Claims (52)
1. Кассета экспрессии, содержащая полинуклеотидную последовательность, содержащую следующее в 5’-3’-направлении:1. An expression cassette containing a polynucleotide sequence containing the following in the 5'-3' direction:
(a) промоторную последовательность гена фосфоглицераткиназы (PGK) человека или ее функциональный гомолог или вариант; (a) a human phosphoglycerate kinase (PGK) gene promoter sequence, or a functional homologue or variant thereof;
(b) последовательность, кодирующую полипептид FANCA человека или его функциональный фрагмент или вариант;(b) a sequence encoding a human FANCA polypeptide or a functional fragment or variant thereof;
(c) сигнальную последовательность экспорта РНК регуляторного элемента вируса гепатита сурков (WPRE) или ее функциональный вариант или фрагмент,(c) the woodchuck hepatitis regulatory element (WPRE) RNA export signal sequence, or a functional variant or fragment thereof,
где последовательность, кодирующая полипептид FANCA человека или его функциональный фрагмент или вариант, функционально связана с промоторной последовательностью гена PGK.where the sequence encoding the human FANCA polypeptide or its functional fragment or variant is operably linked to the promoter sequence of the PGK gene.
2. Кассета экспрессии по п. 1, где полипептид FANCA содержит последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 25.2. An expression cassette according to claim 1, wherein the FANCA polypeptide contains a sequence having at least 90% identity with SEQ ID NO: 25.
3. Кассета экспрессии по п. 1, где последовательность, кодирующая полипептид FANCA, содержит последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 8.3. The expression cassette according to claim 1, wherein the sequence encoding the FANCA polypeptide contains a sequence characterized by at least 90% identity with SEQ ID NO: 8.
4. Кассета экспрессии по п. 1, где промотор гена PGK содержит последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 7.4. An expression cassette according to claim 1, wherein the PGK gene promoter contains a sequence characterized by at least 90% identity with SEQ ID NO: 7.
5. Кассета экспрессии по п. 1, где элемент WPRE содержит последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 23.5. An expression cassette according to claim 1, wherein the WPRE element contains a sequence having at least 90% identity with SEQ ID NO: 23.
6. Кассета экспрессии по п. 1, где кассета содержит последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 24.6. An expression cassette according to claim 1, wherein the cassette contains a sequence having at least 90% identity with SEQ ID NO: 24.
7. Кассета экспрессии по любому из пп. 1-6, дополнительно содержащая одну или более энхансерных последовательностей.7. Cassette expression according to any one of paragraphs. 1-6, additionally containing one or more enhancer sequences.
8. Кассета экспрессии по п. 1, дополнительно содержащая:8. An expression cassette according to claim 1, further comprising:
(d) полипуриновый тракт (PPT) или сигнальную последовательность полиаденилирования (polyA). (d) polypurine tract (PPT) or polyadenylation signal sequence (polyA).
9. Кассета экспрессии по п. 1, дополнительно содержащая одну или более из следующих последовательностей:9. An expression cassette according to claim 1, further comprising one or more of the following sequences:
(e) последовательность сигнала упаковки; (e) the sequence of the packing signal;
(f) усеченную последовательность Gag; (f) a truncated Gag sequence;
(g) Rev-чувствительный элемент (RRE); (g) Rev-sensing element (RRE);
(h) центральный полипуриновый тракт (cPPT); (h) central polypurine tract (cPPT);
(i) центральную терминальную последовательность (CTS) и (i) the Central Terminal Sequence (CTS) and
(j) элемент последовательности, расположенный против хода транскрипции (USE), необязательно из вируса обезьян 40 (SV40-USE). (j) an upstream sequence element (USE), optionally from simian virus 40 (SV40-USE).
10. Рекомбинантный вектор доставки гена, содержащий кассету экспрессии по любому из пп. 1-9.10. A recombinant gene delivery vector containing an expression cassette according to any one of paragraphs. 1-9.
