Claims (111)
1. Способ получения библиотеки нуклеиновых кислот, включающий:1. A method for obtaining a library of nucleic acids, including:
(a) получение множества нуклеиновых кислот, причем указанное множество нуклеиновых кислот представляет собой одноцепочечные нуклеиновые кислоты;(a) obtaining a set of nucleic acids, and the specified set of nucleic acids is a single-stranded nucleic acids;
(b) дефосфорилирование 5'-концов одноцепочечных нуклеиновых кислот;(b) dephosphorylation of the 5' ends of single-stranded nucleic acids;
(c) лигирование первого адаптера с 3'-концами одноцепочечных нуклеиновых кислот в присутствии лигазы, причем 3'-конец первого адаптера содержит блокирующую группу;(c) ligating the first adapter to the 3' ends of the single stranded nucleic acids in the presence of a ligase, wherein the 3' end of the first adapter contains a blocking group;
(d) фосфорилирование 5'-концов лигированных одноцепочечных нуклеиновых кислот; и(d) phosphorylation of the 5' ends of the ligated single-stranded nucleic acids; And
(e) лигирование второго адаптера с 5'-концами фосфорилированных лигированных одноцепочечных нуклеиновых кислот в присутствии лигазы, за счет чего получают библиотеку нуклеиновых кислот.(e) ligating the second adapter to the 5' ends of the phosphorylated ligated single stranded nucleic acids in the presence of a ligase, whereby a nucleic acid library is obtained.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что 5'-конец второго адаптера нефосфорилирован.2. The method according to claim 1, characterized in that the 5'-end of the second adapter is non-phosphorylated.
3. Способ по п. 1 или 2, характеризующийся тем, что второй адаптер присоединен к подложке.3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that the second adapter is attached to the substrate.
4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что подложка включает гранулу или проточную ячейку.4. The method according to claim 3, characterized in that the substrate includes a bead or flow cell.
5. Способ по п. 1, включающий удаление нелигированных одноцепочечных первых адаптеров до этапа (е).5. The method of claim 1, comprising removing unligated single stranded first adapters prior to step (e).
6. Способ по п. 5, включающий гибридизацию нелигированных одноцепочечных первых адаптеров с зондом захвата.6. The method of claim 5, comprising hybridizing non-ligated single stranded first adapters to a capture probe.
7. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что зонд захвата содержит последовательность, комплементарную по меньшей мере части первого адаптера7. The method of claim. 6, characterized in that the capture probe contains a sequence that is complementary to at least part of the first adapter
8. Способ по п. 6 или 7, характеризующийся тем, что 3'-конец зонда захвата содержит блокирующую группу.8. The method according to claim 6 or 7, characterized in that the 3' end of the capture probe contains a blocking group.
9. Способ по любому из пп. 6-8, характеризующийся тем, что 5'-конец зонда захвата содержит блокирующую группу.9. The method according to any one of paragraphs. 6-8, characterized in that the 5' end of the capture probe contains a blocking group.
10. Способ по п. 5, включающий гидролиз нелигированных одноцепочечных первых адаптеров.10. The method of claim. 5, including hydrolysis of non-ligated single-stranded first adapters.
11. Способ по п. 10, характеризующийся тем, что гидролиз нелигированных одноцепочечных первых адаптеров включает приведение нелигированных одноцепочечных первых адаптеров в контакт с 5'-фосфат-зависимой экзонуклеазой.11. The method of claim 10, wherein the hydrolysis of the unligated single stranded first adapters comprises contacting the unligated single stranded first adapters with a 5'-phosphate dependent exonuclease.
12. Способ по п. 10 или 11, характеризующийся тем, что гидролиз нелигированных одноцепочечных первых адаптеров включает приведение нелигированных одноцепочечных первых адаптеров в контакт с 5'-фосфат-зависимой экзонуклеазой и 5'-деаденилазой.12. The method of claim 10 or 11, wherein the hydrolysis of the unligated single strand first adapters comprises contacting the unligated single strand first adapters with a 5'-phosphate dependent exonuclease and a 5'-deadenylase.
