RU2027192C1

RU2027192C1 - Method of freeing blood from rheumatoid factor

Info

Publication number: RU2027192C1
Authority: RU
Inventors: Илья Петрович Гонтарь; Борис Валерьевич Заводовский; Сергей Анатольевич Липницкий; Александр Борисович Зборовский
Original assignee: Илья Петрович Гонтарь; Борис Валерьевич Заводовский; Сергей Анатольевич Липницкий; Александр Борисович Зборовский
Priority date: 1991-09-03
Filing date: 1991-09-03
Publication date: 1995-01-20

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: this method prescribes passing patient's blood through immunosorbent, that is, polyacrylamide granules possessing magnetic properties and gel immobilized into three-dimensional lattice by method of emulsion polymerization using native human 1g G. EFFECT: this sorbent allows stepping up effectiveness of disclosed 2.5 times as compared with prior art (sefarose CL-4B activated by cyanogen bromide and characterized by fixed covalent bond provided by native human 1g G and reducing expenses by using easily available and less costly ingredients, higher specificity, effectiveness, broader range of indications for immunosorption, more accurate prognostication, lower rate of disability, and longer life of patients suffering from rheumatoid arthritis. 1 tbl

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к экстракорпоральным методам извлечения специфических антител из крови и может применяться в ревматологии и биотехнологии. The invention relates to medicine, namely to extracorporeal methods for the extraction of specific antibodies from the blood and can be used in rheumatology and biotechnology.

Известно, что ревматоидный фактор, представляющий собой антитела к Fc-фрагменту нормального IgG человека, непосредственно участвует в развитии иммунокомплексного васкулита при ревматоидном артрите. Проявления последнего часто выходят на ведущее место в клинической картине заболевания, определяют его тяжесть и неблагоприятный прогноз. It is known that the rheumatoid factor, which is an antibody to the Fc fragment of normal human IgG, is directly involved in the development of immunocomplex vasculitis in rheumatoid arthritis. Manifestations of the latter often go to the leading place in the clinical picture of the disease, determine its severity and poor prognosis.

Известен способ удаления указанных антител методом этапного плазмафереза, при котором проводится удаление плазмы больного в экстракорпоральном контуре малыми порциями по 300 мл с последующей инфузией пациенту изотонических солевых растворов и изоонкотических донорских белковых препаратов. Недостатком указанного способа является его низкая избирательность. При проведении процедуры вместе с ревматоидными факторами удаляются альбумин, гормоны, транспортные белки, нормальные иммуноглобулины, лекарственные препараты и т.д. В то же время проводимая в ходе плазмафереза инфузионная терапия не обеспечивает адекватного плазмозамещения. Используемые с этой целью в больших количествах (до 60% от общего объема) белковые препараты (альбумин, протеин, плазма) являются чужеродными для организма больного и вызывают его дополнительную сенсибилизацию. Кроме того, их высокая цена повышает стоимость метода и препятствует его широкому использованию. A known method of removing these antibodies by the method of staged plasmapheresis, in which the patient’s plasma is removed in an extracorporeal circuit in small portions of 300 ml, followed by infusion of isotonic saline solutions and isooncotic donor protein preparations to the patient. The disadvantage of this method is its low selectivity. During the procedure, along with rheumatoid factors, albumin, hormones, transport proteins, normal immunoglobulins, drugs, etc. are removed. At the same time, infusion therapy carried out during plasmapheresis does not provide adequate plasma substitution. Protein preparations (albumin, protein, plasma) used in large quantities (up to 60% of the total volume) are foreign to the patient’s body and cause its additional sensitization. In addition, their high price increases the cost of the method and prevents its widespread use.

Наиболее близким к предложенному по принципу действия и достигаемому результату является способ удаления ревматоидных факторов из крови путем пропускания ее через иммуносорбент, представляющий собой нерастворимый инертный носитель (агарозный гель в форме сефарозы CL-2В или сефарозы CL-4В), к которому после активации бромцианом ковалентно пришивается нативный или химически модифицированный иммуноглобулин G человека. Closest to the proposed principle of action and the achieved result is a method of removing rheumatoid factors from the blood by passing it through an immunosorbent, which is an insoluble inert carrier (agarose gel in the form of sepharose CL-2B or sepharose CL-4B), to which it is covalently covalently activated sewn native or chemically modified human immunoglobulin G.

