Claims (31)
1. Кассета экспрессии для обеспечения экспрессии трансгена в клетке печени, где кассета экспрессии содержит трансген, функционально связанный с промотором, предусматривающим промотор гена транстиретина мыши (mTTR); и одним или двумя модифицированными энхансерами гена альфа-1-микробикунина (mA1MB2). 1. An expression cassette for providing expression of a transgene in a liver cell, wherein the expression cassette contains a transgene operably linked to a promoter comprising a mouse transthyretin (mTTR) gene promoter; and one or two modified alpha-1-microbicunin gene enhancers (mA1MB2).
2. Кассета экспрессии по п. 1, где один или два энхансера mA1MB2 содержат последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 8.2. The expression cassette according to claim 1, wherein one or two mA1MB2 enhancers contain the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 8.
3. Кассета экспрессии по п. 1 или 2, где энхансер расположен со стороны 5’-конца относительно промотора mTTR.3. The expression cassette according to claim 1 or 2, where the enhancer is located at the 5’ end relative to the mTTR promoter.
4. Кассета экспрессии по любому из пп. 1-3, где промотор mTTR представляет собой промотор mTTR482.4. Expression cassette according to any one of claims. 1-3, wherein the mTTR promoter is the mTTR482 promoter.
5. Кассета экспрессии по любому из п. 1-4, где кассета экспрессии дополнительно содержит интрон. 5. The expression cassette according to any one of claims 1-4, where the expression cassette further contains an intron.
6. Кассета экспрессии по п. 5, где интрон представляет собой гибридный интрон генов β-актина курицы/β-глобина кролика.6. The expression cassette according to claim 5, where the intron is a hybrid intron of the chicken β-actin/rabbit β-globin genes.
7. Кассета экспрессии по п. 6, где гибридный интрон генов β-актина курицы/β-глобина кролика содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15.7. The expression cassette according to claim 6, wherein the hybrid intron of the chicken β-actin/rabbit β-globin genes contains the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 15.
8. Кассета экспрессии по любому из пп. 1-7, отличающаяся тем, что кассета экспрессии дополнительно содержит спейсерную последовательность нуклеиновой кислоты. 8. Expression cassette according to any one of paragraphs. 1-7, characterized in that the expression cassette additionally contains a nucleic acid spacer sequence.
9. Кассета экспрессии по п. 8, где спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты включает спейсерную последовательность интрона A1AT под SEQ ID NO:16.9. The expression cassette according to claim 8, wherein the nucleic acid spacer sequence includes the A1AT intron spacer sequence of SEQ ID NO:16.
10. Кассета экспрессии по любому из пп. 1-9, где трансген представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид PAH.10. Expression cassette according to any one of claims. 1-9, wherein the transgene is a nucleic acid encoding a PAH polypeptide.
11. Вектор, содержащий кассету экспрессии по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV). 11. A vector containing an expression cassette according to any one of claims. 1-10, characterized in that the vector is a vector based on recombinant adeno-associated virus (rAAV).
12. Вектор на основе rAAV, содержащий кассету экспрессии по пп. 1-10, фланкированные одной или несколькими последовательностями инвертированного концевого повтора (ITR) AAV. 12. An rAAV-based vector containing an expression cassette according to claims. 1-10, flanked by one or more AAV inverted terminal repeat (ITR) sequences.
13. Вектор на основе rAAV по п. 12, отличающийся тем, что вектор на основе rAAV содержит в направлении от 5'- к 3'-концу ITR AAV2; 13. The rAAV-based vector according to claim 12, characterized in that the rAAV-based vector contains, in the direction from the 5' to the 3' end, the ITR of AAV2;
промотор m1A1MB2-mTTR482;promoter m1A1MB2-mTTR482;
гибридный интрон генов β-актина курицы (CBA)/β-глобина кролика;hybrid intron of chicken β-actin (CBA)/rabbit β-globin genes;
нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид PAH;a nucleic acid encoding a PAH polypeptide;
спейсерную последовательность нуклеиновой кислоты, включающую последовательность нуклеиновой кислоты из интрона гена альфа-1-антитрипсина человека, при этом интрон гена альфа-1-антитрипсина человека был мутирован с удалением последовательностей ATG;a nucleic acid spacer sequence comprising a nucleic acid sequence from an intron of a human alpha 1 antitrypsin gene, wherein the intron of the human alpha 1 antitrypsin gene has been mutated to remove the ATG sequences;
сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста; bovine growth hormone polyadenylation signal;
ITR AAV2. ITR AAV2.