13. Способ по любому из пп. 1-12, характеризующийся тем, что фосфорилирование 5'-конца лигированных одноцепочечных нуклеиновых кислот включает приведение лигированных одноцепочечных нуклеиновых кислот в контакт с киназой.13. The method according to any one of paragraphs. 1-12, characterized in that phosphorylation of the 5'end of the ligated single-stranded nucleic acids includes bringing the ligated single-stranded nucleic acids into contact with a kinase.
14. Способ получения библиотеки нуклеиновых кислот, включающий:14. A method for obtaining a library of nucleic acids, including:
(a) получение множества нуклеиновых кислот, причем указанное множество нуклеиновых кислот представляет собой двуцепочечные нуклеиновые кислоты;(a) obtaining a set of nucleic acids, and the specified set of nucleic acids is a double-stranded nucleic acids;
(b) приведение двуцепочечных нуклеиновых кислот в контакт с 5'-экзонуклеазой с получением множества модифицированных двуцепочечных нуклеиновых кислот с одно цепочечными 3'-выступающими концами;(b) contacting the double-stranded nucleic acids with a 5'-exonuclease to produce a plurality of modified double-stranded nucleic acids with single-stranded 3' overhangs;
(c) лигирование первого адаптера с 3'-концами модифицированных двуцепочечных нуклеиновых кислот в присутствии лигазы, причем 3'-конец первого адаптера содержит блокирующую группу;(c) ligating the first adapter to the 3' ends of the modified double-stranded nucleic acids in the presence of a ligase, wherein the 3' end of the first adapter contains a blocking group;
(d) денатурацию модифицированных двуцепочечных нуклеиновых кислот, лигированных с первыми адаптерами, с получением множества одноцепочечных нуклеиновых кислот; и(d) denaturing the modified double-stranded nucleic acids ligated to the first adapters to produce a plurality of single-stranded nucleic acids; And
(e) лигирование второго адаптера с 5'-концами одноцепочечных нуклеиновых кислот в присутствии лигазы, за счет чего получают библиотеку нуклеиновых кислот.(e) ligating the second adapter to the 5' ends of the single stranded nucleic acids in the presence of a ligase, whereby a nucleic acid library is obtained.
15. Способ по п. 14, характеризующийся тем, что 5'-конец второго адаптера нефосфорилирован.15. The method of claim 14, wherein the 5' end of the second adapter is non-phosphorylated.
16. Способ получения библиотеки нуклеиновых кислот, включающий:16. A method for obtaining a library of nucleic acids, including:
(a) получение множества нуклеиновых кислот, причем указанное множество нуклеиновых кислот представляет собой одноцепочечные нуклеиновые кислоты;(a) obtaining a set of nucleic acids, and the specified set of nucleic acids is a single-stranded nucleic acids;
(b) дефосфорилирование 5'-концов одноцепочечных нуклеиновых кислот;(b) dephosphorylation of the 5' ends of single-stranded nucleic acids;
(c) лигирование первого адаптера с 3'-концами одноцепочечных нуклеиновых кислот в присутствии лигазы, причем 3'-конец первого адаптера содержит блокирующую группу;(c) ligating the first adapter to the 3' ends of the single stranded nucleic acids in the presence of a ligase, wherein the 3' end of the first adapter contains a blocking group;
(d) гибридизацию лигированного первого адаптера с зондом захвата;(d) hybridizing the ligated first adapter to the capture probe;
(е) удлинение зонда захвата и лигирование второго адаптера с 3'-концом удлиненного зонда захвата в присутствии лигазы, причем 3'-конец второго адаптера содержит блокирующую группу, за счет чего получают библиотеку нуклеиновых кислот.(e) extending the capture probe and ligating the second adapter to the 3' end of the extended capture probe in the presence of a ligase, wherein the 3' end of the second adapter contains a blocking group, thereby obtaining a nucleic acid library.
17. Способ по п. 16, включающий удаление гибридизованного лигированного первого адаптера с удлиненного зонда захвата.17. The method of claim 16, comprising removing the hybridized ligated first adapter from the extended capture probe.
18. Способ по п. 16 или 17, характеризующийся тем, что зонд захвата присоединен к подложке.18. The method according to claim 16 or 17, characterized in that the capture probe is attached to the substrate.
