый режим). Первая строка (два, три и т.д. до восьми измерений) представляет собой запись регистрации фона (темновой ток), доступ возбуждающего света к кювете 4 перекрыт шторкой 71. После записи первой строки и перевода каретка цифропечатающего устройства 16 на новую строку шторка 71 автоматически открывает доступ возбуждающего света к кювете 4, и регистрируется фосфоресценция кюветы с рабочим раствором (вторая, третья, четвертая строки). С переводом каретки на запись пятой строки шторка 71 автоматически перекрывает доступ возбуждающего света к кювете 4, и снова записывается фон ФЭУ 11. По окончании записи пятой строки диски 31, 32 и 33, 34 автоматически останавливаются, при этом шаговый искатель 59 включает медленный электродвигатель 68, а электромагнит 70 после некоторой задержки (2-4с) подсоединяет его с помощью муфты 72 к валу 22 фосфороскопа 3, вал 22 и, следовательно, диски 31, 32 и 33, 34 вращаются, пока отверстие 74 диска 73 не окажется против фотодиода 76. Свет от лампочки 75, находящейся напротив фотодиода 76, но по другую сторону диска 730 попадает через отверстие 74 на фотодиод 76, срабатывает фотоэлектронное реле 63 и вращение вала 22 прекращается, при этом диски 33 и 34 надежно закрывают ФЭУ 11. Счетчик 15 выключается. После этого извлекается кварцевая кювета 4, вводится в нее (в рабочий раствор) исследуемый материал и снова помещают ее в камеру фосфороскопа 3. Включается счетчик 15, и осуществляется регистрация спонтанной хемилюминесценции исследуемого образца (второй режим). Вначале измеряется темновой ток ФЭУ 11 (первая строка), затем шаговый искатель 59 отключает фотодиод 76, ответственный за состояние "ФЭУ 11 закрыто" и включает фотодиод 78, ответственный за состояние "ФЭУ 11 открыто", и регистрируется хемилюминесценция образца (вторая, третья и четвертая строки), доступ возбуждающего света к кювете закрыт шторкой 71. По окончании записи четвертой строки и перевода каретки устройства 16 на пятую строку шаговый искатель 59 отключает фотодиод 78 и включает фотодиод 76, диски 31, 32 и 33, 34 при этом поворачиваются, закрывают ФЭУ 11, и снова записывается величина темнового тока ФЭУ 11. Одновременно регистрируется флуоресценция с помощью ФЭУ 5, поскольку доступ возбуждающего света к образцу в момент записи пятой строки открыт. По окончании записи пятой строки, т.е. темнового тока, устройство автоматически переходит в режим регистрации фосфоресценции образца (третий режим). Регистрация фосфоресценции образца осуществляется по той же схеме, что и в первом режиме, причем сигнал фона в данном режиме представляет собой сумму сигналов темнового тока ФЭУ 11 и спонтанной хемилюминесценции образца. По окончании регистрации фосфоресценции образца устройство автоматически переходит к регистрации индуцированной хемилюминесценции (четвертый режим). Схема регистрации в этом режиме та же, что и во втором режиме с той лишь разницей, что вначале записи второй строки в кювету с образцом с помощью дозатора 49 вводится вещество-индуктор (двухвалентное железо, перекись водорода и т.д.). Доступ возбуждающего света к образцу в этом режиме открыт при записи пятой строки, в этот момент одновременно с темновым током ФЭУ 11 регистрируется флуоресценция образца в присутствии добавленного вещества-индуктора. По окончании четвертого режима регистрации устройство автоматически переходит в последний пятый режим, при котором регистрируется фосфоресценция образца в присутствии вещества-индуктора, введенного в четвертом режиме. С окончанием пятого режима регистрации устройство автоматически возвращается в исходное состояние, т. е. ФЭУ 11 закрыто, доступ возбуждающего света к кювете также закрыт. В этом состоянии можно извлекать из камеры фосфороскопа 3 кварцевую кювету 4, освободиться от образца, тщательно обработать кювету и снова заполнить рабочим раствором для последующих измерений. The operation of the device. First, the power of the PMT 5 and 11, the electrical measuring system 12, program blocks 17 and automation 18 is turned on. By pressing the button 65 associated with the step finder 59, the device is restored to its initial state (the PMT 11 is closed by floppy disks 35 and 34, the access of exciting light to the cell 4 closed with a curtain 71). After this, the quartz cuvette 4 is filled with a working solution (without the studied sample), connected to the lid 45 (Figs. 7 and 8) and, closing the hatch 46, is inserted into the phosphoroscope chamber 3 (Fig. 2). Then, on the counter 15, the recording time of a single measurement (exposure time) is set, the number of measurements recorded on one line of the digital printing device 16, and