RU2024019C1

RU2024019C1 - Method of albumin transport assay from body cavities to the lymph nodes in experimental animal

Info

Publication number: RU2024019C1
Authority: RU
Inventors: П.А. Манохин; А.Л. Глазырин; Ю.В. Солодун; Г.Н. Драгун; Ю.А. Зеленцов
Original assignee: Научно-исследовательский институт хирургии Восточно-Сибирского филиала СО РАМН
Priority date: 1991-03-29
Filing date: 1991-03-29
Publication date: 1994-11-30

Abstract

FIELD: experimental medicine. SUBSTANCE: labeled antigen is administrated into animal cavity body following by its assay on the morphological preparation. The source of labeled antigen is colloidal gold with particle size 10 nm taken at the ratio albumin:colloidal gold = 12.5:1. Antigen concentration is determined by morphometry method and by gold atoms intensity excitement under effect of synchrotron irradiation. Method is simple and excludes ray effect. EFFECT: simplified label visualization, elimination of ray action.

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано для количественной оценки и визуализации на клеточном и субклеточном уровнях транспорта антигенов из полостей тела. The invention relates to medicine, namely to experimental medicine, and can be used to quantify and visualize at the cellular and subcellular levels of transport of antigens from body cavities.

В экспериментальной медицине известны различные способы определения транспорта веществ из полостей тела, такие как определение путей транспорта веществ из полостей тела с помощью туши (Brierley J.B., Field E.J. J. Anat. , 1948, v. 82, P. 153-166), ферритина, угля (Fedorko M.E., Hirsch J.G., Fried B. Exp. Cell. Res., 1971, v. 69, P. 313). Также известен способ определения транспорта белков путем их метки пероксидазой хрена (Mikhaylova K., Vasilev V. Histochemistry, 1988, v. 88, N 3-6, P. 583-586). In experimental medicine, various methods are known for determining the transport of substances from body cavities, such as determining the transport routes of substances from body cavities using mascara (Brierley JB, Field EJJ Anat., 1948, v. 82, P. 153-166), ferritin, coal (Fedorko ME, Hirsch JG, Fried B. Exp. Cell. Res., 1971, v. 69, P. 313). Also known is a method for determining protein transport by labeling with horseradish peroxidase (Mikhaylova K., Vasilev V. Histochemistry, 1988, v. 88, N 3-6, P. 583-586).

Наиболее близким к предлагаемому является способ количественной оценки транспорта альбумина из полостей тела в лимфатические узлы у экспериментального животного с использованием метки радиоактивным изотопом (Widner H., Jonsson B-A. , Hallstadius L. et al. Eur. J. Nucl. Med., 1987, v. 13, N 9, P. 456-461). Closest to the proposed one is a method for quantifying the transport of albumin from body cavities to the lymph nodes in an experimental animal using a radioactive isotope tag (Widner H., Jonsson BA., Hallstadius L. et al. Eur. J. Nucl. Med., 1987, v. 13, N 9, P. 456-461).

Известный способ осуществляют следующим образом. В желудочек мозга крысы вводят альбумин, меченый радиоактивным изотопом 99Тс, и с помощью сцинтилляционной камеры измеряют изменение радиоактивности головы и шеи животного в течение 70 мин. Получаемая динамика радиоактивности позволяет судить о количестве транспортируемого антигена в исследуемой области. Через 10 ч животное забивают, и исследуют уровень радиоактивности в тканях, то-есть определяют количество поступившего маркера. На ультраструктурном уровне накопление метки оценивают методом количественной авторадиографии. The known method is as follows. Albumin labeled with the 99Tc radioactive isotope is introduced into the ventricle of the rat brain, and the change in the radioactivity of the animal’s head and neck is measured with a scintillation chamber over 70 minutes. The resulting dynamics of radioactivity allows us to judge the amount of transported antigen in the study area. After 10 hours, the animal is killed, and the level of radioactivity in the tissues is examined, that is, the amount of incoming marker is determined. At the ultrastructural level, tag accumulation is evaluated by quantitative autoradiography.

Данный способ имеет ряд существенных недостатков. Прежде всего это наличие опасного радиоактивного излучения. Обращение с такими реактивами требует специального оборудования, соблюдения определенных мер безопасности. Кроме того, для выявления маркера на клеточном и субклеточном уровнях (методом авторадиографии) необходимо выполнение сложной многоступенчатой методики с наслаиванием фоточувствительной эмульсии, ее проявлением и т.п. This method has several significant disadvantages. First of all, it is the presence of hazardous radiation. The handling of such reagents requires special equipment, compliance with certain safety measures. In addition, to identify the marker at the cellular and subcellular levels (by autoradiography), it is necessary to perform a complex multistage technique with layering of a photosensitive emulsion, its manifestation, etc.