19. Способ по п. 18, характеризующийся тем, что подложка включает гранулу или проточную ячейку.19. The method of claim 18, wherein the support comprises a bead or flow cell.
20. Способ по любому из пп. 16-19, характеризующийся тем, что зонд захвата содержит индекс зонда захвата.20. The method according to any one of paragraphs. 16-19, characterized in that the capture probe contains an index of the capture probe.
21. Способ по любому из пп. 16-20, характеризующийся тем, что зонд захвата содержит отщепляемый линкер.21. The method according to any one of paragraphs. 16-20, characterized in that the capture probe contains a cleavable linker.
22. Способ по п. 21, включающий отщепление отщепляемого линкера.22. The method of claim 21, comprising cleavage of the cleavable linker.
23. Способ получения библиотеки нуклеиновых кислот, включающий:23. A method for obtaining a library of nucleic acids, including:
(a) получение множества нуклеиновых кислот, причем указанное множество нуклеиновых кислот представляет собой одноцепочечные нуклеиновые кислоты;(a) obtaining a set of nucleic acids, and the specified set of nucleic acids is a single-stranded nucleic acids;
(b) дефосфорилирование 5'-концов одноцепочечных нуклеиновых кислот;(b) dephosphorylation of the 5' ends of single-stranded nucleic acids;
(c) лигирование линкера с 3'-концами одноцепочечных нуклеиновых кислот, причем линкер содержит первый адаптер и второй адаптер, а 3'-конец линкера содержит блокирующую группу;(c) ligating the linker to the 3' ends of the single stranded nucleic acids, wherein the linker contains a first adapter and a second adapter, and the 3' end of the linker contains a blocking group;
(d) фосфорилирование 5'-концов лигированных одноцепочечных нуклеиновых кислот;(d) phosphorylation of the 5' ends of the ligated single-stranded nucleic acids;
(e) снятие защиты с 3'-концов фосфорилированных нуклеиновых кислот и замыкание нуклеиновых кислот со снятой защитой в кольцо путем лигирования, за счет чего получают библиотеку кольцевых нуклеиновых кислот.(e) deprotection of the 3' ends of the phosphorylated nucleic acids and closure of the deprotected nucleic acids into a ring by ligation, whereby a library of circular nucleic acids is obtained.
24. Способ по п. 23, характеризующийся тем, что линкер содержит расщепляемый сайт между первым адаптером и вторым адаптером.24. The method of claim. 23, characterized in that the linker contains a cleavable site between the first adapter and the second adapter.
25. Способ по п. 24, дополнительно включающий перевод кольцевых нуклеиновых кислот в линейную форму путем расщепления по расщепляемому линкеру.25. The method of claim 24, further comprising linearizing the circular nucleic acids by cleavage at a cleavable linker.
26. Способ по п. 24 или 25, характеризующийся тем, что расщепляемый сайт содержит остаток урацила.26. The method according to claim 24 or 25, characterized in that the cleavage site contains a uracil residue.
27. Способ по п. 26, включающий приведение кольцевых нуклеиновых кислот в контакт с урацил-специфическим эксцизионным реагентом.27. The method of claim 26, comprising contacting the circular nucleic acids with a uracil-specific excision reagent.
28. Способ по п. 27, характеризующийся тем, что урацил-специфический эксцизионный реагент содержит фермент, выбранный из урацил-ДНК-гликозилазы (UDG) и ДНК-гликозилазы-лиазы-эндонуклеазы VIII.28. The method of claim 27, wherein the uracil-specific excision reagent contains an enzyme selected from uracil DNA glycosylase (UDG) and DNA glycosylase lyase endonuclease VIII.
29. Способ по любому из пп. 23-28, дополнительно включающий амплификацию кольцевых нуклеиновых кислот способом, включающим гибридизацию по меньшей мере праймера с первым адаптером или вторым адаптером.29. The method according to any one of paragraphs. 23-28 further comprising amplifying the circular nucleic acids by a method comprising hybridizing at least a primer to a first adapter or a second adapter.
