RU2026618C1

RU2026618C1 - Process for manufacture of vascular xenotransplant

Info

Publication number: RU2026618C1
Authority: RU
Inventors: Лев Валерьевич Лебедев; Алексей Валерьевич Гусинский; Алексей Дмитриевич Смирнов; Ольга Львовна Шарова; Людвига Вячеславовна Галебская; Герман Юрьевич Сокуренко; Алексей Юрьевич Савинов; Аркадий Григорьевич Виноградов; Николай Александрович Гордеев; Наталия Олеговна Дмитриевская
Original assignee: Лев Валерьевич Лебедев; Алексей Валерьевич Гусинский; Алексей Дмитриевич Смирнов; Ольга Львовна Шарова; Людвига Вячеславовна Галебская; Герман Юрьевич Сокуренко; Алексей Юрьевич Савинов; Аркадий Григорьевич Виноградов; Николай Александрович Гордеев; Наталия Олеговна Дмитриевская
Priority date: 1992-02-20
Filing date: 1992-02-20
Publication date: 1995-01-20

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: this process for manufacture of vascular xenotransplants from bird tracheobronchial tree segments prescribes treating these with enzymes and tanning agent, and then treating them by 2 to 10-percent NaCl solutions during 30 to 35 h first before and then after enzymatic treatment. Disclosed method further prescribes using terrilitin for enzymatic treatment during 4 to 6 h at temperature of 40 to 45 C, consuming 40 to 50 reduced units of enzyme per 1 g of dry tracheal matter, freeing prosthesis surfaces of muscular structures after second salt treatment, and then treating resultant product by 0.25 to 0.5-percent solution of glutaric aldehyde during 24 to 30 days at temperature of -4 to +10 C with daily replacing solution. EFFECT: greater resilience and biological stability of xenotransplant and lower antigenicity with preservation of natural strength. 1 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к способам изготовления протезов из сегментов трахеобронхиального дерева птиц, предназначенным для пластики артерий малого и среднего диаметра. The invention relates to medicine, namely to methods for the manufacture of prostheses from segments of the tracheobronchial tree of birds, intended for plastic arteries of small and medium diameter.

Известны различные способы изготовления сосудистых ксенотрансплантатов путем обработки их протеолитическими ферментами с последующей инактивацией ферментов, отмывки и дубления трансплантата. Однако известные способы не позволяют достигнуть сочетания эластичности, прочности и биологической стойкости по- лучаемых ксенотрансплантатов. There are various methods of manufacturing vascular xenografts by treating them with proteolytic enzymes followed by inactivation of the enzymes, washing and tanning of the graft. However, the known methods do not allow to achieve a combination of elasticity, strength and biological resistance of the obtained xenografts.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ изготовления ксенотрансплантатов, включающий обработку сегментов трахеобронхиального дерева птиц ферментами, гепарином и консервацию (дубление) в раствор (0,625%) глутарового альдегида. The closest in technical essence and the achieved effect is a method of manufacturing xenografts, including processing segments of the tracheobronchial tree of birds with enzymes, heparin and preservation (tanning) in a solution (0.625%) of glutaraldehyde.

Однако известный способ не позволяет изготовить протез, обладающий биомеханическими свойствами, близкими к артериям мышечного типа человека, а также добиться полного устранения иммуногенности протеза из-за остаточной антигенности тканей. Указанные недостатки приводят к неудовлетворительному морфогенезу трансплантата, и, как следствие, к возникновению тромбоза, гиперплазии неоинтимы, воспалению вокруг протеза и прекращению его функциональной деятельности. However, the known method does not allow the manufacture of a prosthesis having biomechanical properties similar to arteries of the muscular type of a person, and also to completely eliminate the immunogenicity of the prosthesis due to the residual antigenicity of the tissues. These shortcomings lead to unsatisfactory transplant morphogenesis, and, as a consequence, to the occurrence of thrombosis, neointima hyperplasia, inflammation around the prosthesis and termination of its functional activity.

В основу изобретения поставлена задача создать способ изготовления сосудистого ксенотрансплантата, обладающего повышенной эластичностью, биологической стойкостью и более низкой антигенностью при сохранении естественной армировки. The basis of the invention is the task to create a method of manufacturing a vascular xenograft with increased elasticity, biological resistance and lower antigenicity while maintaining natural reinforcement.