with the button 65, the disks 31 and 32, 33 and 34 of the phosphoroscope 3 are rotated. The rotation speed is set by the researcher using the regulator 19 and the counter 20. The counter 15 is turned on and the device registers the phosphorescence of the quartz cell 4 with the working solution (first mode). The first line (two, three, etc., up to eight measurements) is a background recording record (dark current), the access of the exciting light to the cuvette 4 is blocked by the shutter 71. After recording the first line and transferring the carriage of the digital printing device 16 to a new line of the shutter 71 automatically opens the access of the exciting light to the cell 4, and the phosphorescence of the cell with the working solution is recorded (second, third, fourth lines). With the transfer of the carriage to the recording of the fifth line, the shutter 71 automatically blocks the access of the exciting light to the cuvette 4, and the background of the PMT 11 is recorded again. After the fifth line is recorded, the disks 31, 32 and 33, 34 automatically stop, while the step finder 59 turns on the slow electric motor 68 and the electromagnet 70 after a certain delay (2-4 s) connects it with the help of the coupling 72 to the shaft 22 of the phosphoroscope 3, the shaft 22 and, therefore, the disks 31, 32 and 33, 34 rotate until the hole 74 of the disk 73 is against the photodiode 76 The light from the bulb 75, which is located the photodiode 76, but on the other side of the disk 730 enters the photodiode 76 through the hole 74, the photoelectronic relay 63 is activated and the rotation of the shaft 22 is stopped, while the disks 33 and 34 reliably close the PMT 11. The counter 15 is turned off. After this, a quartz cuvette 4 is removed, the studied material is introduced into it (into the working solution), and it is again placed in the phosphoroscope chamber 3. The counter 15 is turned on and spontaneous chemiluminescence of the test sample is recorded (second mode). First, the dark current of the PMT 11 is measured (first line), then the step finder 59 turns off the photodiode 76 responsible for the state of the PMT 11 is closed and turns on the photodiode 78 responsible for the state of the PMT 11 is open, and the chemiluminescence of the sample is recorded (second, third and fourth row), the access of the exciting light to the cuvette is closed by the shutter 71. After recording the fourth row and transferring the carriage of the device 16 to the fifth row, the step finder 59 turns off the photodiode 78 and turns on the photodiode 76, while the disks 31, 32 and 33, 34 turn, close PMT 11, and again the value of the dark current of the PMT is recorded 11. At the same time, fluorescence is recorded using a PMT 5, since the access of the exciting light to the sample at the time of recording the fifth row is open. At the end of the fifth row, i.e. dark current, the device automatically enters the phosphorescence registration mode of the sample (third mode). Registration of the phosphorescence of the sample is carried out according to the same scheme as in the first mode, and the background signal in this mode is the sum of the signals of the dark current of the PMT 11 and the spontaneous chemiluminescence of the sample. Upon completion of registration of the phosphorescence of the sample, the device automatically proceeds to the registration of induced chemiluminescence (fourth mode). The registration scheme in this mode is the same as in the second mode, with the only difference being that at the beginning of the second row recording, a substance inducer (divalent iron, hydrogen peroxide, etc.) is introduced into the sample cell using the batcher 49. The access of the exciting light to the sample in this mode is opened when the fifth line is recorded, at this moment, simultaneously with the dark current of the PMT 11, the fluorescence of the sample is recorded in the presence of the added inductor substance. At the end of the fourth recording mode, the device automatically switches to the last fifth mode, in which phosphorescence of the sample is recorded in the presence of an inducer substance introduced in the fourth mode. With the end of the fifth registration mode, the device automatically returns to its original state, i.e., the PMT 11 is closed, the access of the exciting light to the cuvette is also closed. In this state, a quartz cuvette 4 can be removed from the phosphoroscope chamber 3, freed from the sample, thoroughly treated the cuvette and again filled with a working solution for subsequent measurements.