30. Способ по п. 29, характеризующийся тем, что амплификацию выбирают из ПЦР и амплификации по принципу катящегося кольца (RCA).30. The method according to claim 29, characterized in that the amplification is selected from PCR and rolling ring amplification (RCA).
31. Способ по п. 29, характеризующийся тем, что амплификация включает приведение кольцевых нуклеиновых кислот в контакт с полимеразой, которая образует линейный продукт при контакте с остатком урацила в матрице.31. The method of claim 29, wherein the amplification comprises contacting the circular nucleic acids with a polymerase that forms a linear product upon contact with a uracil residue in the matrix.
32. Способ по любому из пп. 23-31, характеризующийся тем, что дефосфорилирование 5'-конца одноцепочечных нуклеиновых кислот включает приведение одноцепочечных нуклеиновых кислот в контакт с фосфатазой.32. The method according to any one of paragraphs. 23-31, characterized in that dephosphorylation of the 5' end of single-stranded nucleic acids involves bringing the single-stranded nucleic acids into contact with a phosphatase.
33. Способ по любому из пп. 1-32, характеризующийся тем, что этапы (b) - (е) выполняют в едином реакционном объеме.33. The method according to any one of paragraphs. 1-32, characterized in that steps (b) - (e) are performed in a single reaction volume.
34. Способ по любому из пп. 1-33, характеризующийся тем, что этапы (b) - (е) выполняют в единственном реакционном сосуде.34. The method according to any one of paragraphs. 1-33, characterized in that steps (b) - (e) are performed in a single reaction vessel.
35. Способ по любому из пп. 1-34, характеризующийся тем, что первый адаптер и/или второй адаптер содержат сайт связывания праймера для секвенирования.35. The method according to any one of paragraphs. 1-34, characterized in that the first adapter and/or the second adapter contain a primer binding site for sequencing.
36. Способ по п. 35, характеризующийся тем, что первый адаптер содержит последовательность Р7, последовательность Р5 или их комплемент или обратный комплемент.36. The method according to claim 35, characterized in that the first adapter contains a P7 sequence, a P5 sequence, or their complement or reverse complement.
37. Способ по п. 35, характеризующийся тем, что второй адаптер содержит последовательность Р7, последовательность Р5 или их комплемент или обратный комплемент.37. The method according to claim 35, characterized in that the second adapter contains a P7 sequence, a P5 sequence, or their complement or reverse complement.
38. Способ по любому из пп. 1-37, характеризующийся тем, что первый адаптер и/или второй адаптер содержат индекс адаптера.38. The method according to any one of paragraphs. 1-37, characterized in that the first adapter and/or the second adapter contains an adapter index.
39. Способ по п. 38, характеризующийся тем, что индекс первого адаптера отличается от индекса второго адаптера.39. The method of claim. 38, characterized in that the index of the first adapter is different from the index of the second adapter.
40. Способ по п. 38 или 39, характеризующийся тем, что индекс адаптера указывает на источник множества нуклеиновых кислот.40. The method according to claim 38 or 39, characterized in that the adapter index indicates the source of the plurality of nucleic acids.
41. Способ по любому из пп. 1-40, характеризующийся тем, что блокирующая группа содержит 3'-спейсер С3 или дидезоксинуклеотид.41. The method according to any one of paragraphs. 1-40, characterized in that the blocking group contains a 3'-spacer C3 or dideoxynucleotide.
42. Способ по любому из пп. 1-41, характеризующийся тем, что лигаза содержит лигазу одноцепочечных нуклеиновых кислот.42. The method according to any one of paragraphs. 1-41, characterized in that the ligase contains a ligase of single-stranded nucleic acids.
43. Способ по любому из пп. 1-42, характеризующийся тем, что лигирование первого адаптера и/или лигирование второго адаптера выполняют в присутствии агента, вызывающего эффект исключения объема.43. The method according to any one of paragraphs. 1-42, characterized in that the ligation of the first adapter and/or the ligation of the second adapter is performed in the presence of an agent that causes a volume exclusion effect.