Указанный способ имеет ряд недостатков. Сефароза имеет крайне высокую стоимость и поэтому не может найти широкого применения для приготовления иммуносорбентов в клинической практике. Бромциан, используемый для активации данного носителя, является высокотоксичным соединением, работа с ним представляет опасность для исследователя. При приготовлении сефарозы из агарозы существенная часть активных групп носителя, к которым впоследствии присоединяется иммуноглобулин G, блокируется поперечной сшивкой геля. В процессе образования ковалентных связей между матрицей и лигандом происходит частичное блокирование активных центров молекулы антигена. The specified method has several disadvantages. Sepharose has an extremely high cost and therefore cannot find wide application for the preparation of immunosorbents in clinical practice. Bromocyan used to activate this carrier is a highly toxic compound, work with it is a danger to the researcher. In the preparation of sepharose from agarose, a substantial part of the active groups of the carrier, to which subsequently immunoglobulin G is attached, is blocked by cross-linking the gel. In the process of the formation of covalent bonds between the matrix and the ligand, the active centers of the antigen molecule are partially blocked.

Вследствие указанных причин плотность антигенных детерминант на поверхности иммуносорбента, используемого в прототипе, оказывается недостаточной, что приводит к недостаточной эффективности удаления ревматоидных факторов из крови. Due to these reasons, the density of antigenic determinants on the surface of the immunosorbent used in the prototype is insufficient, which leads to insufficient efficiency of the removal of rheumatoid factors from the blood.

Цель изобретения - повышение степени очистки крови от ревматоидного фактора. The purpose of the invention is to increase the degree of purification of blood from rheumatoid factor.

Поставленная цель достигается путем пропускания крови через иммуносорбент с иммобилизованным нативным IgG человека, причем в качестве иммуносорбента используют железосодержащие полиакриламидные гранулы с иммобилизованным в трехмерную решетку геля методом эмульсионной полимеризации нативным IgG человека. The goal is achieved by passing blood through an immunosorbent with immobilized native human IgG, and iron-containing polyacrylamide granules immobilized with native human IgG immobilized into a three-dimensional gel lattice using immunosorbent as the immunosorbent.

П р и м е р 1. Получение полиакриламидных гранул с магнитными свойствами с иммобилизованным нативным иммуноглобулином G человека. PRI me R 1. Obtaining polyacrylamide granules with magnetic properties with immobilized native human immunoglobulin G.

В 2 мл 0,15 М раствора натрия хлорида растворяли соответственно 100 мг и 300 мг метиленбисакриламида и акриламида (Реанал, Венгрия), а также 40 мг нативного иммуноглобулина G человека, полученного по известной методике из плазмы крови человека. Выбор концентрации антигена 20 мг/мл (В 2 мл - 40 мг) обусловлен тем, что в прототипе именно эта концентрация белка дала возможность получить иммуносорбент, удаляющий антитела с максимальной эффективностью. In 2 ml of a 0.15 M sodium chloride solution, 100 mg and 300 mg of methylenebisacrylamide and acrylamide (Reanal, Hungary), as well as 40 mg of native human immunoglobulin G, obtained by known methods from human blood plasma, were dissolved. The choice of antigen concentration of 20 mg / ml (2 ml - 40 mg) is due to the fact that in the prototype it was this concentration of protein that made it possible to obtain an immunosorbent that removes antibodies with maximum efficiency.

В сосуд, содержащий 100 мл гексана и 0,5 мл эмульгатора СПЭН-85, подавали под давлением 0,2-1 атм газообразный азот по трубке сечением 0,8 мм таким образом, чтобы создавать интенсивное перемешивание в течение 5 мин. В колбу для полимеризации вносили 1 мл физиологического раствора с 200 мг окиси железа с гирофильными свойствами и 10 мг персульфата аммония, через 1-2 мин добавляли 2 мл раствора, содержащего мономеры акриламида, метиленбисакриламида, IgG человека и 20 мкл NNN'N' -тетраметилэтилендиамина (ТЭМЭД). At a pressure of 0.2-1 atm, nitrogen gas was introduced into a vessel containing 100 ml of hexane and 0.5 ml of SPEN-85 emulsifier through a tube with a cross section of 0.8 mm so as to create vigorous stirring for 5 minutes. 1 ml of physiological saline with 200 mg of iron oxide with gyrophilic properties and 10 mg of ammonium persulfate was added to the polymerization flask; after 1-2 minutes, 2 ml of a solution containing acrylamide, methylene bisacrylamide, human IgG monomers and 20 μl of NNN'N'-tetramethylethylenediamine were added (TEMED).