П р и м е р 1. Регистрация спонтанной хемилюминесценции сыворотки крови человека (кювета содержала 4 мл трис-буфера и 1 мл сыворотки). PRI me R 1. Registration of spontaneous chemiluminescence of human blood serum (the cuvette contained 4 ml of Tris buffer and 1 ml of serum).

001.004942. 002. 004986 003.004867 Σ₁= 14795; (Σ₁+Σ₅)/2=14810=

004.004978. 005. 004986 006.005012 Σ₂= 15096; Σ₂-

= 285
007.005002. 008. 005208 009.005165 Σ₃= 15376; Σ₃=

= 564
010.005137. 011. 005199 012. 005119 Σ₄= 15455; Σ₄-

=

013.004952. 014. 004984 015. 004890 Σ₅= 14826
Здесь первая (001, 002, 003) и пятая (013, 014, 015) строки - запись регистрации темнового тока, вторая, третья и четвертая строки (004, 005, 006, 007, 008, 009, 010, 011, 012) - запись намерения хемилюминесценции сыворотки крови на фоне темнового тока, время отдельного измерения 10с, числа 004942 и т.д. - количество импульсов за 10 с.001.004942. 002. 004986 003.004867 Σ ₁ = 14795; (Σ ₁ + Σ ₅ ) / 2 = 14810 =

004.004978. 005. 004986 006.005012 Σ ₂ = 15096; Σ ₂ -

= 285
007.005002. 008. 005208 009.005165 Σ ₃ = 15376; Σ ₃ =

= 564
010.005137. 011. 005199 012. 005119 Σ ₄ = 15455; Σ ₄ -

=

013.004952. 014. 004984 015. 004890 Σ ₅ = 14826
Here, the first (001, 002, 003) and fifth (013, 014, 015) lines are the recording recording of dark current, the second, third and fourth lines (004, 005, 006, 007, 008, 009, 010, 011, 012) - a record of the intention of chemiluminescence of blood serum against the background of a dark current, the time of a separate measurement of 10 s, the number 004942, etc. - number of pulses per 10 s.

Обработка представленной цифровой информации заключается в следующем: количество импульсов темнового тока первой строки и количество импульсов пятой строки суммируются, делятся пополам и найденная средняя величина темнового тока вычитается из суммы второй, третьей и четвертой строк, полученные разности затем суммируются, в результате чего находится количество импульсов хемилюминесценции сыворотки крови за 90 с, которое можно принять за показатель измерения. The processing of the presented digital information is as follows: the number of pulses of the dark current of the first line and the number of pulses of the fifth line are summed in half and the found average value of the dark current is subtracted from the sum of the second, third and fourth lines, the resulting differences are then summed, resulting in the number of pulses serum chemiluminescence for 90 s, which can be taken as a measurement indicator.

При разработке предлагаемого способа регистрации слабой хемилюминесценции и фосфоресценции были приняты во внимание результаты анализа, выполненного И.М.Карнаухом, согласно которому для повышения порога чувствительности хемилюминометра и достоверности полученной информации необходимо увеличение времени набора информации, т.е. увеличение времени экспозиции и количества циклов измерений. В заявляемом устройстве минимальное время экспозиции (отдельного измерения) 10 с и минимальное количество измерений темнового тока третий до и три после регистрации хемилюминесценции и фосфоресценции, на долю которой отведены три строки по три измерения в каждой. When developing the proposed method for recording weak chemiluminescence and phosphorescence, the results of the analysis performed by I.M.Karnaukh were taken into account, according to which, to increase the threshold of sensitivity of the chemiluminometer and the reliability of the information received, it is necessary to increase the time for collecting information, i.e. increase in exposure time and the number of measurement cycles. In the inventive device, the minimum exposure time (individual measurements) of 10 s and the minimum number of dark current measurements is the third before and three after the registration of chemiluminescence and phosphorescence, the share of which is allocated to three lines of three measurements each.

П р и м е р 2. Регистрация люминесценции ядер почки белой крысы (кювета содержала 4 мл трис-буфера и 0,2 мл суспензии ядер, в режиме индуцированной хемилюминесценции вводилось 0,05 мл 10^-4%-ного FeSO₄).Example 2. Registration of luminescence of the nuclei of a kidney of a white rat (the cuvette contained 4 ml of Tris buffer and 0.2 ml of a suspension of nuclei; 0.05 ml of 10 ^-4 % FeSO ₄ was introduced in the induced chemiluminescence mode).