Поставленная задача решается тем, что в способе изготовления сосудистого ксенотрансплантата из сегментов трахеобронхиального дерева птиц, включающем обработку их ферментами и дубление, осуществляют солевые обработки 2-10%-ными растворами NaCl в течение 30-35 ч одну до, а вторую после ферментной обработки. При этом ферментную обработку проводят террилитином в течение 4-6 ч при 40-45^оС и при расходе фермента 40-50 ПЕ на 1 г сухого вещества трахеи, затем после второй солевой обработки очищают поверхность протеза от мышечных структур и обрабатывают 0,25-0,5%-ными растворами глутарового альдегида в течение 24-30 сут при температуре до 4-10^оС с еженедельной заменой раствора.The problem is solved in that in the method of manufacturing a vascular xenograft from segments of the tracheobronchial tree of birds, including treating them with enzymes and tanning, salt treatments are performed with 2-10% NaCl solutions for 30-35 hours, one before and the second after enzymatic treatment. Thus terrilitina enzymatic treatment is carried out for 4-6 hours at 40-45 ^{° C} and at a rate of 40-50 PE enzyme per 1 g dry matter of the trachea, and then after the second salt treatment was purified prosthesis surface from muscular structures and treated with 0.25 0.5% solution of glutaraldehyde for 24-30 days at a temperature of 4-10 ^{° C} with weekly replacement solution.

Двойная солевая обработка до и после ферментной позволяют максимально удалить из ксенопротезов высокоиммунный клеточный состав и нефибриллярные белки при сохранении низкоантигенного хрящевого матрикса, осуществляющего каркасную функцию. При концентрации NaCl 2-10% и проведении солевой обработки в течение 30-35 ч происходит максимальный выход биологических веществ. Установлено опытным путем, что уменьшение концентрации NaCl и снижение времени обработки не дает полного выхода биологических веществ (уменьшается выход белков и нуклеотидов из ксенопротеза), а увеличение указанных параметров нерентабельно, так как не увеличивает выхода биологических веществ (контроль за выходом биологических веществ в экстрагирующие растворы осуществлялся по методу Лоури и Калькара). Изменение режима и параметров ферментной обработки в сторону их уменьшения снижает выход биологических веществ, в сторону увеличения - нерентабельно, так как не сказывается на повышении выхода биологических веществ. Предлагаемая длительная обработка раствором глутарового альдегида с концентрацией 0,25-0,5% и при низкой температуре (4-10^оС) позволяет достигнуть максимально возможной биологической инертности ксенопротезов и их хирургической пригодности за счет получения более однородной по толщине структурной стаблизации тканей. Минимальная концентрация глутарового альдегида установлена опытным путем с учетом его бактерицидного действия для предотвращения разложения ксенотрахеи. Увеличение концентрации глутарового альдегида существенно не влияет на биомеханические и иммунологические характеристики ксенотрансплантата. Снижение температуры ведет к замерзанию раствора, а повышение нарушает равномерность стабилизации обрабатываемых тканей. Время обработки установлено опытным путем, уменьшение его не позволяет достигнуть равномерной и однородной структуры ксенотрансплантата, увеличение свыше 30 сут нерентабельно, так как за это время достигается полная стерильность и стабилизация ксенотрансплантата.The double salt treatment before and after the enzyme treatment allows one to maximally remove the high-immune cell composition and non-fibrillar proteins from xenoprostheses while maintaining a low antigenic cartilage matrix that performs a skeleton function. At a NaCl concentration of 2-10% and salt treatment for 30-35 hours, the maximum yield of biological substances occurs. It was established empirically that a decrease in the concentration of NaCl and a decrease in the processing time does not give a complete yield of biological substances (a decrease in the yield of proteins and nucleotides from a xenoprosthesis), and an increase in these parameters is unprofitable, since it does not increase the yield of biological substances (control over the release of biological substances into extracting solutions carried out according to the method of Lowry and Kalkar). Changing the mode and parameters of enzyme treatment in the direction of their decrease reduces the yield of biological substances, in the direction of increase - it is unprofitable, since it does not affect the increase in the yield of biological substances. Offered prolonged treatment glutaraldehyde solution with a concentration of 0.25-0.5%, and at low temperature (4-10 ^{° C)} makes it possible to achieve the maximum possible biological inertness and their surgical ksenoprotezov fitness by obtaining a more uniform thickness stablizatsii structural tissues. The minimum concentration of glutaraldehyde was established experimentally, taking into account its bactericidal action to prevent the decomposition of xenotrachea. An increase in the concentration of glutaraldehyde does not significantly affect the biomechanical and immunological characteristics of the xenograft. A decrease in temperature leads to freezing of the solution, and an increase violates the uniformity of stabilization of the treated tissues. The processing time was established experimentally, reducing it does not allow to achieve a uniform and homogeneous xenograft structure, an increase of more than 30 days is unprofitable, since during this time complete sterility and stabilization of the xenograft is achieved.