14. Вектор на основе rAAV по п. 12 или 13, где вектор представляет собой самокомплементарный вектор, при этом вектор содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PAH, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность, комплементарную последовательности полипептида PAH, 14. The rAAV-based vector of claim 12 or 13, wherein the vector is a self-complementary vector, the vector comprising a first nucleic acid sequence encoding a PAH polypeptide and a second nucleic acid sequence encoding a sequence complementary to the PAH polypeptide sequence,
при этом первая последовательность нуклеиновой кислоты может образовывать внутринитевые пары оснований со второй последовательностью нуклеиновой кислоты на протяжении большей части или всей ее длины. wherein the first nucleic acid sequence may form intrastrand base pairs with the second nucleic acid sequence over most or all of its length.
15. Частица rAAV, содержащая вектор на основе rAAV по любому из пп. 12-14, где: 15. An rAAV particle containing a rAAV-based vector according to any one of claims. 12-14, where:
a) вирусная частица rAAV содержит капсид серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, AAV козы, химерного AAV1/AAV2, AAV крупного рогатого скота, AAV мыши или rAAV2/HBoV1; илиa) the rAAV viral particle contains the capsid of the serotype AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, goat AAV, chimeric AAV1/AAV2, bovine AAV, mouse AAV, or rAAV2/HBoV1; or
b) вирусная частица rAAV содержит сконструированный капсид AAV, необязательно капсид DJ или капсид LK03. b) the rAAV viral particle contains an engineered AAV capsid, optionally a DJ capsid or an LK03 capsid.
16. Композиция, содержащая кассету экспрессии по любому из пп. 1-10 или частицу rAAV по п. 15, где композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. 16. A composition containing an expression cassette according to any one of paragraphs. 1-10 or the rAAV particle of claim 15, wherein the composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
17. Клетка, содержащая кассету экспрессии по любому из пп. 1-10 или вектор на основе rAAV по любому из пп. 12-14.17. A cell containing an expression cassette according to any one of paragraphs. 1-10 or the rAAV-based vector according to any one of paragraphs. 12-14.
18. Клетка по п.17, содержащая трансген, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид PAH. 18. The cell according to claim 17, containing a transgene comprising a nucleic acid encoding a PAH polypeptide.
19. Способ получения полипептида PAH, при этом способ включает культивирование клетки по п. 18 в условиях, обеспечивающих продуцирование полипептид PAH, где необязательно способ дополнительно включает стадию очистки варианта полипептида PAH. 19. A method for producing a PAH polypeptide, the method comprising culturing the cell of claim 18 under conditions to produce a PAH polypeptide, wherein the method optionally further comprises the step of purifying a variant of the PAH polypeptide.
20. Способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума или снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму вектора на основе rAAV по п. 13, частицы rAAV по п. 15, клетки по п. 17 или композиции по п. 16. 20. A method of treating phenylketonuria in an individual in need thereof or reducing the level of phenylalanine in the blood of an individual in need thereof, comprising administering to the individual the rAAV-based vector of claim 13, the rAAV particle of claim 15, the cell of claim 17, or the composition of claim 17. . 16.
21. Способ по п. 20, где вектор на основе rAAV, частицу rAAV, композицию или клетку вводят внутривенно, внутриартериально, внутрипеченочно, внутрипортально, внутрибрюшинно или подкожно, и/или где введение осуществляют в комбинации с другим видом терапии, при этом необязательно другой вид терапии представляет собой лечение с помощью тетрагидробиоптерина, лечение с помощью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL) или пегилированной PAL или диету с ограничением потребления фенилаланина. 21. The method of claim 20, wherein the rAAV-based vector, rAAV particle, composition or cell is administered intravenously, intra-arterially, intrahepatically, intraportally, intraperitoneally or subcutaneously, and/or where the administration is in combination with another therapy, optionally another The type of therapy is treatment with tetrahydrobiopterin, treatment with phenylalanine ammonia lyase (PAL) or pegylated PAL, or a phenylalanine-restricted diet.
22. Набор, содержащий кассету экспрессии по любому из пп. 1-10, вектор по п. 11, вектор на основе rAAV по любому из пп. 12-14, частицу rAAV по п. 15 или композицию по п. 16, где набор дополнительно содержит инструкции по применению, буферы и/или фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества и/или флаконы, ампулы и/или шприцы. 22. A kit containing an expression cassette according to any one of paragraphs. 1-10, the vector according to claim 11, the rAAV-based vector according to any one of paragraphs. 12-14, the rAAV particle of claim 15, or the composition of claim 16, wherein the kit further contains instructions for use, buffers and/or pharmaceutically acceptable excipients and/or vials, ampoules and/or syringes.