001.004030 002.004037 003.004000 12067
004.005272 005.005320 006.005157 15751-12151=3599 ФФ кюветы 007.005328 008.005350 009.005346 16024-12151=3872
010.005385 011.005454 012.005305 16144-12151=3992
013.004083 014.004096 015.004057 12236
001.003870 002.003988 003.004007 11865
004.004458 005.004446 006.004627 13531-12019= 1512 СХЛ 007.004439 008.004360 009.004438 13237-12019=1218
010.004620 011.004421 012.004431 13472-12019=1453
013.004075 014.004173 015.003925 12173
001.004230 002.004318 003.004037 12585
004.010531 005.010780 006.010546 31857-12565=19292 ФФ образца 007.010596 008.010558 009.010435 31589-12565=19024
010.010386 011.010491 012.010225 31102-12565=18537
013.004250 014.00414 015.004153 12545
001.004231 002.003815 003.003919 11965
004.006300 005.005293 006.004516 16109-1208= 4098 ИХЛ 007.004461 008.004278 009.004395 13137-1208=1053
010.004293 011.004589 012.004616 13498-1208=1417
013.004078 014.003959 015.004159 12196
001.004215 002.004313 003.004284 12812
004.008750 005.008723 006.008720 26193-12771= 13421 ФФ_Feобразца 007.008719 008.008719 009.008788 26226-12771=13454
010.008793 011.008766 012.008601 26160-12771=13338
013.004327 014.004261 015.004143 12731
Σ _к= 11464; Σ_схл=4183; Σ_фф=56853-11464=45388; Σ _ихл=6499_;Σ _фф=40264-11464=28800
Здесь фф кюветы - фосфоресценция кюветы; СХЛ - спонтанная хемилюминесценция образца; ФФ образца - фосфоресценция образца; ИХЛ - индуцированная двухвалентным железом хемилюминесценция; ФФ_Fe образца - фосфоресценция образца в присутствии железа.001.004030 002.004037 003.004000 12067
004.005272 005.005320 006.005157 15751-12151 = 3599 TF cells 007.005328 008.005350 009.005346 16024-12151 = 3872
010.005385 011.005454 012.005305 16144-12151 = 3992
013.004083 014.004096 015.004057 12236
001.003870 002.003988 003.004007 11865
004.004458 005.004446 006.004627 13531-12019 = 1512 SHL 007.004439 008.004360 009.004438 13237-12019 = 1218
010.004620 011.004421 012.004431 13472-12019 = 1453
013.004075 014.004173 015.003925 12173
001.004230 002.004318 003.004037 12585
004.010531 005.010780 006.010546 31857-12565 = 19292 FF sample 007.010596 008.010558 009.010435 31589-12565 = 19024
010.010386 011.010491 012.010225 31102-12565 = 18537
013.004250 014.00414 015.004153 12545
001.004231 002.003815 003.003919 11965
004.006300 005.005293 006.004516 16109-1208 = 4098 IHL 007.004461 008.004278 009.004395 13137-1208 = 1053
010.004293 011.004589 012.004616 13498-1208 = 1417
013.004078 014.003959 015.004159 12196
001.004215 002.004313 003.004284 12812
004.008750 005.008723 006.008720 26193-12771 = 13421 FF _Fe sample 007.008719 008.008719 009.008788 26226-12771 = 13454
010.008793 011.008766 012.008601 26160-12771 = 13338
013.004327 014.004261 015.004143 12731
Σ _k = 11464; Σ _cchl = 4183; Σ _ff = 56853-11464 = 45388; Σ _ichl = 6499 _; Σ _ff = 40264-11464 = 28800
Here ff cuvettes - phosphorescence of the cuvette; СХЛ - spontaneous chemiluminescence of a sample; FF of the sample - phosphorescence of the sample; IHL - ferrous chemiluminescence induced; FF _Fe sample - phosphorescence of the sample in the presence of iron.

Обработка данных осуществлена по программе, составленной для микрокалькулятора "Электроника БЗ-34":
ИП1 ИП2 + ИП3 + ПО С/П ИП1 ИП2 + ИП3 + ПА С/П ИП1 ИП2 + ИП3 + ПВ С/П ИП1 ИП2 + ИП3 + ПС С/П ИП1 ИП2 + ИП3 + ПД С/П ИПО ИПД + 2: П9 С/П ИПА ИП9 - ПА С/П ИПВ ИП9 - ПВ С/П ИПС ИП9 - ПС С/П ИПА ИПВ + ИПС + П8 С/П.Data processing was carried out according to the program compiled for the BZ-34 Electronics calculator:
IP1 IP2 + IP3 + PO S / P IP1 IP2 + IP3 + PA S / P IP1 IP2 + IP3 + PV S / P IP1 IP2 + IP3 + PS S / P IP1 IP2 + IP3 + PD S / P IPO IPD + 2: P9 S / P IPA IP9 - PA S / P IPV IP9 - PV S / P IPS IP9 - PS S / P IPA IPV + IPS + P8 S / P.