44. Способ по п. 43, характеризующийся тем, что агент, вызывающий эффект исключения объема, выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), декстрана, гидроксиэтилкрахмала, фиколла и поливинилпирролидона.44. The method of claim 43, wherein the volume exclusion agent is selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), dextran, hydroxyethyl starch, ficoll, and polyvinylpyrrolidone.
45. Способ по п. 43, характеризующийся тем, что первый этап лигирования и/или второй этап лигирования выполняют в реакционном объеме, содержащем по меньшей мере приблизительно 37% (вес/об.) ПЭГ.45. The method of claim 43, wherein the first ligation step and/or the second ligation step is performed in a reaction volume containing at least about 37% (w/v) PEG.
46. Способ по п. 43, характеризующийся тем, что первый этап лигирования и/или второй этап лигирования выполняют в реакционном объеме, содержащем по меньшей мере приблизительно 60% (вес/об.) ПЭГ.46. The method of claim 43, wherein the first ligation step and/or the second ligation step is performed in a reaction volume containing at least about 60% (w/v) PEG.
47. Способ по любому из пп. 1-46, характеризующийся тем, что множество нуклеиновых кислот содержит РНК.47. The method according to any one of paragraphs. 1-46, characterized in that many nucleic acids contain RNA.
48. Способ по любому из пп. 1-46, характеризующийся тем, что множество нуклеиновых кислот содержит кДНК или геномную ДНК.48. The method according to any one of paragraphs. 1-46, characterized in that the set of nucleic acids contains cDNA or genomic DNA.
49. Способ по любому из пп. 1-48, характеризующийся тем, что средний размер нуклеиновой кислоты из множества нуклеиновых кислот составляет менее приблизительно 200 нуклеотидов.49. The method according to any one of paragraphs. 1-48, characterized in that the average nucleic acid size of the plurality of nucleic acids is less than about 200 nucleotides.
50. Способ по любому из пп. 1-49, характеризующийся тем, что множество нуклеиновых кислот получают из низкокачественного источника нуклеиновых кислот.50. The method according to any one of paragraphs. 1-49, characterized in that a plurality of nucleic acids are obtained from a low quality source of nucleic acids.
51. Способ по п. 50, характеризующийся тем, что множество нуклеиновых кислот получают из фиксированного образца.51. The method according to claim 50, characterized in that a plurality of nucleic acids are obtained from a fixed sample.
52. Способ по любому из пп. 1-51, дополнительно включающий амплификацию библиотеки нуклеиновых кислот.52. The method according to any one of paragraphs. 1-51, further comprising amplifying the nucleic acid library.
53. Способ по любому из пп. 1-52, дополнительно включающий получение данных о последовательности из библиотеки нуклеиновых кислот.53. The method according to any one of paragraphs. 1-52, further comprising obtaining sequence data from a nucleic acid library.
54. Библиотека нуклеиновых кислот, полученная способом по любому из пп. 1-53.54. Library of nucleic acids obtained by the method according to any one of paragraphs. 1-53.
55. Набор, включающий:55. A set including:
первый адаптер, причем 3'-конец указанного первого адаптера содержит блокирующую группу, причем указанный первый адаптер содержит последовательность Р7, последовательность Р5 или их комплемент или обратный комплемент;a first adapter, the 3' end of said first adapter having a blocking group, said first adapter having a P7 sequence, a P5 sequence, or their complement or reverse complement;
ли газу; иwhether gas; And
компонент, выбранный из группы, состоящей из агента, вызывающего эффект исключения объема, киназы, фосфатазы, 5'-фосфат-зависимой экзонуклеазы, 5'-деаденилазы, полимеразы, образующей линейный продукт при контакте с остатком урацила в матрице, урацил-специфического эксцизионного реагента, и второй адаптер, причем указанный второй адаптер содержит последовательность Р7, последовательность Р5 или их комплемент или обратный комплемент.a component selected from the group consisting of a volume exclusion agent, a kinase, a phosphatase, a 5'-phosphate dependent exonuclease, a 5'-deadenylase, a polymerase that forms a linear product upon contact with a uracil residue in the matrix, a uracil-specific excision reagent , and a second adapter, said second adapter comprising a P7 sequence, a P5 sequence, or their complement or reverse complement.