Целью изобретения является исключение лучевого воздействия на организм и упрощение визуализации метки на морфологическом препарате. The aim of the invention is the elimination of radiation exposure to the body and the simplification of the visualization of the label on the morphological preparation.

Отличительные признаки изобретения заключаются в том, что в качестве маркера альбумина используют коллоидное золото с размером частиц 10 нм, взятых в соотношении альбумин : коллоидное золото 12,5 : 1. Distinctive features of the invention are that colloidal gold with a particle size of 10 nm, taken in the ratio of albumin: colloidal gold of 12.5: 1, is used as an albumin marker.

Также отличие заключается и в том, что количество накапливаемого антигена определяют по интенсивности возбуждения атомов золота под воздействием синхронного излучения и морфометрически. Also, the difference lies in the fact that the amount of accumulated antigen is determined by the intensity of excitation of gold atoms under the influence of synchronous radiation and morphometrically.

Способ осуществляют следующим образом. The method is as follows.

Перед введением в полость тела исследуемый антиген-альбумин метят коллоидным золотом, представленным монодисперсной взвесью частиц с контролируемым размером, в соотношении 12,5 : 1. Before introduction into the body cavity, the investigated albumin antigen is labeled with colloidal gold, represented by a monodisperse suspension of particles with a controlled size, in the ratio of 12.5: 1.

Меченый белок после введения в полость тела, распознается, транспортируется, поглощается клетками в соответствии с его антигенными свойствами. Путем последующего морфологического исследования на световом и ультраструктурном уровне выявляют расположение метки, а соответственно, и искомого антигена. Labeled protein after introduction into the body cavity is recognized, transported, absorbed by cells in accordance with its antigenic properties. Through subsequent morphological studies at the light and ultrastructural level, the location of the label, and, accordingly, of the desired antigen is revealed.

Количественную оценку транспорта и утилизации антигена проводят морфометрическим подсчетом частиц коллоидного золота, находящихся в клетках лимфоузла. Кроме того, по интенсивности возбуждение золота под воздействием синхротронного излучения проводят количественную оценку транспорта антигенов на органном уровне. A quantitative assessment of the transport and utilization of antigen is carried out by morphometric counting of colloidal gold particles located in the cells of the lymph node. In addition, the intensity of gold excitation under the influence of synchrotron radiation quantifies the transport of antigens at the organ level.

Предложенный способ поясняется примером. The proposed method is illustrated by example.

Проводилось количественное определение транспорта альбумина, меченого коллоидным золотом, из брюшной полости кроликов в медиастинальные лимфоузлы. Quantitative determination of the transport of albumin labeled with colloidal gold from the abdominal cavity of rabbits to the mediastinal lymph nodes was carried out.

Коллоидное золото получают восстановлением кипящего раствора 0,001% HAuCl₄ (80 мл) с 4% цитратом натрия (20 мл) в течение 15 мин. Готовый раствор содержит частицы золота размером 10 нм. К суспензии коллоидного золота альбумин добавляют в концентрации в 100 раз более высокой, чем точка флокуляции, определяемая реакцией Жигмонди. От несвязавшегося белка коллоид освобождают центрифугированием при 10000 G в течение часа. Чистый супернатант удаляют и темно-красный центрифугат ресуспендируют в остаточном супернатанте.Colloidal gold is obtained by reconstituting a boiling solution of 0.001% HAuCl ₄ (80 ml) with 4% sodium citrate (20 ml) for 15 minutes. The finished solution contains 10 nm gold particles. Albumin is added to a suspension of colloidal gold at a concentration 100 times higher than the flocculation point determined by the Gigmondy reaction. The colloid is freed from unbound protein by centrifugation at 10,000 G for one hour. The pure supernatant was removed and the dark red centrifugate was resuspended in the residual supernatant.