11. Рекомбинантный вектор доставки гена по п. 10, где рекомбинантный вектор доставки гена представляет собой вирус или вирусный вектор. 11. The recombinant gene delivery vector of claim 10, wherein the recombinant gene delivery vector is a virus or viral vector.
12. Рекомбинантный вектор доставки гена по п. 11, где вирус или вирусный вектор представляет собой лентивирус (LV).12. The recombinant gene delivery vector of claim 11, wherein the virus or viral vector is a lentivirus (LV).
13. Клетка, содержащая кассету экспрессии по любому из пп. 1-9 или рекомбинантный вектор доставки гена по любому из пп. 10-12.13. A cell containing an expression cassette according to any one of paragraphs. 1-9 or a recombinant gene delivery vector according to any one of paragraphs. 10-12.
14. Клетка по п. 13, где клетка представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку.14. The cell of claim 13, wherein the cell is a hematopoietic stem cell.
15. Клетка по п. 13, где клетка представляет собой CD34+ клетку.15. A cell according to claim 13, wherein the cell is a CD34+ cell.
16. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый наполнитель и рекомбинантный вектор доставки гена по любому из пп. 10-12.16. A pharmaceutical composition containing a pharmaceutically acceptable excipient and a recombinant gene delivery vector according to any one of paragraphs. 10-12.
17. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый наполнитель и клетку по любому из пп. 13-15.17. Pharmaceutical composition containing a pharmaceutically acceptable excipient and cell according to any one of paragraphs. 13-15.
18. Способ лечения анемии Фанкони у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий обеспечение субъекта фармацевтической композицией по п. 16.18. A method for treating Fanconi anemia in a subject in need thereof, comprising providing the subject with a pharmaceutical composition according to claim 16.
19. Способ лечения анемии Фанкони у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий обеспечение субъекта фармацевтической композицией по п. 17.19. A method for treating Fanconi anemia in a subject in need thereof, comprising providing the subject with a pharmaceutical composition according to claim 17.
20. Способ лечения анемии Фанкони у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий обеспечение субъекта CD34+ клетками, содержащими кассету экспрессии, где кассета экспрессии содержит полинуклеотидную последовательность, содержащую следующее в 5’-3’-направлении:20. A method for treating Fanconi anemia in a subject in need thereof, comprising providing the subject with CD34+ cells containing an expression cassette, wherein the expression cassette contains a polynucleotide sequence containing the following in the 5'-3' direction:
(a) промоторную последовательность гена фосфоглицераткиназы (PGK) человека или ее функциональный гомолог или вариант; (a) a human phosphoglycerate kinase (PGK) gene promoter sequence, or a functional homologue or variant thereof;
(b) последовательность, кодирующую полипептид FANCA человека или его функциональный фрагмент или вариант;(b) a sequence encoding a human FANCA polypeptide or a functional fragment or variant thereof;
(c) сигнальную последовательность экспорта РНК регуляторного элемента вируса гепатита сурков (WPRE) или ее функциональный вариант или фрагмент,(c) the woodchuck hepatitis regulatory element (WPRE) RNA export signal sequence, or a functional variant or fragment thereof,
где последовательность, кодирующая полипептид FANCA человека или его функциональный фрагмент или вариант, функционально связана с промоторной последовательностью гена PGK.where the sequence encoding the human FANCA polypeptide or its functional fragment or variant is operably linked to the promoter sequence of the PGK gene.
21. Способ по п. 20, где CD34+ клетки были получены от субъекта.21. The method of claim 20 wherein the CD34+ cells were obtained from a subject.
22. Способ по п. 21, где CD34+ клетки были получены от субъекта после обработки субъекта комбинацией из: (i) G-CSF или филграстима и (ii) плериксафора.22. The method of claim 21 wherein CD34+ cells were obtained from the subject after treatment of the subject with a combination of: (i) G-CSF or filgrastim and (ii) plerixaphor.