56. Набор по п. 55, характеризующийся тем, что линкер содержит первый и второй адаптеры.56. The set of claim. 55, characterized in that the linker contains the first and second adapters.
57. Реакционный сосуд, содержащий реакционный объем, содержащий:57. Reaction vessel containing a reaction volume containing:
множество нуклеиновых кислот;many nucleic acids;
первый адаптер, причем 3'-конец первого адаптера содержит блокирующую группу;the first adapter, and the 3'-end of the first adapter contains a blocking group;
ли газу; иwhether gas; And
агент, вызывающий эффект исключения объема.an agent that causes a volume exclusion effect.
58. Реакционный сосуд по п. 57, характеризующийся тем, что множество нуклеиновых кислот представляет собой одно цепочечные нуклеиновые кислоты;58. The reaction vessel according to claim 57, characterized in that the plurality of nucleic acids are single-stranded nucleic acids;
59. Реакционный сосуд по п. 58, характеризующийся тем, что первый адаптер лигирован с 3'-концами множества одноцепочечных нуклеиновых кислот, за счет чего образуется множество модифицированных одноцепочечных нуклеиновых кислот.59. The reaction vessel according to claim 58, characterized in that the first adapter is ligated to the 3' ends of a plurality of single-stranded nucleic acids, thereby forming a plurality of modified single-stranded nucleic acids.
60. Реакционный сосуд по п. 59, характеризующийся тем, что нелигированный первый адаптер гибрид изо ван с зондом захвата.60. The reaction vessel according to claim 59, characterized in that the non-ligated first adapter is a hybrid with a capture probe.
61. Реакционный сосуд по п. 60, характеризующийся тем, что зонд захвата содержит последовательность, комплементарную по меньшей мере части первого адаптера.61. The reaction vessel of claim 60, wherein the capture probe contains a sequence that is complementary to at least a portion of the first adapter.
62. Реакционный сосуд по п. 57, характеризующийся тем, что множество нуклеиновых кислот представляет собой двуцепочечные нуклеиновые кислоты, содержащие 3'-выступающие концы.62. The reaction vessel according to claim 57, characterized in that the plurality of nucleic acids are double-stranded nucleic acids containing 3' overhangs.
63. Реакционный сосуд по п. 62, характеризующийся тем, что первый адаптер лигирован с 3'-концами множества двуцепочечных нуклеиновых кислот, содержащих 3'-выступающие концы, за счет чего образуется множество модифицированных двуцепочечных нуклеиновых кислот.63. The reaction vessel of claim 62, wherein the first adapter is ligated to the 3' ends of a plurality of double-stranded nucleic acids containing 3' overhangs, thereby generating a plurality of modified double-stranded nucleic acids.
64. Реакционный сосуд по любому из пп. 57-63, дополнительно содержащий второй адаптер.64. The reaction vessel according to any one of paragraphs. 57-63, further comprising a second adapter.
65. Реакционный сосуд по п. 64, характеризующийся тем, что 5'-конец второго адаптера нефосфорилирован.65. The reaction vessel according to claim 64, characterized in that the 5'-end of the second adapter is unphosphorylated.
66. Реакционный сосуд по любому из пп. 57-65, содержащий дефосфорилирующий агент.66. The reaction vessel according to any one of paragraphs. 57-65 containing a dephosphorylating agent.
67. Реакционный сосуд по п. 66, характеризующийся тем, что дефосфорилирующий агент содержит фосфатазу.67. The reaction vessel according to claim 66, characterized in that the dephosphorylating agent contains a phosphatase.
68. Реакционный сосуд по п. 67, характеризующийся тем, что фосфатаза является инактивированной.68. The reaction vessel according to claim 67, characterized in that the phosphatase is inactivated.
69. Реакционный сосуд по любому из пп. 57-68, характеризующийся тем, что агент, вызывающий эффект исключения объема, выбран из группы, состоящей из полиэтиле нглико ля (ПЭГ), декстрана, гидроксиэтилкрахмала, фиколла и поливинилпирролидона.69. The reaction vessel according to any one of paragraphs. 57-68, characterized in that the volume exclusion agent is selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), dextran, hydroxyethyl starch, ficoll, and polyvinylpyrrolidone.