П р и м е р 1. Свежую трахею птицы механически очищают от окружающих тканей, промывают в проточной воде и проводят через раствор NaCl в возрастающих концентрациях от 2 до 10% в течение 30 ч, после чего обрабатывают раствором террилитина из расчета 40 ПЕ на 1 г сухого вещества в течение 4 ч при 40^оС. Затем проводят вторую солевую обработку NaCl в возрастающей концентрации от 2 до 10% в течение 30 ч. Механически очищают трансплантат от поверхностного мышечного слоя и помещают в раствор глутарового альдегида, постоянно увеличивая концентрацию от 0,25 до 0,5% (1 нед. - 0,25%; 2 нед. - 0,25%; 3 нед. - 0,5%; 4 нед. - 0,5%) при Т = -4^оС в течение 24 сут. Раствор заменяли каждые 5-6 сут., так как прекращалось поглощение глутарового альдегида. Получен ксенотрансплантат, обладающий прочностью и эластичностью, близкими к таковым у артерий мышечного типа человека, и с удовлетворительными антигенными свойствами. Данные характеристики полученных протезов сведены в таблицу.PRI me R 1. Fresh trachea birds mechanically cleaned from surrounding tissues, washed in running water and carried out through a solution of NaCl in increasing concentrations from 2 to 10% for 30 hours, and then treated with a solution of terrilithin at a rate of 40 PE per 1 g dry matter for 4 hours at 40 ^° C is then carried out a second processing of the salt NaCl at increasing concentrations of from 2 to 10% within 30 hours. Mechanically the graft was purified from superficial muscle layer and placed in a glutaraldehyde solution, constantly increasing concentration from 0 , 25 to 0.5% (1 not . d - 0.25% 2 weeks - 0.25%. 3 weeks - 0.5%;.. 4 weeks - 0.5%) at T = -4 ^C for 24 days. The solution was replaced every 5-6 days, since the absorption of glutaraldehyde ceased. A xenograft has been obtained that has strength and elasticity close to those of arteries of the muscular type of a person and with satisfactory antigenic properties. These characteristics of the prostheses are summarized in table.

П р и м е р 2. Осуществлен в условиях примера 1. Исключение составляет: трахея птицы свежезамороженная, продолжительность солевых обработок 33 ч, расход террилитина 45 ПЕ на 1 г сухого вещества, Т = 43^оС в течение 5 ч. Дубление глутаровым альдегидом проводилось при Т = 2^оС в течение 28 сут. Данные характеристик полученных протезов сведены в таблицу.EXAMPLE Example 2 carried out in the conditions of example 1. The exception is: trachea fresh frozen poultry, salt treatment duration 33 h, flow 45 terrilitina PE per 1 g of dry substance, T = 43 ^{° C} for 5 hr glutaraldehyde tanning. conducted at T = 2 ^{° C} for 28 days. These characteristics of the prostheses are summarized in table.

П р и м е р 3. Осуществлен в условиях примера 1. Исключение составляет: продолжительность солевых обработок 35 ч, расход террилитина 50 ПЕ на 1 г сухого вещества при Т = 45^оС в течение 6 ч. Дубление глутаровым альдегидом проводилось при Т 10^оС в течение 30 сут. Данные характеристик полученных протезов сведены в таблицу.PRI me R 3. Implemented under the conditions of example 1. The exception is: the duration of salt treatments 35 hours, the consumption of terrilithin 50 PE per 1 g of dry matter at T = 45 ^about C for 6 hours Tanning with glutaraldehyde was carried out at T 10 ^about C for 30 days. These characteristics of the prostheses are summarized in table.

