RU2029564C1

RU2029564C1 - Adsorbent for extracting atherogenic lipoproteins from biological liquids

Info

Publication number: RU2029564C1
Application number: RU92014772A
Authority: RU
Inventors: Ариф Исмаилович Гамзазаде; Сулейман Мадат оглы Насибов
Original assignee: Ариф Исмаилович Гамзазаде; Сулейман Мадат оглы Насибов
Priority date: 1992-12-25
Filing date: 1992-12-25
Publication date: 1995-02-27

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: this adsorbent allows extracting atherogenic lipoproteins from whole flowing blood, plasma and lymph. Such sorbents, modified chitosan N-sulfosuccinate, may be silochrome, macroporous glass or silica gel, either solid, granulated or porous. Optimum diameter of pores ranges from 130 to 250 nm. EFFECT: excellent holding capacity, selectivity relative to atherogenic lipoproteins, marked hemocompatibility, and low cost. 3 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, конкретно к средствам для связывания из биологической жидкости липопротеинов низкой и очень низкой плотности (ЛНП и ЛОНП). The invention relates to medicine, specifically to means for binding low and very low density lipoproteins from biological fluid (LDL and VLDL).

Согласно современным представлениям высокая концентрация ЛНП+ЛОНП в циркулирующей крови является ведущим фактором в развитии атеросклероза. Наиболее эффективным способом снижения уровня ЛНП в крови является их адсорбция специфическими сорбентами. According to modern concepts, a high concentration of LDL + VLDL in the circulating blood is a leading factor in the development of atherosclerosis. The most effective way to lower LDL levels in the blood is to adsorb them with specific sorbents.

Известны сорбенты для связывания атерогенных липопротеинов из плазмы крови, представляющие собой гелевые матрицы, модифицированные сульфополи- сахаридами, обеспечивающими специфичность этих сорбентов по отношению к атерогенным липопротеинам - это сефароза, модифицированная гепарином, и поливиниловый спирт, модифицированный декстрансульфатом. Главным недостатком этих сорбентов является невозможность работы с цельной протекающей кровью из-за плохих гидродинамических свойств гелей и их высокой стоимости. Sorbents for binding atherogenic lipoproteins from blood plasma are known, which are gel matrices modified with sulfopolysaccharides, which ensure the specificity of these sorbents with respect to atherogenic lipoproteins - hepharin-modified sepharose and dextransulfate-modified polyvinyl alcohol. The main disadvantage of these sorbents is the inability to work with whole flowing blood due to the poor hydrodynamic properties of the gels and their high cost.

Известен гемосорбент для извлечения атерогенных липопротеинов полученный иммобилизацией гепарина на поверхности силохрома (СХ) с диаметром пор 100-300 нм. Жесткая матрица - силохром обладает прочностью и устойчивостью в физиологических условиях и большой однородностью пор, что позволяет осуществлять сорбцию непосредственно из крови, а наличие специфического лиганда к ЛНП - гепарина обеспечивает емкость по общему холестерину, равную 8,7 мг/г. Однако, указанный сорбент не обладает высокой емкостью по отношению к атерогенным липопротеинам (7,0 мг/г). Known hemosorbent for the extraction of atherogenic lipoproteins obtained by immobilization of heparin on the surface of silochrome (CX) with a pore diameter of 100-300 nm. A rigid matrix - silochrome possesses strength and stability under physiological conditions and a great uniformity of pores, which allows sorption directly from the blood, and the presence of a specific ligand for LDL - heparin provides a total cholesterol capacity of 8.7 mg / g. However, this sorbent does not have a high capacity with respect to atherogenic lipoproteins (7.0 mg / g).

