Изобретение относится к медицине и может быть использовано для доставки противоопухолевых лекарств в раковую клетку. The invention relates to medicine and can be used to deliver cancer drugs to a cancer cell.
Известно, что одной из важных функций альфа-фетопротеина в эмбрионе млекопитающих является транспорт жирных кислот; при этом полиненасыщенные жирные кислоты, в том числе арахидоновая, обладают наибольшей аффинностью к альфа-фетопротеину. Кроме этого, обнаружено, что альфа-фетопротеин способ селективно проникать в опухолевые клетки по механизму рецепторного эндоцитоза. На основе этого свойства, а также способности альфа-фетопротеина транспортировать полиненасыщенные жирные кислоты, доктором Дейчем из Мадисоновского университета (США) разработан способ противоопухолевой химиотерапии некоторых видов злокачественных новообразований человека. В качестве транспортного белка в этом способе использовался альфа-фетопротеин, секретируемый клетками первичного рака печени. На этом фоне больному вводили конъюгат арахидоновая кислота - доксорубицин. Полный курс состоял из 10 внутривенных введений конъюгата. При попадании в опухолевую клетку доксорубицин в составе конъюгата с арахидоновой кислотой активировался НАДФН (НАДН)-зависимыми оксидоредуктазами с образованием высокореакционноспособных продуктов, выступающих прямыми алкиляторами и/или инициаторами реакций перекисного окисления липидов. Эти процессы обусловливали цитостатический эффект. It is known that one of the important functions of alpha-fetoprotein in the mammalian embryo is the transport of fatty acids; while polyunsaturated fatty acids, including arachidonic, have the highest affinity for alpha-fetoprotein. In addition, it was found that alpha-fetoprotein is a way to selectively penetrate into tumor cells by the mechanism of receptor endocytosis. Based on this property, as well as the ability of alpha-fetoprotein to transport polyunsaturated fatty acids, a method for antitumor chemotherapy of certain types of human malignant tumors was developed by Dr. Deutsch from Madison University (USA). Alpha-fetoprotein secreted by primary liver cancer cells was used as a transport protein in this method. Against this background, the patient was administered the conjugate arachidonic acid - doxorubicin. The full course consisted of 10 intravenous conjugate administrations. When doxorubicin in the conjugate with arachidonic acid enters the tumor cell, it is activated by NADPH (NADH) -dependent oxidoreductases with the formation of highly reactive products acting as direct alkylators and / or initiators of lipid peroxidation reactions. These processes caused a cytostatic effect.
Цель изобретения - создание универсального способа доставки противоопухолевых лекарств в раковую клетку. The purpose of the invention is the creation of a universal method for the delivery of antitumor drugs to a cancer cell.
Поставленная цель достигается тем, что в качестве фетального биологического материала человека используют сыворотку из пуповинной крови человека. Подвергают ее фильтрации, центрифугированию и стерилизации. Проводят химическую конъюгацию противоопухолевого лекарства - доксорубицина, с арахидоновой кислотой. Прединкубацию проводят путем смешивания обработанной сыворотки с содержанием альфа-фетопротеина до 8 мг с 20 мг конъюгата за 1-2 ч до внутривенного введения. Причем доксорубицин и арахидоновую кислоту конъюгируют в эквимолярном соотношении. А содержание альфа-фетопротеина определяют с помощью иммуноферментного анализа. This goal is achieved in that as a fetal biological material of a person using serum from human umbilical cord blood. Subject to its filtration, centrifugation and sterilization. Chemical conjugation of an antitumor drug, doxorubicin, with arachidonic acid is carried out. Pre-incubation is carried out by mixing the treated serum with an alpha-fetoprotein content of up to 8 mg with 20 mg of the conjugate 1-2 hours before intravenous administration. Moreover, doxorubicin and arachidonic acid are conjugated in an equimolar ratio. And the content of alpha-fetoprotein is determined using enzyme-linked immunosorbent assay.