70. Реакционный сосуд по п. 69, характеризующийся тем, что указанный реакционный объем содержит по меньшей мере приблизительно 37% (вес/об.) ПЭГ.70. The reaction vessel of claim 69, wherein said reaction volume contains at least about 37% (w/v) PEG.
71. Реакционный сосуд по п. 69, характеризующийся тем, что указанный реакционный объем содержит по меньшей мере приблизительно 60% (вес/об.) ПЭГ.71. The reaction vessel of claim 69, wherein said reaction volume contains at least about 60% (w/v) PEG.
72. Реакционный сосуд по любому из пп. 64-71, характеризующийся тем, что первый адаптер и/или второй адаптер содержат сайт связывания праймера для секвенирования.72. The reaction vessel according to any one of paragraphs. 64-71, characterized in that the first adapter and/or the second adapter contain a primer binding site for sequencing.
73. Реакционный сосуд по любому из пп. 64-72, характеризующийся тем, что первый адаптер и/или второй адаптер содержат индекс адаптера.73. The reaction vessel according to any one of paragraphs. 64-72, characterized in that the first adapter and/or the second adapter contains an adapter index.
74. Реакционный сосуд по п. 73, характеризующийся тем, что индекс первого адаптера отличается от индекса второго адаптера.74. The reaction vessel according to claim 73, characterized in that the index of the first adapter is different from the index of the second adapter.
75. Реакционный сосуд по п. 73, характеризующийся тем, что индекс адаптера указывает на источник множества одноцепочечных нуклеиновых кислот.75. The reaction vessel according to claim 73, characterized in that the index of the adapter indicates the source of the plurality of single-stranded nucleic acids.
76. Реакционный сосуд по любому из пп. 57-75, характеризующийся тем, что блокирующая группа содержит 3'-спейсер С3 или дидезоксинуклеотид.76. The reaction vessel according to any one of paragraphs. 57-75, characterized in that the blocking group contains a C3 3'-spacer or dideoxynucleotide.
77. Реакционный сосуд по любому из пп. 57-76, характеризующийся тем, что блокирующая группа содержит 3'-спейсер С3.77. The reaction vessel according to any one of paragraphs. 57-76, characterized in that the blocking group contains a 3'-spacer C3.
78. Реакционный сосуд по любому из пп. 57-77, характеризующийся тем, что лигаза содержит лигазу одноцепочечных нуклеиновых кислот.78. The reaction vessel according to any one of paragraphs. 57-77, characterized in that the ligase contains a ligase of single-stranded nucleic acids.
79. Реакционный сосуд по любому из пп. 57-78, характеризующийся тем, что множество нуклеиновых кислот содержит РНК.79. The reaction vessel according to any one of paragraphs. 57-78, characterized in that many nucleic acids contain RNA.
80. Реакционный сосуд по любому из пп. 57-78, характеризующийся тем, что множество нуклеиновых кислот содержит кДНК или геномную ДНК.80. The reaction vessel according to any one of paragraphs. 57-78, characterized in that the set of nucleic acids contains cDNA or genomic DNA.
81. Реакционный сосуд по любому из пп. 57-80, характеризующийся тем, что множество одноцепочечных нуклеиновых кислот получают из низкокачественного источника нуклеиновых кислот.81. The reaction vessel according to any one of paragraphs. 57-80, characterized in that a plurality of single-stranded nucleic acids are obtained from a low quality source of nucleic acids.
82. Реакционный сосуд по п. 81, характеризующийся тем, что множество нуклеиновых кислот получено из фиксированного образца.82. The reaction vessel according to claim 81, characterized in that a plurality of nucleic acids are obtained from a fixed sample.
83. Проточная ячейка, содержащая реакционный сосуд по любому из пп. 57-82.83. A flow cell containing a reaction vessel according to any one of paragraphs. 57-82.
84. Система, содержащая реакционный сосуд по любому из пп. 57-82, и детектор для получения данных секвенирования.84. A system containing a reaction vessel according to any one of paragraphs. 57-82, and a detector for obtaining sequencing data.