В патенте описаны сорбенты для извлечения атерогенных липопротеинов из биологических жидкостей, полученные путем модификации органических (целлофан, биогель) и неорганических матриц (макропористое стекло) различными сульфополисахаридами, такими как гепаpин, декстрансульфат натрия (ДС) и хондроитинсульфат и т. д. При этом наибольшей емкостью к атерогенным липопротеинам обладает сорбент на основе макропористого стекла (МПС), содержащий иммобилизованный ДС (65% извлечения). Однако, этот показатель зависит от оптимального сочетания ряда факторов: диаметр пор, размер гранул, молекулярная масса (характеристическая вязкость) ДС, содержание в нем серы. Так, наибольший процент извлечения (65%) отмечен при следующих характеристиках сорбента: размер гранул - 0,08-0,12 мм, мол.м. ДС 7,0 кД (или характеристическая вязкость [η] = 0,027 дл/г), содержание серы 17,7 вес.%. При этом увеличение молекулярной массы с 7,0 кД до 500 кД ([η] = 0,2 дл/г) при прочих равных условиях снижает степень извлечения до 18%. К такому же результату приводит использование ДС с низким (5,7%) содержанием серы. The patent describes sorbents for the extraction of atherogenic lipoproteins from biological fluids obtained by modifying organic (cellophane, biogel) and inorganic matrices (macroporous glass) with various sulfopolysaccharides, such as heparin, sodium dextransulfate (DS) and chondroitin sulfate, etc. the capacity for atherogenic lipoproteins is possessed by a sorbent based on macroporous glass (MPS) containing immobilized DS (65% recovery). However, this indicator depends on the optimal combination of a number of factors: pore diameter, granule size, molecular weight (intrinsic viscosity) of DS, and its sulfur content. So, the highest percentage of extraction (65%) was noted with the following characteristics of the sorbent: granule size - 0.08-0.12 mm, mol.m. DS 7.0 kDa (or intrinsic viscosity [η] = 0.027 dl / g), sulfur content 17.7 wt.%. Moreover, an increase in molecular weight from 7.0 kD to 500 kD ([η] = 0.2 dl / g), ceteris paribus, reduces the degree of extraction to 18%. The use of DS with a low (5.7%) sulfur content leads to the same result.

Недостатками прототипа являются:
Использование гранул размером 0,08-0,12 мм, что не пригодно для перфузии цельной крови, вследствие травматизации форменных элементов. Все используемые в практике гемосорбенты имеют гранулы с диаметром более 0,2 мм.The disadvantages of the prototype are:
The use of granules with a size of 0.08-0.12 mm, which is not suitable for perfusion of whole blood, due to trauma to the formed elements. All hemosorbents used in practice have granules with a diameter of more than 0.2 mm.

Заведомо низкая скорость перфузии (0,3 мл/мин), в то время как в практической гемосорбции скорость перфузии составляет от 40 до 100 мл/мин. Obviously low perfusion rate (0.3 ml / min), while in practical hemosorption, the perfusion rate is from 40 to 100 ml / min.

Использование низкомолекулярного (7,0 кД) и высокозамещенного ДС, получение которого связано с трудностями и использование которого ведет к значительному расходу при иммобилизации его на носителе. The use of low molecular weight (7.0 kD) and highly substituted DS, the receipt of which is associated with difficulties and the use of which leads to significant consumption when immobilizing it on a carrier.

Все перечисленное препятствует использованию данных сорбентов в практической гемосорбции. All of the above impedes the use of these sorbents in practical hemosorption.

Целью изобретения является создание специфического сорбента, позволяющего осуществлять эффективную сорбцию атерогенных липопротеинов из любых биологических жидкостей, включая цельную кровь, обладающего высокой избирательностью к атерогенным липопротеинам и пригодного к использованию в условиях практической гемосорбции. The aim of the invention is the creation of a specific sorbent that allows for effective sorption of atherogenic lipoproteins from any biological fluids, including whole blood, which is highly selective for atherogenic lipoproteins and suitable for use in practical hemosorption.

Цель достигается тем, что сорбент содержит в качестве лиганда N-сульфосукцинат хитозана с молекулярной массой 5-300 кД и содержанием серы 3-9 мас.% со структурной формулой
XT-NHCO-CH-

при весовом соотношении матрица:лиганд = 1:0,003-1: 0,025 (г/г).The goal is achieved in that the sorbent contains as a ligand N-sulfosuccinate chitosan with a molecular weight of 5-300 kDa and a sulfur content of 3-9 wt.% With the structural formula
XT-NHCO-CH-

with a weight ratio of matrix: ligand = 1: 0.003-1: 0.025 (g / g).

Сравнительный анализ с прототипом показывает, что заявляемое техническое решение отличается тем, что в качестве иммобилизуемого полисахарида (лиганда) используют новое, неописанное ранее в литературе соединение. A comparative analysis with the prototype shows that the claimed technical solution is characterized in that as a immobilized polysaccharide (ligand), a new compound is used that is not described previously in the literature.