П р и м е р. Пуповинную кровь с содержанием альфа-фетопротеина 50-100 мкг/мл собирали при родах с соблюдением требований антисептики. Собранную кровь тестировали на присутствие HBSAg и HIV. После этого кровь отстаивали при + 4оС в течение 8 ч, центрифугировали при 10000g в течение 15 мин, надосадочную жидкость, представляющую собой сыворотку, отбирали, фильтровали через тройной слой марли и стерилизовали через фильтры 0,22 и 0,17 мкм (концентратор Amicon, США). Полученную таким образом сыворотку помещали в стерильные герметичные флаконы и хранили при - 20оС вплоть до использования. Доксорубицин и арахидоновую кислоту использовали в эквимолярном соотношении. Полученный конъюгат стерилизовали и хранили при - 20оС вплоть до использования. Непосредственно за 1-2 ч до внутривенного введения сыворотку и конъюгат смешивали. Для одной инъекции использовали объем сыворотки, эквивалентный 8 мг альфа-фетопротеина, и 20 мг конъюгата. Содержание альфа-фетопротеина в сыворотке определяли методом иммуноферментного анализа (IFA) с использованием наборов фирмы "АС". Общий курс состоял обычно из 6 инъекций (3 раза через день с интервалом в одну неделю).PRI me R. Cord blood with a content of alpha-fetoprotein of 50-100 μg / ml was collected at birth in compliance with antiseptic requirements. Collected blood was tested for the presence of HBSAg and HIV. Thereafter, the blood to stand at + 4 ° C for 8 hours, centrifuged at 10000g for 15 min, the supernatant representing the serum was collected, filtered through a triple layer of gauze and sterilized through filters of 0.22 .mu.m and 0.17 (hub Amicon, USA). The thus obtained serum was placed in a sealed sterile vials and stored at - 20 C until use. Doxorubicin and arachidonic acid were used in an equimolar ratio. The resulting conjugate was sterilized and stored at - 20 C until use. Immediately 1-2 hours before the intravenous administration, the serum and conjugate were mixed. For one injection, a serum volume equivalent to 8 mg of alpha-fetoprotein and 20 mg of conjugate were used. Serum alpha-fetoprotein was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (IFA) using kits from the company "AS". The general course usually consisted of 6 injections (3 times every other day with an interval of one week).
Предлагаемый способ предусматривает использование при химиотерапии интактного альфа-фетопротеина из фетального источника. Этот белок имеет по крайней мере в 8 раз больше мест связывания для арахидоновой кислоты, чем альфа-фетопротеин, секретируемый опухолевыми клетками. Кроме того, в отличие от описанного способа пациенту внутривенно вводят примерно в 10 раз больше транспортного белка по сравнению с тем, что присутствует в крови больного первичным раком печени (< 200 нг/мл). Благодаря использованию экзогенного альфа-фетопротеина химиотерапевтическое воздействие строго контролируется по количеству вводимого альфа-фетопротеина. Возможность предварительного смешивания сыворотки и конъюгата позволяет получить более высокие стационарные концентрации тройного комплекса альфа-фетопротеин-арахидоновая кислота-доксорубицин. Общая токсичность конъюгата арахидоновая кислота-доксорубицин значительно снижена по сравнению с самим препаратом доксорубицина. Использование альфа-фетопротеина в качестве транспортного белка позволяет существенно пролонгировать действие доксорубицина из-за снижения скорости его выведения из организма больного. Универсальность предложенного метода позволяет использовать его при лечении практически всех видов злокачественных новообразований человека и применять другие противоопухолевые лекарства. The proposed method involves the use in chemotherapy of intact alpha-fetoprotein from a fetal source. This protein has at least 8 times more binding sites for arachidonic acid than alpha-fetoprotein secreted by tumor cells. In addition, in contrast to the described method, the patient is injected intravenously with about 10 times more transport protein compared to what is present in the patient’s blood with primary liver cancer (<200 ng / ml). Thanks to the use of exogenous alpha-fetoprotein, the chemotherapeutic effect is strictly controlled by the amount of alpha-fetoprotein administered. The possibility of preliminary mixing of serum and conjugate allows to obtain higher stationary concentrations of the triple complex alpha-fetoprotein-arachidonic acid-doxorubicin. The general toxicity of the arachidonic acid-doxorubicin conjugate is significantly reduced compared to the doxorubicin preparation itself. The use of alpha-fetoprotein as a transport protein can significantly prolong the action of doxorubicin due to a decrease in the rate of its excretion from the patient's body. The universality of the proposed method allows its use in the treatment of almost all types of human malignant neoplasms and the use of other antitumor drugs.