П р и м е р 4. Осуществлен в условиях примера 1. Исключение составляет: трахея птицы свежезамороженная, продолжительность солевых обработок 28 ч расход террилитина 30 ПЕ на 1 г сухого вещества при Т = 35^оС в течение 3 ч. Дубление глутаровым альдегидом проводилось при Т 12^оС в течение 20 сут. Данные характеристик полученных протезов сведены в таблицу.EXAMPLE Example 4 carried out in the conditions of example 1. The exception is: trachea fresh frozen poultry, salt treatment duration 28 h flow terrilitina 30 PU per 1 g dry matter at T = 35 ^{° C} for 3 hr glutaraldehyde tanning was performed. at T = 12 ^C for 20 days. These characteristics of the prostheses are summarized in table.

П р и м е р 5. Осуществлен в условиях примера 1. Исключение составляет: продолжительность солевых обработок 37 ч, расход террилитина 80 ПЕ на 1 г сухого вещества при Т = 50^оС в течение 7 ч. Дубление глутаровым альдегидом проводилось при Т 12^оС в течение 35 сут. Данные характеристик полученных протезов сведены в таблицу.PRI me R 5. Implemented under the conditions of example 1. The exception is: the duration of salt treatments 37 hours, the consumption of terrilithin 80 PE per 1 g of dry matter at T = 50 ^about C for 7 hours, Tanning with glutaraldehyde was carried out at T 12 ^about C for 35 days. These characteristics of the prostheses are summarized in table.

Ксенопротезы, изготовленные по предлагаемому способу, представляют собой трубку, основу которой составляют кольца, утолщенные в средней части и истонченные по краям. Эти кольца своими краями заходят друг за друга и соединяются сетью коллагеновых волокон. Такое соединение делает их подвижными, а трубку прочной. Трансплантат полностью лишен клеточных элементов в отличие от протезов, изготовленных по способу-прототипу, в которых обнаружены значительные количества клеток как в веществе хряща, так и в надхрящнице, и в соединительной ткани. В результате предлагаемого способа получены протезы, состоящие из низкоиммунных компонентов, в сочетании с естественной архитектоникой волокнистых структур, что обеспечивает долговечность их функции в условиях гемодинамических нагрузок и развитие "функционального сосудистого слоя" из тканей реципиента. Xenoprostheses made by the proposed method are a tube, the basis of which are rings, thickened in the middle part and thinned around the edges. These rings go behind each other with their edges and are connected by a network of collagen fibers. Such a connection makes them movable and the tube durable. The graft is completely devoid of cellular elements, in contrast to the prostheses made according to the prototype method, in which significant amounts of cells are found both in the cartilage material, and in the perichondrium, and in the connective tissue. As a result of the proposed method, prostheses consisting of low-immune components were obtained in combination with the natural architectonics of fibrous structures, which ensures the durability of their function under hemodynamic loads and the development of a “functional vascular layer” from recipient tissues.

Образцы протезов подвергались морфологическому, биомеханическому, иммунологическому изучению. Результаты представлены в таблице. Samples of prostheses were subjected to morphological, biomechanical, immunological studies. The results are presented in the table.

Ксенопротез, обработанный по предлагаемому способу, значительно превосходит по эластичности как в продольном, так и в окружном направлениях трансплантаты, обработанные по способу-прототипу. Биомеханические свойства предлагаемого протеза близки к таковым у артерий мышечного типа человека. При этом естественная армировка и прочность сохраняется (в относительных величинах прочность даже возрастает). Увеличение концентрации фермента до 60 не приводит к уменьшению прочности стенки при сохранении эластичности. В то время как уменьшение концентрации фермента делает протез более ригидным при сохранении требуемой прочности. Высокая эластичность в сочетании с естественной армировкой позволяют протезу длительно функционировать при имплантации в артерии малого и среднего диаметра. The xenoprosthesis treated by the proposed method significantly exceeds the elasticity of both the longitudinal and circumferential directions transplants processed by the prototype method. The biomechanical properties of the proposed prosthesis are close to those of arteries of the muscular type of a person. At the same time, the natural reinforcement and strength are preserved (in relative values, the strength even increases). An increase in the concentration of the enzyme to 60 does not lead to a decrease in the strength of the wall while maintaining elasticity. While a decrease in the concentration of the enzyme makes the prosthesis more rigid while maintaining the required strength. High elasticity in combination with natural reinforcement allows the prosthesis to function for a long time when implanted in arteries of small and medium diameter.

