RU2027190C1

RU2027190C1 - Conjugate of polysaccharide antigen with polyethyleneimine as an immunosorbent for detection of streptococcus and pneumococcus infections

Info

Publication number: RU2027190C1
Authority: RU
Inventors: В.Р. Губайдулин; Н.Л. Лукьянчикова; А.И. Аутеншлюс; Е.С. Михайлова; Л.Н. Падюков; Л.А. Левина
Original assignee: Губайдулин Виль Рашадович; Лукьянчикова Нина Леонидовна; Аутеншлюс Александр Исаевич; Михайлова Елена Семеновна; Падюков Леонид Николаевич; Левина Людмила Абрамовна
Priority date: 1990-08-22
Filing date: 1990-08-22
Publication date: 1995-01-20

Abstract

FIELD: immunology. SUBSTANCE: synthetic immunosorbent prepared by treatment of polysaccharide antigen with sodium periodate and polyethyleneimine ensures to detect pneumococcus and streptococcus infections. Molecular mass of immunosorbent is about 300 mln dalton, and it can be used in agglutination test for detection of pneumococcus and streptococcus infections. EFFECT: enhanced effectivenes of immunosorbent. 2 tbl

Description

Изобретение относится к иммунобиотехнологии, а именно к конъюгатам и иммуносорбентам. The invention relates to immunobiotechnology, namely to conjugates and immunosorbents.

Иммуносорбент может найти применение для диагностики инфекционно-воспалительных заболеваний. Immunosorbent can be used to diagnose infectious and inflammatory diseases.

Известна активированная матрица для иммобилизации белков (Зенюк А.А. и соавторы. Активированная матрица для иммобилизации белков, авт.св. СССР N 1280834, кл. G 01 N 33/50) формулы
П-O-CH₂-

-CH₂-NH-(CH₂)_n-

-O-N

где П - остаток агарозы, сефадекса или целлюлозы; n=2 или 3 для иммобилизации белков.Known activated matrix for immobilization of proteins (Zenyuk A.A. et al. Activated matrix for immobilization of proteins, ed. St. USSR N 1280834, class G 01 N 33/50) of the formula
P-O-CH ₂ -

-CH ₂ -NH- (CH ₂ ) _n -

-ON

where P is the remainder of agarose, Sephadex or cellulose; n = 2 or 3 for immobilization of proteins.

Используют полисахаридные матрицы, которые получают в три стадии. Polysaccharide matrices are used, which are obtained in three stages.

1. Активация полисахаридного носителя эпихлоргидрином. 1. Activation of the polysaccharide carrier by epichlorohydrin.

2. Раскрытие эпоксидного цикла аминокислотой. 2. Opening the epoxy cycle with an amino acid.

3. Этерификация N-оксисукцинимидом карбоксильной группы. 3. N-oxysuccinimide esterification of a carboxyl group.

На матрице иммобилизуют белки, содержащие первичную аминогруппу, например, транскортин, сексстероидсвязывающий глобулин, иммуноглобулины. Proteins containing a primary amino group are immobilized on the matrix, for example, transcortin, sexsteroid-binding globulin, immunoglobulins.

Однако матрица непригодна для иммобилизации полисахаридных антигенов, так как последний не может связываться с используемым связывающим элементом. However, the matrix is not suitable for immobilization of polysaccharide antigens, since the latter cannot bind to the binding element used.

Известен конъюгат, в котором активную группу белкового антигена связывают сульфонирующим или алкилирующим, или ацилирующим агентами (реагент агглютинации и способ его получения, заявка ЕПВ N 280561, кл. G 01 N 33/546). A conjugate is known in which the active group of a protein antigen is bound by sulfonating or alkylating or acylating agents (agglutination reagent and method for its preparation, EPO application N 280561, class G 01 N 33/546).

Однако связывающие агенты пригодны лишь для белковых антигенов, которые зачастую недостаточно специфичны и, следовательно, не позволяют выявить заболевание, что снижает точность диагностики. However, binding agents are suitable only for protein antigens, which are often not specific enough and, therefore, do not allow to identify the disease, which reduces the accuracy of diagnosis.

Известен также иммуносорбент [1], который выбран в качестве прототипа. Представляет собой конъюгат антиген-полисахарид-протеин. Полисахарид и протеин ковалентно связаны через
-CH₂-

-протеин. Низкие агглютинирующие свойства не позволяют использовать его в растворе. Малые адгезионные свойства допускают его использование только с активированными твердофазными носителями. В частности, конъюгат не может использоваться с неактивированными твердофазными носителями, например, из полистирола, поливинилхлорида, полисахарида.Also known immunosorbent [1], which is selected as a prototype. It is an antigen-polysaccharide-protein conjugate. The polysaccharide and protein are covalently linked through
-CH ₂ -

-protein. Low agglutinating properties do not allow its use in solution. Small adhesive properties allow its use only with activated solid-phase carriers. In particular, the conjugate cannot be used with inactive solid-phase carriers, for example, polystyrene, polyvinyl chloride, polysaccharide.