Таким образом, как видно из описания и примеров, предлагаемое устройство обеспечивает регистрацию хемилюминесценции, фосфоресценции и флуоресценции от одного биологического образца, при этом реализованы различные режимы измерения, в том числе и индуцированная хемилюминесценция. Устройство выполнено настольного типа в малогабаритном исполнении, расход биологического материала не более 0,3 мл (не более 5-6 мг в пересчете на белок), время отдельного измерения широко варьируется (от 1 с до 10 мин), ширина печати от 1 до 6 (по усмотрению исследователя), в качестве показателя принимается количество импульсов за строго определенный промежуток времени (устанавливается исследователем). Возможна обработка данных на микроЭВМ по любой из существующих программ статистических исследований. Потребность такого типа устройств огромна. Thus, as can be seen from the description and examples, the proposed device provides the registration of chemiluminescence, phosphorescence and fluorescence from one biological sample, while various measurement modes are implemented, including induced chemiluminescence. The device is a desktop type in a small-sized version, the consumption of biological material is not more than 0.3 ml (not more than 5-6 mg in terms of protein), the time of an individual measurement varies widely (from 1 s to 10 min), the print width is from 1 to 6 (at the discretion of the researcher), the number of pulses for a strictly defined period of time (set by the researcher) is taken as an indicator. It is possible to process data on a microcomputer for any of the existing statistical research programs. The need for this type of device is huge.

Claims

1. A DEVICE FOR REGISTRATION AT THE ROOM TEMPERATURE OF LUMINESCENCE OF BIOLOGICAL MEMBRANES, including optically coupled radiation source, monochromator, phosphoroscope, cuvette and the first photomultiplier connected to the measuring electric system, and the cuvette is installed in the phosphoroscope of the first axis and is located on the optical phosphoroscope and is located on the optical phosphoroscope and equipped with windows and a rotating shaft on which the first and second disks are installed, characterized in that, in order to expand the functional capabilities of the device due to recording along with the phosphorescence of its fluorescence and chemiluminescence sample, a second photoelectron multiplier, a fluorescence recorder, a shutter, a reagent inlet to the cuvette and a mixing device, a reflecting mirror, two additional disks and two plates with optical windows, are additionally introduced into the device a control unit and an automation unit containing high and low speed electric motors, two electromagnets and a clutch, while the second photoelectronic multiplier is optically coupled n with a cuvette and located so that its optical axis is perpendicular to the optical axis of the source, the shutter is installed between the monochromator and the phosphoroscope, the optical axis of the first photoelectronic multiplier is parallel offset from the axis of the radiation source, the cuvette is optically connected to the radiation source by means of a re-reflecting mirror mounted at an angle in the phosphoroscope to the optical axis of the source, while the cuvette is made cylindrical of fused quartz and connected to a reagent input dispenser and an alternating device They are mounted, additional disks are mounted on the phosphoroscope shaft and form the first and second pairs of disks, respectively, with the first and second disks of the phosphoroscope, while a fixed plate is fixed between the disks in each pair, the optical windows of each plate are aligned with the windows of the phosphoroscope, the input of the control unit is connected to the output of the electric measuring system, the first output of the control unit is connected to the fluorescence recorder, and the second output is connected to the automation unit, while both motors of the automation unit are connected to the shaft of the phosphoroscope, and a low-speed electric motor is connected to the shaft by means of a coupling to which one of the electromagnets is connected, the other electromagnet is connected to the shutter.

2. The device according to claim 1, characterized in that the reflective mirror is made with an aluminum coating.

3. The device according to claim 1, characterized in that, in order to exclude air access to the sample, the cuvette is installed in the phosphoroscope so that together with the lid of the phosphoroscope it forms a closed system, the mixing device is made in the form of a capillary connected to a rubber bulb, while and the nozzle of the dispenser and the capillary through the lid are introduced into the cuvette.

4. The device according to claim 1, characterized in that, in order to register a super-weak glow in the photon counting mode, the measuring electric system includes a serially connected broadband pulse amplifier, an analyzer and a pulse counter, to which a digital printing device is connected.

5. The device according to claim 1, characterized in that it additionally introduces an adjustable slit and a replaceable filter, sequentially installed between the phosphoroscope and the second photoelectronic multiplier.

6. The device according to claim 1, characterized in that, in order to increase the reproducibility of measurements when registering phosphorescence by regulating and stabilizing the speed of the disks in the phosphoroscope, a speed controller and a revolution counter connected to a high-speed engine are additionally introduced into the device.