После завершения полимеризации гранулы в течение 10-15 мин отмывали ацетоном и физиологическим раствором с детергентом Твин-20 (0,05%) от непрореагировавших мономеров, эмульгатора и гексана. Гранулы имели стандартную сферическую форму с размером частиц геля 10-100 мкм. Соотношение полимерный носитель - железо = 2:1 (в пересчете на сухую массу). After polymerization was completed, the granules were washed with acetone and physiological saline with Tween-20 detergent (0.05%) from unreacted monomers, emulsifier, and hexane for 10-15 min. The granules had a standard spherical shape with a particle size of the gel 10-100 microns. The ratio of the polymer carrier - iron = 2: 1 (in terms of dry weight).

П р и м е р 2. Сорбция ревматоидного фактора из плазмы крови больного ревматоидным артритом. PRI me R 2. Sorption of rheumatoid factor from the blood plasma of a patient with rheumatoid arthritis.

1 мл полученных полиакриламидных гранул инкубировали 1 ч при 37^оС на магнитной мешалке с 2 мл плазмы больного ревматоидным артритом, титр ревматоидного фактора в которой составлял 1:2560 в реакции Ваалера-Роузе или 1: 10240 в реакции латекс-агглютинации. Впоследствии гранулы отделялись от плазмы и отмывались 0,1 М фосфатным буфером рН 7,4 до нулевых значений экстинции на спектрофотометре (длина волны 280 нм).1 ml of the obtained polyacrylamide beads were incubated 1 hr at ³⁷ ° C on a magnetic stirrer with 2 ml of plasma of the patient with rheumatoid arthritis, rheumatoid factor titre which was 1: 2560 in reaction Vaaler-Rouse, or 1: 10240 into a latex agglutination reaction. Subsequently, the granules were separated from the plasma and washed with 0.1 M phosphate buffer pH 7.4 to zero extinction values on a spectrophotometer (wavelength 280 nm).

Десорбция антител проводилась 0,1 М глицин-HCl буфером рН 2,5 два раза по 10 мин. Элюат нейтрализовали 1 М К₂НРО₄, концентрировали до объема 2 мл, диализовали против 5 л 0,1 М фосфатного буфера рН 7,4 в течение 18 ч при 4^оС. В истощенной сыворотке определялся титр ревматоидного фактора в реакции Ваалера-Роузе и методом латекс-агглютинации.Antibody desorption was carried out with 0.1 M glycine-HCl buffer pH 2.5 two times for 10 min. The eluate was neutralized with 1 M K ₂ HPO _4, concentrated to a volume of 2 ml, dialyzed against 5 liters of 0.1 M phosphate buffer pH 7.4 for 18 hours at 4 ° ^C. The depleted serum rheumatoid factor titre was determined in a reaction-Vaaler Rouse and latex agglutination method.

По описанной методике проведена сорбция 10 образцов плазмы больных ревматоидным артритом. В качестве контроля использовали 10 сывороток крови практически здоровых лиц. Полученные результаты и их сравнительная характеристика с прототипом приведены в таблице. According to the described method, sorption of 10 plasma samples of patients with rheumatoid arthritis was carried out. As a control, 10 blood sera of practically healthy individuals were used. The results obtained and their comparative characteristics with the prototype are shown in the table.

Из результатов видно, что предложенный сорбент истощает в 2,5 раза большее количество плазмы, чем прототип, при этом степень снижения титра антител остается прежней. The results show that the proposed sorbent depletes 2.5 times more plasma than the prototype, while the degree of decrease in antibody titer remains the same.

П р и м е р 3. Регенерация и повторное использование сорбента. PRI me R 3. Regeneration and reuse of the sorbent.