Решаемой задачей является создание конъюгата, обладающего хорошими агглютинирующими свойствами, что позволит использовать его в растворе, и достаточными адгезионными свойствами, что позволит использовать его с неактивированной твердой фазой. Это значительно расширяет область использования конъюгата. The problem to be solved is the creation of a conjugate with good agglutinating properties, which will allow it to be used in solution, and sufficient adhesive properties, which will allow it to be used with an inactive solid phase. This greatly expands the scope of use of the conjugate.

Техническим результатом является то, что альдегидную группировку полисахарида связывают полиэтиленимином. The technical result is that the aldehyde group of the polysaccharide is bound with polyethyleneimine.

Сущность изобретения состоит в том, что конъюгат имеет формулу

где n = 10³-10⁶
Из работ, описанных во вводной части описания, известно, что полисахарид используется в качестве антигена и активированного носителя. Использование полиэтиленимина в качестве связывающего звена не известно. Известно лишь использование его в качестве поликатиона для связывания сульфо-, карбокси- и других кислых групп (Haars A., Zonnez S. Hutterma A. Quantitative determination of lignosulfomates from sulfite spend liguors using presipitation with polyethyleneimine. Holzforsch 35(2); 59-65. 81).The essence of the invention lies in the fact that the conjugate has the formula

where n = 10 ³ -10 ⁶
From the works described in the introductory part of the description, it is known that the polysaccharide is used as an antigen and an activated carrier. The use of polyethyleneimine as a link is not known. It is only known to use it as a polycation to bind sulfo, carboxy, and other acidic groups (Haars A., Zonnez S. Hutterma A. Quantitative determination of lignosulfomates from sulfite spend liguors using presipitation with polyethyleneimine. Holzforsch 35 (2); 59- 65.81).

Следовательно, налицо изобретательский уровень. Therefore, there is an inventive step.

Конъюгат получают следующим образом. The conjugate is prepared as follows.

Полисахаридный антиген, например С-полисахарид пневмококка (СПСХ) или А-полисахарид стрептококка гр. А( АПСХ) обрабатывают периодатом натрия, затем добавляют раствор полиэтиленимина. Полная реакционная схема следующая:
1.(C₆H₁₀O₅)_n+ 2 NaIO₄__→(C₆H₆O₃(HO)₂)_n+I₂+4O₂+2Na⁺+2H⁺
2.(C₆H₆O₃(HO)₂)_n+ (C₄H₉N)_n(NH₂)

(C₁₀H₁₇O₃)_n+ 2H₂O
Продукт реакции соответствует формуле

где n = 10³-10⁶
П р и м е р. Дозировка ингредиентов приведена в расчете на 1 мг полисахарида. 1.1 мг СПСХ - антигена пневмококка растворяют в 0,1 мл 0,1 М бикарбонатного буфера рН 8. Добавляют 0,1 мл раствора периодата натрия (2 мг/мл). Инкубируют 1 ч в темноте. Затем добавляют каплю глицерина (для удаления свободного пеиродата натрия) и при энергичном встряхивании вливают 0,45 мл раствора полиэтиленимина, 2 мг/мл (мол.м. 30-40 кДа) на 0,1 М бикарбонатном буфере рН 8. Инкубируют 2 ч.Polysaccharide antigen, for example, pneumococcus C-polysaccharide (SPSC) or streptococcus A-polysaccharide gr. A (APSX) is treated with sodium periodate, then a solution of polyethyleneimine is added. The complete reaction scheme is as follows:
1. (C ₆ H ₁₀ O ₅ ) _n + 2 NaIO ₄ __ → (C ₆ H ₆ O ₃ (HO) ₂ ) _n + I ₂ + 4O ₂ + 2Na ⁺ + 2H ⁺
2. (C ₆ H ₆ O ₃ (HO) ₂ ) _n + (C ₄ H ₉ N) _n (NH ₂ )

(C ₁₀ H ₁₇ O ₃ ) _n + 2H ₂ O
The reaction product corresponds to the formula

where n = 10 ³ -10 ⁶
PRI me R. The dosage of the ingredients is based on 1 mg of polysaccharide. 1.1 mg SCLC - pneumococcal antigen is dissolved in 0.1 ml of 0.1 M bicarbonate buffer pH 8. Add 0.1 ml of sodium periodate solution (2 mg / ml). Incubated for 1 h in the dark. Then, a drop of glycerol is added (to remove free sodium peirodate) and, with vigorous shaking, 0.45 ml of a solution of polyethyleneimine, 2 mg / ml (mol.m. 30-40 kDa) are poured into 0.1 M bicarbonate buffer pH 8. Incubated for 2 hours .