23. Способ по любому из пп. 20-22, где CD34+ клетки были трансдуцированы рекомбинантным вектором доставки гена, содержащим кассету экспрессии.23. The method according to any one of paragraphs. 20-22, where CD34+ cells have been transduced with a recombinant gene delivery vector containing an expression cassette.
24. Способ по п. 23, где CD34+ клетки были трансдуцированы за счет приведения CD34+ клеток в контакт с рекомбинантным вектором доставки гена на протяжении приблизительно 24 часов.24. The method of claim 23, wherein the CD34+ cells were transduced by contacting the CD34+ cells with a recombinant gene delivery vector for approximately 24 hours.
25. Способ лечения анемии Фанкони у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий:25. A method for treating Fanconi anemia in a subject in need thereof, comprising:
(a) обеспечение субъекта комбинацией из: (i) G-CSF или филграстима и (ii) плериксафора для мобилизации CD34+ клеток у субъекта; (a) providing the subject with a combination of: (i) G-CSF or filgrastim and (ii) plerixaphor to mobilize CD34+ cells in the subject;
(b) получение биологического образца, содержащего CD34+ клетки, от субъекта, где биологический образец необязательно представляет собой периферическую кровь или костный мозг; (b) obtaining a biological sample containing CD34+ cells from a subject, where the biological sample is optionally peripheral blood or bone marrow;
(c) получение клеточной популяции, обогащенной CD34+ клетками, из биологического образца; (c) obtaining a cell population enriched in CD34+ cells from a biological sample;
(d) трансдуцирование клеточной популяции, обогащенной CD34+ клетками, рекомбинантным вектором доставки гена, содержащим кассету экспрессии, содержащую полинуклеотидную последовательность, содержащую следующее в 5’-3’-направлении: (d) transducing a cell population enriched in CD34+ cells with a recombinant gene delivery vector containing an expression cassette containing a polynucleotide sequence containing the following in the 5'-3' direction:
(i) промоторную последовательность или ее функциональный гомолог или вариант и (i) a promoter sequence or a functional homologue or variant thereof, and
(ii) последовательность, кодирующую полипептид FANCA человека или его функциональный фрагмент или вариант,(ii) a sequence encoding a human FANCA polypeptide or a functional fragment or variant thereof,
где последовательность, кодирующая полипептид FANCA человека или его функциональный фрагмент или вариант, функционально связана с промоторной последовательностью гена PGK; иwhere the sequence encoding the human FANCA polypeptide or its functional fragment or variant is operably linked to the promoter sequence of the PGK gene; And
(e) обеспечение субъекта клеточной популяцией, трансдуцированной лентивирусным вектором, полученной на стадии (d). (e) providing the subject with the cell population transduced with the lentiviral vector obtained in step (d).
26. Способ по п. 25, где получение клеточной популяции предусматривает проведение истощения по эритроцитам.26. The method of claim 25, wherein obtaining a cell population involves performing a depletion of erythrocytes.
27. Способ по п. 25, где получение клеточной популяции предусматривает проведение обогащения CD34+ клетками путем положительного отбора, отрицательного отбора или их комбинации.27. The method of claim 25, wherein obtaining a cell population involves enriching CD34+ cells by positive selection, negative selection, or a combination thereof.
28. Способ по п. 25, где способ подавляет развитие, препятствует прогрессированию и/или обращает прогрессирование гематологического проявления анемии Фанкони у субъекта.28. The method of claim 25, wherein the method inhibits, prevents the progression of, and/or reverses the progression of a hematological manifestation of Fanconi anemia in a subject.
29. Способ по п. 28, где гематологическое проявление анемии Фанкони выбрано из одного или более из BMF, тромбоцитопении, лейкопении, панцитопении, нейтропении и анемии.29. The method of claim 28, wherein the hematological manifestation of Fanconi anemia is selected from one or more of BMF, thrombocytopenia, leukopenia, pancytopenia, neutropenia, and anemia.