Из прототипа также следует, что лигандами, пригодными для эффективной сорбции, могут считаться лишь те представители широкого класса сульфополисахаридов, которые обладают мол.м. не более 30 кД при содержании в них серы не менее 15 вес.%. From the prototype it also follows that only those representatives of a wide class of sulfopolysaccharides that have a mol.m. can be considered ligands suitable for effective sorption. not more than 30 kDa with a sulfur content of at least 15 wt.%.

Предлагаемый лиганд обладает сорбционными свойствами по отношению к атерогенным липопротеинам, неочевидными для соединений этого класса, проявляя высокую сорбционную способность при низком содержании серы (3-9 мас.% ). The proposed ligand has sorption properties with respect to atherogenic lipoproteins, which are not obvious for compounds of this class, exhibiting high sorption ability with a low sulfur content (3-9 wt.%).

Предлагаемый в качестве иммобилизуемого лиганда N-сульфосукцинат хитозана получают сульфатированием предварительно малеилированного согласно (6) хитозана пиросульфитом натрия при рН среды 3-6 и мольном соотношении мелеилированный хитозан: пиросульфит натрия 1: 1,5-1:8 в течение 1-5 ч при 35-70^oC с последующим выделением продукта известным способом.The chitosan N-sulfosuccinate proposed as an immobilizable ligand is obtained by sulfating chitosan previously maleylated according to (6) with sodium pyrosulphite at a pH of 3-6 and a molar ratio of meleylated chitosan: sodium pyrosulphite 1: 1.5-1: 8 for 1-5 hours at 35-70 ^o C followed by isolation of the product in a known manner.

Получение и свойства сорбентов с иммобилизованным N-сульфосукцинатом хитозана иллюстрируются следующими примерами:
П р и м е р 1. Подготовка носителя к активации. Образцы гранулированных частиц носителя (СХ, МПС, силикагель (СГ) со средним размером 0,3-0,7 мм обрабатывают 0,2 М водным раствором азотной кислоты в отношении 1:20 при 70-80^oC в течение 3 ч, затем промывают водой до нейтрального значения рН промывных вод и сушат при 500-600^oC в течение 3 ч.The preparation and properties of sorbents with immobilized chitosan N-sulfosuccinate are illustrated by the following examples:
PRI me R 1. Preparing media for activation. Samples of granular carrier particles (CX, MPS, silica gel (SG) with an average size of 0.3-0.7 mm are treated with a 0.2 M aqueous nitric acid solution in a ratio of 1:20 at 70-80 ^o C for 3 hours, then washed with water to a neutral pH of the wash water and dried at 500-600 ^o C for 3 hours

П р и м е р ы 2-4. Активация носителя. PRI me R s 2-4. Media Activation.

П р и м е р 2. 10 г МПС с диаметром пор 200 нм обрабатывают 50 мл 3%-ного водного раствора - γ-аминопропилтриоксисилана при 95-100^oC в течение 6 ч, затем суспензию промывают водой до нейтрального значения рН промывных вод и сушат в вакууме при 60^oC. Количество введенных аминогрупп - 0,3 ммоль/г.PRI me R 2. 10 g of MPS with a pore diameter of 200 nm is treated with 50 ml of a 3% aqueous solution of γ-aminopropyltrioxysilane at 95-100 ^o C for 6 h, then the suspension is washed with water until the pH of the wash water is neutral and dried in vacuum at 60 ^o C. the Number of introduced amino groups - 0.3 mmol / g

П р и м е р 3. К 10 г МПС с диаметром пор 70 нм добавляют 150 мл толуола и 6 мл глицидоксипропилтриоксисилана, кипятят в течение 8 ч, затем суспензию промывают толуолом, ацетоном и сушат в вакууме при 60^oС. Количество введенных аминогрупп -0,21 ммоль/г.PRI me R 3. To 10 g of MPS with a pore diameter of 70 nm add 150 ml of toluene and 6 ml of glycidoxypropyltrioxysilane, boil for 8 hours, then the suspension is washed with toluene, acetone and dried in vacuum at 60 ^o C. the Number of introduced amino groups -0.21 mmol / g.