2. 1 мг группоспецифического полисахарида стрептококка группы А-антигена стрептококка растворяют в 0,1 мл 0,1 М бикарбонатного буфера рН 8. Добавляют 0,1 мл раствора периодата натрия (2 мг/мл) на бикарбонатном буфере и выдерживают 1 ч в темноте. Для удаления свободного периодата натрия вливают каплю глицерина. Затем добавляют 0,45 мл раствора полиэтиленимина (2 мг/мл) и инкубируют в темноте 2 ч. 2. 1 mg of the group-specific streptococcus streptococcus polysaccharide of group A streptococcus antigen is dissolved in 0.1 ml of 0.1 M bicarbonate buffer pH 8. Add 0.1 ml of sodium periodate solution (2 mg / ml) in bicarbonate buffer and incubated for 1 h in the dark . To remove the free sodium periodate, a drop of glycerol is poured. Then, 0.45 ml of a solution of polyethyleneimine (2 mg / ml) was added and incubated in the dark for 2 hours.

Приготовленные таким образом конъюгаты доводят фосфатным буфером до 40 мл и заливают в лунки планшета для иммуноферментного анализа по 100 мкл в каждую. Выдерживают 12 ч при 4^оС, отмывают дистиллированной водой 4 раза и высушивают при 37^оС. После этого материал готов для проведения иммуноферментного анализа.Conjugates prepared in this way were brought up to 40 ml with phosphate buffer and poured into 100 μl of each plate for enzyme-linked immunosorbent assay. Kept 12 h at ⁴ ° C, washed with distilled water 4 times and dried at 37 ° ^C. The material was then ready for immunoassay.

Поскольку полисахаридный антиген является специфичным для острых инфекционно-воспалительных заболеваний, иммуносорбент пригоден для диагностики этого класса болезней. При этом сорбент с СПСХ - антигеном пневмококка пригоден для диагностики заболеваний, вызванных пневмококком (например острых пневмоний), с АПСХ - антигеном стрептококка группы А - для диагностики заболеваний, вызванных стрептококком группы А (ревматизм, тонзиллит, гломерулонефрит)), с Re- гликолипидом А-антигеном грамотрицательных микроорганизмов - для диагностики заболеваний, вызванных грамотрицательными микроорганизмами - энтеробактериями (пиелонефрит, энтерит, аднексит и т.п.). Для диагностических целей в лунки планшета с конъюгатом вносят по 100 мл 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина на фосфатном буфере, инкубируют 1 ч при 37^оС, после чего удаляют содержимое из лунок и вносят в них по 100 мкл испытуемой сыворотки в разведениях от 1:5 до 1:640. Инкубируют 1 ч при 37^оС, отмывают 4 раза, добавляют в лунки по 100 мкл антител к иммуноглобулинам человека, конъюгированных с пероксидазой хрена в разведении 1:200, выдерживают 1 ч при 37^оС, отмывают 5 раз, вносят по 100 мкл субстрата - ортофенилендиамина (1 мг/мл), рН 4,7, содержащего 0,05% перекись водорода. Выдерживают в темноте 40 мин. Оптическую плотность измеряют при λ =492 нм. В качестве примера приводятся результаты исследования с иммуносорбентом СПСХ пяти больных.Since the polysaccharide antigen is specific for acute infectious and inflammatory diseases, the immunosorbent is suitable for the diagnosis of this class of diseases. At the same time, the sorbent with SCSX - pneumococcal antigen is suitable for diagnosing diseases caused by pneumococcus (for example, acute pneumonia), with APSX - group A streptococcus antigen for diagnosing diseases caused by group A streptococcus (rheumatism, tonsillitis, glomerulonephritis)), with Re-glycolipid A-antigen of gram-negative microorganisms - for the diagnosis of diseases caused by gram-negative microorganisms - enterobacteria (pyelonephritis, enteritis, adnexitis, etc.). For diagnostic purposes in the wells with the conjugate made by 100 ml of 0.5% solution of bovine serum albumin in phosphate buffered saline, incubated for 1 h at ³⁷ ° C after which the contents were removed from the wells, and introduced into them at 100 ul test serum dilutions of 1: 5 to 1: 640. Incubate 1 hour at ³⁷ ° C, washed 4 times, is added to the wells at 100 l antibodies to human immunoglobulins conjugated to horseradish peroxidase at 1: 200 dilution, incubated 1 h at ³⁷ ° C, washed 5 times Pipette 100 ul of substrate - orthophenylenediamine (1 mg / ml), pH 4.7, containing 0.05% hydrogen peroxide. Stand in the dark for 40 minutes. The optical density is measured at λ = 492 nm. As an example, the results of a study with the immunosorbent SPSX of five patients are given.