Исследование выполняли на 6 кроликах массой от 2,8 до 3,1 кг. Коньюгат в объеме 10 мл вводили в брюшную полость через небольшой разрез брюшной стенки под внутривенным гексеналовым наркозом. На каждое животное было израсходовано 2 мг HAuCl₄, связанного с 25 мг человеческого альбумина (в соотношении 1 : 12,5). Животные были забиты на сроках 0, 5, 2, 4, 6, 12, 24 ч от момента введения. Медиастинальные лимфоузлы удаляли, фиксировали 4 ч в 4% парафромальдегиде и 1 ч в OsO₄, заливали в эпон-аралдит. Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым голубым и исследовали на световом микроскопе. Тонкие срезы, после окраски цитратом свинца и уранил ацетатом, исследовали на электронном микроскопе Филлипс ЕМ-410.The study was performed on 6 rabbits weighing from 2.8 to 3.1 kg. A conjugate in a volume of 10 ml was injected into the abdominal cavity through a small abdominal wall incision under intravenous hexenal anesthesia. For each animal, 2 mg of HAuCl ₄ associated with 25 mg of human albumin was consumed (in a ratio of 1: 12.5). Animals were slaughtered at 0, 5, 2, 4, 6, 12, 24 hours from the time of administration. Mediastinal lymph nodes were removed, fixed for 4 hours in 4% paraphromaldehyde and 1 hour in OsO ₄ , and embedded in epon-araldite. Semi-thin sections were stained with toluidine blue and examined under a light microscope. Thin sections, after staining with lead citrate and uranyl acetate, were examined on a Phillips EM-410 electron microscope.

При исследовании неокрашенных полутонких срезов лимфоузлов на сроке 2 ч от момента введения коньюгата было обнаружено наличие в срезе темных точек. При окраске толуидиновым синим установлено, что эти точки соответствуют вторичным лизосомам, наполненным коньюгатом. Ретикулярные клетки, протягивающиеся через просвет краевого, бокового и медуллярного синусов, содержат большое количество частиц коллоидного золота. Также большое количество маркера содержали ретикулярные клетки, выстилающие лимфатические фолликулы и кровеносные сосуды в синусе. Комплексы альбумин-коллоидное золото располагались на поверхности, внутри везикул и во вторичных лизосомах ретикулярных клеток. Синусоидальные макрофаги несли большое число поверхностно связанных частиц. В кровеносных сосудах, пересекающих синусы лимфоузла, маркер был найден только в ретикулярных клетках, образующих внешний слой сосуда. В лимфатических фолликулах метка не обнаружена. In the study of unpainted semi-thin sections of lymph nodes for a period of 2 hours from the moment of conjugate administration, the presence of dark points in the section was found. When stained with toluidine blue, it was established that these points correspond to secondary lysosomes filled with conjugate. Reticular cells stretching through the lumen of the marginal, lateral and medullary sinuses contain a large number of particles of colloidal gold. Also, a large number of markers contained reticular cells lining the lymphatic follicles and blood vessels in the sinus. The albumin-colloidal gold complexes were located on the surface, inside the vesicles and in the secondary lysosomes of reticular cells. Sinusoidal macrophages carried a large number of surface-bound particles. In blood vessels crossing the sinuses of the lymph node, the marker was found only in the reticular cells that form the outer layer of the vessel. No label was found in the lymphatic follicles.

Случайным наложением морфометрической решетки по Автандилову оценивалось распределение количества антигена по зонам лимфатического узла. При этом обнаружено, что субкапсулярный синус содержит 17,5 ± 3,2% антигена захваченного лимфатическим узлом, клетки промежуточных синусов содержат 38,3 ± 2,1%, а клетки синусов мозгового вещества - 44,2 ± 3,1 % антигена. Между клеточными элементами лимфатического узла антиген распределился следующим образом: ретикулярные клетки, пересекающие синус, содержали 64,2 ± 4,5% , клетки, выстилающие лимфатические фолликулы - 21,5 ± 2,8%, адвентициальные ретикулярные клетки -11,3 ± 2,1%, блуждающие макрофаги -3 ± 0,9%. By randomly applying a morphometric lattice according to Avtandilov, the distribution of the amount of antigen in the zones of the lymph node was estimated. It was found that the subcapsular sinus contains 17.5 ± 3.2% of the antigen captured by the lymph node, the cells of the intermediate sinuses contain 38.3 ± 2.1%, and the cells of the sinuses of the brain - 44.2 ± 3.1% of the antigen. The antigen was distributed between the cellular elements of the lymph node as follows: reticular cells crossing the sinus contained 64.2 ± 4.5%, cells lining the lymphatic follicles - 21.5 ± 2.8%, adventitious reticular cells -11.3 ± 2 , 1%, wandering macrophages -3 ± 0.9%.