П р и м е р 4. К 10 г МПС с диаметром пор 40 нм добавляют 30 мл 0,01М водного раствора NaOH и 5 мл диглицидилового эфира диэтиленгликоля, перемешивают в течение 6 ч, и выдерживают при комнатной температуре 12 ч, затем суспензию промывают водой до нейтрального значения рН промывных вод и сушат в вакууме при 60^oC. Количество введенных эпоксигрупп - 0,19 ммоль/г.PRI me R 4. To 10 g of MPS with a pore diameter of 40 nm add 30 ml of 0.01 M aqueous solution of NaOH and 5 ml of diglycidyl ether of diethylene glycol, stirred for 6 hours, and kept at room temperature for 12 hours, then the suspension is washed water to a neutral pH of the wash water and dried in vacuum at 60 ^o C. the Number of introduced epoxy groups - 0.19 mmol / g

Примеры 5-8. Приготовление адсорбентов. Examples 5-8. Preparation of adsorbents.

П р и м е р 5. К 1 г активированного по примеру 3 носителя добавляют 5 мл 1,5% -ного раствора N-сульфосукцината хитозана (мол.м. - 250 кД, cера 7,5% ) в 0,5%-ном растворе NaOH, перемешивают в течение 1 ч. при комнатной температуре, суспензию фильтруют, промывают 10%-ным раствором NaCl, водой и сушат. Весовое соотношение матрица:лиганд (г/г) = 1:0,0185. PRI me R 5. To 1 g of the activated according to example 3 media add 5 ml of a 1.5% solution of chitosan N-sulfosuccinate (mol. - 250 KD, sulfur 7.5%) in 0.5% solution of NaOH, stirred for 1 h at room temperature, the suspension is filtered, washed with 10% NaCl solution, water and dried. Weight ratio matrix: ligand (g / g) = 1: 0.0185.

П р и м е р 6. К 1 г активированного по примеру 4 носителя добавляют 5 мл 1,5%-ного раствора N-сульфосукцината хитозана (мол.м. -250 кД, сера 9,0% ) в 0,5%-ном растворе NaOH, перемешивают в течение 18 ч при комнатной температуре, суспензию фильтруют, промывают 10%-ным раствором NaСl, водой и сушат. PRI me R 6. To 1 g of the activated according to example 4 media add 5 ml of a 1.5% solution of chitosan N-sulfosuccinate (mol.m. -250 kD, sulfur 9.0%) in 0.5% solution of NaOH, stirred for 18 h at room temperature, the suspension is filtered, washed with 10% NaCl solution, water and dried.

Весовое соотношение матрица:лиганд (г/г) = 1:0,0215. The weight ratio of matrix: ligand (g / g) = 1: 0.0215.

П р и м е р 7. К 1 г активированного по примеру 2 носителя добавляют 5 мл 2%-ного раствора N-сульфосукцината хитозана (мол.м.-70 кД, сера 7,0%) в 0,2 М ацетатном буфере, рН 4,5, вносят 6 мг N-этил-N-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, перемешивают при 4^oC в течение 24 ч, суспензию фильтруют, промывают 10%-ным раствором NaCl, водой и сушат.PRI me R 7. To 1 g of the activated according to example 2 media add 5 ml of a 2% solution of chitosan N-sulfosuccinate (mol. -70 kD, sulfur 7.0%) in 0.2 M acetate buffer , pH 4.5, add 6 mg of N-ethyl-N- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, stir at 4 ^° C for 24 hours, filter the suspension, wash with 10% NaCl, water and dry.

Весовое соотношение матрица:лиганд (г/г) = 1:0,018. The weight ratio of matrix: ligand (g / g) = 1: 0.018.

П р и м е р 8. К 1 г активированного по примеру 2 носителя добавляют 5 мл 4%-ного раствора N-сульфосукцината хитозана (мол.м.-5,0 кД, сера 6,0%) в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4, перемешивают в течение 6 ч при комнатной температуре, реакционную смесь фильтруют, промывают водой, затем суспендируют в 1%-ном растворе боргидрида натрия в течение 30 мин, суспензию промывают 10%-ным раствором NaCl, водой и сушат. PRI me R 8. To 1 g of the activated according to example 2 media add 5 ml of a 4% solution of chitosan N-sulfosuccinate (mol.m.-5.0 kD, sulfur 6.0%) in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4, stirred for 6 hours at room temperature, the reaction mixture was filtered, washed with water, then suspended in a 1% sodium borohydride solution for 30 minutes, the suspension was washed with 10% NaCl solution, water and are dried.

Весовое соотношение матрица:лиганд (г/г) = 1:0,015. Weight ratio matrix: ligand (g / g) = 1: 0.015.

П р и м е р 9. Аналогично примерам 2-8, но отличающийся тем, что в качестве матрицы (носителя) используют силохром и силикагель (табл.1). PRI me R 9. Similarly to examples 2-8, but characterized in that as a matrix (carrier) use silochrome and silica gel (table 1).