1. Больной С-д, острая пневмония. Из мокроты высеян пневмококк. Титр антител к СПСХ, выявленный с использованием разработанного конъюгата в качестве иммуносорбента, 1:320. 1. Patient Cd, acute pneumonia. Pneumococcus is sown from sputum. The titer of antibodies to SCLC, identified using the developed conjugate as an immunosorbent, 1: 320.

2. Больной Ю-с, острая пневмония, бронхиальная астма. Из мокроты высеян пневмококк. Титр антител к конъюгату с СПСХ, выявленный с использованием предложенного иммуносорбента, 1:640. 2. Patient Yu-s, acute pneumonia, bronchial asthma. Pneumococcus is sown from sputum. The titer of antibodies to conjugate with SCLC, identified using the proposed immunosorbent, 1: 640.

3. Больная С-а, туберкулез легких. Титр антител 1:40. 3. Patient S. a, pulmonary tuberculosis. The titer of antibodies is 1:40.

4. Больной Н-о, саркоидоз. Титр антител 1:10. 4. Patient N., sarcoidosis. The titer of antibodies is 1:10.

5. Больной Г-о, хронический бронхит, высеян из мокроты стафилококк. Титр антител к конъюгату с СПСХ, выявленный с использованием разработанного иммуносорбента, 1:20. 5. Patient Mr., chronic bronchitis, sown from sputum staphylococcus aureus. The titer of antibodies to conjugate with SCLC, detected using the developed immunosorbent, 1:20.

Эти примеры показывают, что высокие титры антител наблюдаются у больных в острой фазе заболевания, вызванного пневмококком. These examples show that high titers of antibodies are observed in patients in the acute phase of the disease caused by pneumococcus.

В случае использования сорбента в растворе к 50 мкл суспензии гранул сорбента с носителем добавляют 50 мкл исследуемой сыворотки, разведенной физиологическим раствором от 1:1 до 1:1024, инкубируют не менее 15 мин, реакцию учитывают по образованию цветного осадка. In the case of using the sorbent in solution, 50 μl of the studied serum diluted with physiological saline from 1: 1 to 1: 1024 are added to 50 μl of a suspension of granules of the sorbent with a carrier, incubated for at least 15 minutes, the reaction is taken into account by the formation of a color precipitate.

В качестве примера работоспособности конъюгата приводятся результаты исследований, при которых определяли титр антител известным способом (стандарт) и с использованием предложенного иммуносорбента у пациентов со стрептококковой инфекцией. Результаты приведены в табл. 1. As an example of the health of the conjugate, the results of studies are given in which the antibody titer was determined in a known manner (standard) and using the proposed immunosorbent in patients with streptococcal infection. The results are shown in table. 1.

Из табл. 1 видно, что при использовании стандарта невозможно установить степень достоверности при различной активности процесса, так как данные, полученные с его помощью, не соответствуют состоянию процесса. При использовании предложенного иммуносорбента отмечено высокодостоверное различие по группам больных. From the table. Figure 1 shows that when using the standard it is impossible to establish the degree of reliability for various activity of the process, since the data obtained with its help do not correspond to the state of the process. When using the proposed immunosorbent, a highly significant difference in the groups of patients was noted.

Параллельно проводились исследования титра антител по предложенному изобретению и прототипу. Исследованы сыворотки больных, приведенных в описанных выше примерах. Результаты приведены в табл. 2. In parallel, studies were conducted titer of antibodies according to the proposed invention and the prototype. The sera of patients described in the examples described above were studied. The results are shown in table. 2.

Анализ данных табл. 2 показывает, что сорбент-прототип не пригоден в силу малой молекулярной массы для работы, так как не обладает агглютинирующими свойствами. Предложенный конъюгат можно использовать в качестве иммуносорбента в реакции агглютинации. Data analysis table. 2 shows that the sorbent prototype is not suitable due to the low molecular weight for work, as it does not have agglutinating properties. The proposed conjugate can be used as an immunosorbent in the agglutination reaction.

Claims

CONJUGATE OF POLYSACCHARIDE ANTIGEN WITH POLYETHYLENEIMINE AS AN IMMUNOSORBENT FOR IDENTIFICATION OF STREPTOCOCK AND PNEUMOCOCCIAL INFECTIONS.

Polysaccharide antigen conjugate with polyethyleneimine of general formula

where n = 10 ³ - 10 ⁶ ,
as an immunosorbent for the detection of streptococcal and pneumococcal infections.