Количественный электронно-микроскопический анализ показал, что через 2 ч после внутрибрюшинного введения альбумина в ретикулярных клетках 5,2 ± 0,8% частиц располагались на отдельных рецепторах поверхностной мембраны, 9,4 ± 0,7% в виде скоплений антигена (кэппинг), 12,2 ± 1,8% в транспортных везикулах и 73,2 ± 4,2% во вторичных лизосомах. Quantitative electron microscopic analysis showed that 2 hours after the intraperitoneal administration of albumin in reticular cells, 5.2 ± 0.8% of the particles were located on separate surface membrane receptors, 9.4 ± 0.7% in the form of antigen accumulations (capping), 12.2 ± 1.8% in transport vesicles and 73.2 ± 4.2% in secondary lysosomes.

Количественная оценка транспорта антигена при помощи синхронного излучения проводилась на удаленных медиастинальных лимфоузлах. Для этого лимфоузел подвергали воздействию излучения синхрофазотрона и регистрировали возбуждение атомов золота, по интенсивности которого судили о количестве маркера захваченного лимфоузлом. Определено, что через 0,5 ч после внутрибрюшинного введения в медиастинальном лимфоузле накапливалось 0,021 ± 0,001 мг золота, через 2 ч - 0,025 ± 0,002 мг, через 4 ч - 0,082 ± 0,005 мг, через 6 ч - 0,061 ± 0,003 мг, через 12 ч - 0,033 ± 0,001 мг и через 24 ч - 0,002 ± 0,001 мг золота. При этом максимальная концентрация золота обнаруживалась по периферии узла в виде кольцеобразной структуры. Quantification of antigen transport using synchronous radiation was performed on distant mediastinal lymph nodes. For this, the lymph node was exposed to synchrophasotron radiation and the excitation of gold atoms was recorded, the intensity of which was used to judge the amount of marker captured by the lymph node. It was determined that after 0.5 h after intraperitoneal administration, 0.021 ± 0.001 mg of gold accumulated in the mediastinal lymph node, after 2 hours - 0.025 ± 0.002 mg, after 4 hours - 0.082 ± 0.005 mg, after 6 hours - 0.061 ± 0.003 mg, after 12 h - 0.033 ± 0.001 mg and after 24 hours - 0.002 ± 0.001 mg of gold. In this case, the maximum concentration of gold was detected at the periphery of the node in the form of a ring-shaped structure.

Приведенный пример показал, что использование в качестве маркера антигена коллоидного золота позволяет дать полную количественную оценку транспорта антигена из брюшной полости. С помощью синхротронного излучения определена динамика накопления маркера медиастинальным лимфоузлом. При световой микроскопии дан количественный анализ распределения метки по зонам лимфоузла и ультраструктурным исследованием определено распределение метки по органеллам ретикулярной клетки лимфоузла. The above example showed that the use of colloidal gold as an antigen marker allows a complete quantitative assessment of the transport of antigen from the abdominal cavity. Using synchrotron radiation, the dynamics of marker accumulation by the mediastinal lymph node was determined. Under light microscopy, a quantitative analysis of the distribution of the label over the zones of the lymph node is given, and an ultrastructural study determined the distribution of the label over the organelles of the reticular cell of the lymph node.

Таким образом, заявляемый способ позволяет проводить количественную оценку транспорта белков из полостей тела животного (брюшной, плевральной, перикардиальной, полостей мозга и т.д.). Количественный анализ возможен на уровнях от органного до субклеточного. При этом визуализация маркированного антигена на морфологическом препарате, в отличие от способа с применением радиоактивной метки или пероксидазы, не требует выполнения специальных методик. Thus, the inventive method allows a quantitative assessment of the transport of proteins from animal body cavities (abdominal, pleural, pericardial, brain cavities, etc.). Quantitative analysis is possible at levels from organ to subcellular. In this case, the visualization of labeled antigen on a morphological preparation, in contrast to the method using a radioactive label or peroxidase, does not require the implementation of special techniques.

Claims

METHOD FOR ESTIMATING ALBUMINE TRANSPORT FROM BODY CELLS TO LYMPH NODES IN AN EXPERIMENTAL ANIMAL by introducing labeled albumin into the cavity with its subsequent determination on a morphological preparation made from lymph node tissue, characterized in that, with the aim of simplifying the colloid gold, the method is used to with a particle size of 10 nm, taken in the ratio albumin: colloidal gold 12.5: 1, and the amount of transported albumin to the lymph nodes is determined morphologically and by the intensity of excitation of atoms of gold under the influence of synchrotron radiation.