П р и м е р 10. Определение сорбционной емкости адсорбентов. PRI me R 10. Determination of the sorption capacity of adsorbents.

Кровь пропускают через колонку объемом 1 см³ с адсорбентом приготовленным по примеру 7, по замкнутому контуру со скоростью 1 мл/мин в течение 45 мин, при соотношении кровь:адсорбент 6:1 по объему. В плазме крови, содержащей 300 мг/дл общего холестерина, а также содержание ЛНП и ЛОНП методом ракетного электрофореза. В табл.2 даны сорбционные характеристики адсорбентов, приготовленных согласно вышеприведенным примерам.Blood is passed through a 1 cm ³ column with an adsorbent prepared according to Example 7, in a closed loop at a speed of 1 ml / min for 45 minutes, with a blood: adsorbent ratio of 6: 1 by volume. In a blood plasma containing 300 mg / dl of total cholesterol, as well as the content of LDL and VLDL by rocket electrophoresis. Table 2 gives the sorption characteristics of the adsorbents prepared according to the above examples.

При молекулярной массе аффинного лиганда меньше 5 кД специфичность адсорбентов по извлекаемому компоненту резко ухудшается, а при увеличении молекулярной массы больше 300 кД наблюдается уменьшение количества иммобилизованного лиганда на матрице менее 3 мг на 1 г сорбента и, следовательно, снижение емкости адсорбентов по ЛНП. С другой стороны, увеличение количества иммобилизованного лиганда больше 25 мг практически не влияет на емкость сорбента. When the molecular weight of the affinity ligand is less than 5 kD, the specificity of the adsorbents for the extracted component deteriorates sharply, and with an increase in the molecular weight of more than 300 kD, a decrease in the amount of immobilized ligand on the matrix is less than 3 mg per 1 g of sorbent and, consequently, a decrease in the capacity of adsorbents for LDL. On the other hand, an increase in the amount of immobilized ligand of more than 25 mg practically does not affect the capacity of the sorbent.

Снижение емкости сорбентов также наблюдается при использовании лиганда с содержанием серы менее 3 мас.% (Теоретически максимальное количество серы в N-сульфосукцинате хитозана равно 10 мас.%). A decrease in the sorbent capacity is also observed when using a ligand with a sulfur content of less than 3 wt.% (Theoretically, the maximum amount of sulfur in chitosan N-sulfosuccinate is 10 wt.%).

П р и м е р 10. Определение гемосовместимости. Донорскую кровь (10 мл) пропускают через колонку, содержащую 1 см³ адсорбента со скоростью 5 мл/мин в течение 30 мин. До и после сорбции определяют количество тромбоцитов и концентрацию свободного гемоглобина в плазме (табл.3).PRI me R 10. Determination of hemocompatibility. Donor blood (10 ml) is passed through a column containing 1 cm ^{3 of} adsorbent at a rate of 5 ml / min for 30 minutes. Before and after sorption, the platelet count and plasma concentration of free hemoglobin are determined (Table 3).

Как видно из табл.3, перфузия крови через колонку с адсорбентом приводит к адгезии тромбоцитов на их поверхности (10-12%) не превышающей показатели, характерные для активированных углей (40% и больше), широко применяющихся в гемосорбции. As can be seen from Table 3, blood perfusion through a column with an adsorbent leads to platelet adhesion on their surface (10-12%) not exceeding that characteristic for activated carbons (40% or more), which are widely used in hemosorption.

Таким образом, предлагаемые сорбенты обладают повышенной селективной емкостью по отношению к атерогенным липопротеинам и гемосовместимостью при сорбции из протекающей крови, при этом по стоимости предлагаемые значительно экономичнее известных (например, гепарин-сефарозы). Thus, the proposed sorbents have an increased selective capacity with respect to atherogenic lipoproteins and hemocompatibility during sorption from flowing blood, while the proposed ones are much more economical than the known ones (for example, heparin-sepharose).

Claims

Adsorbent for the extraction of atherogenic lipoproteins from biological fluids, including a myand-modified matrix, characterized in that it contains chitosan N-sulfosuccinate with the structural formula as a ligand

and pier. m. 5 - 300 kDa, sulfur content of 3 - 9 wt.% with a mass ratio of matrix: ligand 1: 0.003 - 0.025.