Обработанные по предлагаемому способу и по способу-прототипу стандартизированные образцы ксенотрансплантатов имплантировались в подкожную клетчатку крыс vistar. В сыворотке крови, получаемой от крыс, определялся уровень антител к образцам методом стандартного твердофазного иммунофермнетного анализа. В период максимального титра антител превышение их концентрации в крови животных с имлпантированным протезом, обработанным по способу-прототипу, по сравнению с предложенным составляет 193%, тчо свидетельствует о более полноценной иммунной адаптации в процессе морфогенеза ксенотрансплантата, полученного по предлагаемому способу. Processed by the proposed method and the prototype method, standardized xenograft samples were implanted into the subcutaneous tissue of vistar rats. In the blood serum obtained from rats, the level of antibodies to the samples was determined by the method of standard solid-phase immunofermnet analysis. During the period of the maximum titer of antibodies, the excess of their concentration in the blood of animals with an implanted prosthesis processed by the prototype method compared to the proposed one is 193%, which indicates a more complete immune adaptation in the process of xenograft morphogenesis obtained by the proposed method.

Для изучения морфогенеза ксенотрансплантата, изготовленного по предлагаемому способу, в условиях низких гемодинамических показателей ксенопротез диаметром 3,0-3,5 мм и длиной 30-35 мм имплантировали в брюшную аорту кролика. Выполнено 42 операции на кроликах породы шиншилла. Срок наблюдения составил 1-150 сут, к концу которого все протезы оказались проходными. В течение 3 нед. после операции в осевшем на поверхности имплантата фибрине происходит процесс формирования неоинтимы. Снаружи протеза образуется тонкая соединительно-тканная оболочка. Из формирующейся неоадвентиции обнаруживается рост тонких прослоек соединительной ткани в направлении неоинтимы. Рубцового сращения протеза с окружающими тканями не обнаружено. Отсутствует поздняя макрофагальная инфильтрация. To study the morphogenesis of the xenograft manufactured by the proposed method, under conditions of low hemodynamic parameters, a xenoprosthesis with a diameter of 3.0-3.5 mm and a length of 30-35 mm was implanted in a rabbit abdominal aorta. 42 operations were performed on chinchilla rabbits. The follow-up period was 1-150 days, by the end of which all the prostheses were passable. Within 3 weeks after surgery, the formation of neointima occurs in the fibrin settled on the surface of the implant. Outside the prosthesis, a thin connective tissue membrane forms. From the emerging neo-adventitia, growth of thin layers of connective tissue in the direction of neointima is detected. Cicatricial fusion of the prosthesis with surrounding tissues was not detected. There is no late macrophage infiltration.

Предлагаемый способ изготовления сосудистых ксенотрансплантатов обеспечивает возможность получения протезов, значительно улучшающих результаты реконструктивных сосудистых операций на артериях среднего в малого диаметров, так как обладают свойствами, необходимыми артериальным сосудам, находящимся длительное время в постоянно пульсирующей системе, а именно прочностью, высокой эластичностью, сохраненной в процессе обработки естественной армировкой, защищающей от сдавления окружающими тканями, биологической стойкостью, нулевой хирургической порозностью. The proposed method for the manufacture of vascular xenografts provides the possibility of obtaining prostheses that significantly improve the results of reconstructive vascular operations on medium arteries of small diameters, since they possess the properties necessary for arterial vessels that have been in a constantly pulsating system for a long time, namely, strength, high elasticity stored in the process treatment with natural reinforcement that protects against compression by surrounding tissues, biological resistance, zero chir Urgic porosity.

Claims

METHOD FOR PRODUCING VASCULAR XENOTRANSPLANT from bird tracheobronchial tree segments by treatment with enzymes and tanning with glutaric anhydride, characterized in that the graft is saline treated in an increasing concentration of NaCl solution from 2 to 10% for 30 to 35 hours each, after one to and two enzymatic treatment, which is carried out with terrilithin for 4-6 hours at 40-45 ^o С at a flow rate of 40-50 PE per 1 g of dry matter of the trachea; after the second salt treatment, the muscle surface of the graft is cleaned ktur and treat it with 0.25 - 05% solution of glutaraldehyde.