После сорбции гранулы регенерировались 0,1 М глицин-HCl буфером рН 2,5 или 3 М раствором роданида калия (КСNS). После первой регенерации потеря специфической активности составила 14%, при последующей регенерации (до 8 раз) потери активности не происходило. After sorption, the granules were regenerated with 0.1 M glycine-HCl buffer pH 2.5 or 3 M potassium rhodanide solution (KCNS). After the first regeneration, the loss of specific activity was 14%; during the subsequent regeneration (up to 8 times), there was no loss of activity.

П р и м е р 4. Контроль специфичности сорбента. PRI me R 4. Control of the specificity of the sorbent.

1 г Предложенного сорбента совмещали с 2 мл сыворотки крови донора, не содержащего ревматоидных факторов. С интервалом 15 мин в течение 1 ч в ней определяли концентрацию белка по Лоури, иммуноглобулинов классов G, A, M по методу Манчини. Достоверных отличий по сравнению с исходным уровнем отмечено не было. Полученные данные говорят о низкой специфичности емкости сорбента. 1 g of the proposed sorbent was combined with 2 ml of blood serum of a donor that does not contain rheumatoid factors. With an interval of 15 min for 1 h, the concentration of protein was determined according to Lowry and immunoglobulins of classes G, A, M according to the Mancini method. There were no significant differences compared with the initial level. The data obtained indicate a low specificity of the capacity of the sorbent.

Таким образом, предлагаемый сорбент позволяет достигнуть увеличения специфической активности по сравнению с прототипом в 2,5 раза. Он инертен, имеет низкую неспецифическую емкость, может регенерироваться и повторно использоваться без существенной потери сорбционных свойств. При изготовлении данного иммуносорбента используются более доступные и дешевые материалы по сравнению со сравниваемым образцом. Иммобилизация антигена методом эмульсионной полимеризации позволяет за один этап провести как синтез носителя, так и иммобилизацию на нем специфического лиганда. Включение магнитного материала позволяет поддерживать гранулы во взвешенном состоянии во внешнем магнитном поле, за счет чего уменьшается утечка сорбента за пределы колонки, повышается площадь соприкосновения его с кровью, уменьшается гемодинамическое сопротивление экстракорпорального контура. Предлагаемый иммуносорбент может использоваться для удаления специфических антител из биологических жидкостей. Его высокая специфичность и эффективность позволит расширить показания к проведению процедуры и улучшить эффект от нее, что будет способствовать улучшению прогноза, снижению инвалидности и увеличению средней продолжительности жизни при ревматоидном артрите. Применение метода позволит получить экономический эффект за счет уменьшения сроков госпитализации больных и возможности повторного использования гранул. Thus, the proposed sorbent allows to achieve an increase in specific activity compared to the prototype 2.5 times. It is inert, has a low non-specific capacity, can be regenerated and reused without significant loss of sorption properties. In the manufacture of this immunosorbent, more affordable and cheaper materials are used in comparison with the compared sample. Immobilization of the antigen by emulsion polymerization allows for one step to carry out both the synthesis of the carrier and the immobilization of a specific ligand on it. The inclusion of magnetic material allows you to maintain the granules in suspension in an external magnetic field, which reduces the leakage of the sorbent outside the column, increases the area of contact with blood, decreases the hemodynamic resistance of the extracorporeal circuit. The proposed immunosorbent can be used to remove specific antibodies from biological fluids. Its high specificity and effectiveness will expand the indications for the procedure and improve the effect of it, which will help to improve prognosis, reduce disability and increase life expectancy in rheumatoid arthritis. Application of the method will allow to obtain an economic effect by reducing the terms of hospitalization of patients and the possibility of reuse of granules.

Claims

METHOD FOR CLEANING BLOOD FROM RHEUMATOID FACTOR, including passing it through a sorbent, which is a polymeric carrier with immobilized native human immunoglobulin G, characterized in that iron-containing polyacrylamide granules obtained by emulsion polymerization with N-acrylamide, methylene bisacrylamide are used as sorbent, N ', N' - tetramethylethylenediamine, iron oxide powder and G-human immunoglobulin, the ratio of the polymer carrier: iron oxide in the sorbent with sets 2: 1, and the size of the granules is 10-100 microns.