Claims (104)
1. Способ модификации представляющего интерес локуса-мишени, причем способ включает доставку к указанному локусу не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, содержащей эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V и один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, где по меньшей мере один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, являются сконструированными способами инженерии, и эффекторный белок образует комплекс с одним или более компонентами, являющимися нуклеиновыми кислотами, и при связывании указанного комплекса с представляющим интерес локусом-мишенью эффекторный белок индуцирует модификацию представляющего интерес локуса-мишени, где эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V включает C2c1p или C2c3p.1. A method of modifying a target locus of interest, the method comprising delivering to said locus a non-naturally occurring or engineered composition comprising an effector protein of type V CRISPR-Cas loci and one or more nucleic acid components, wherein at least one or more nucleic acid components are engineered, and the effector protein forms a complex with one or more nucleic acid components, and upon binding of said complex to a target locus of interest, the effector protein induces modification of the target locus of interest, where the effector protein of CRISPR-Cas type V loci includes C2c1p or C2c3p.
2. Способ по п.1, где представляющий интерес локус-мишень включает ДНК.2. The method of claim 1, wherein the target locus of interest comprises DNA.
3. Способ по п.1 или 2, где модификация представляющего интерес локуса-мишени включает разрыв цепи.3. The method of claim 1 or 2, wherein the modification of the target locus of interest comprises chain breaking.
4. Способ по пп.1, 2 или 3, где эффекторный белок кодируется локусами CRISPR-Cas подтипа V-B.4. The method according to claim 1, 2 or 3, wherein the effector protein is encoded by CRISPR-Cas subtype V-B loci.
5. Способ по пп.1, 2 или 3, где эффекторный белок включает C2c1p.5. The method of claim 1, 2 or 3, wherein the effector protein comprises C2c1p.
6. Способ по пп.1, 2 или 3, где эффекторный белок кодируется локусами CRISPR-Cas подтипа V-C.6. The method according to claim 1, 2 or 3, wherein the effector protein is encoded by CRISPR-Cas subtype V-C loci.
7. Способ по пп.1, 2 или 3, где эффекторный белок включает C2c3p.7. The method of claim 1, 2 or 3, wherein the effector protein comprises C2c3p.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где представляющий интерес локус-мишень содержится в молекуле ДНК in vitro.8. The method of any one of the preceding claims, wherein the target locus of interest is contained within the DNA molecule in vitro .
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где представляющий интерес локус-мишень содержится в ДНК в клетке.9. The method of any one of the preceding claims, wherein the target locus of interest is contained within the DNA in the cell.
10. Способ по п.9, где клетка включает прокариотическую клетку.10. The method of claim 9 wherein the cell comprises a prokaryotic cell.
11. Способ по п.9, где клетка включает эукариотическую клетку.11. The method of claim 9 wherein the cell comprises a eukaryotic cell.
12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где представляющий интерес локус-мишень включает представляющий интерес геномный локус.12. The method of any one of the preceding claims, wherein the target locus of interest includes a genomic locus of interest.
13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где в комплексе с эффекторным белком компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, способен осуществлять или осуществляет специфическое для последовательности связывание комплекса с последовательностью-мишенью представляющего интерес локуса-мишени.13. The method according to any one of the preceding claims, wherein, in complex with the effector protein, the nucleic acid component(s) is or is capable of performing sequence-specific binding of the complex to the target sequence of the target locus of interest.
14. Способ по любому из предшествующих пунктов, где компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, включает предполагаемую последовательность РНК CRISPR (cr-РНК) и/или предполагаемую последовательность трансактивирующей РНК CRISPR (tracr-РНК).14. The method of any one of the preceding claims, wherein the nucleic acid component(s) comprises a putative CRISPR RNA (cr-RNA) sequence and/or a putative CRISPR transactivating RNA (tracr-RNA) sequence.
15. Способ по любому из пп.1-13, где компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, включает предполагаемую последовательность РНК CRISPR (cr-РНК) и не включает никакую последовательность трансактивирующей РНК CRISPR (tracr-РНК).15. The method of any one of claims 1 to 13, wherein the nucleic acid component(s) comprises a putative CRISPR RNA (cr-RNA) sequence and does not include any CRISPR transactivating RNA (tracr-RNA) sequence.
16. Способ по любому из пп.2-15, где разрыв цепи включает одноцепочечный разрыв цепи.16. The method of any one of claims 2-15, wherein the chain breaking comprises a single strand break.
17. Способ по любому из пп.2-15, где разрыв цепи включает двухцепочечный разрыв цепи.17. The method of any one of claims 2-15, wherein the chain breaking comprises double-strand breaking.
18. Способ по любому из предшествующих пунктов, где эффекторный белок и компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, предоставляются посредством одной или более полинуклеотидных молекул, кодирующих полипептид и/или компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, и где одна или более полинуклеотидных молекул функционально организованы таким образом, чтобы происходила экспрессия полипептидов и/или компонента(ов), являющегося нуклеиновой кислотой.18. The method according to any one of the preceding claims, wherein the effector protein and nucleic acid component(s) are provided by one or more polynucleotide molecules encoding the polypeptide and/or nucleic acid component(s), and wherein the one or more polynucleotide molecules are functionally organized in such a way that expression of the polypeptides and/or the nucleic acid component(s) occurs.
19. Способ по п.18, где одна или более полинуклеотидных молекул содержат один или более регуляторных элементов, функционально организованных таким образом, чтобы происходила экспрессия полипептидов и/или компонента(ов), являющегося нуклеиновой кислотой, необязательно где один или более регуляторных элементов включают индуцибельные промоторы.19. The method according to claim 18, where one or more polynucleotide molecules contain one or more regulatory elements, functionally organized so that the expression of polypeptides and/or component(s) that is a nucleic acid occurs, optionally where one or more regulatory elements include Inducible promoters.
20. Способ по п.18 или 19, где одна или более полинуклеотидных молекул содержатся в одном или более векторах.20. The method according to claim 18 or 19, wherein the one or more polynucleotide molecules are contained in one or more vectors.
21. Способ по любому из пп.18-20, где одна или более полинуклеотидных молекул содержатся в системе доставки, или способ по п.20, где один или более векторов содержатся в системе доставки.21. The method of any one of claims 18-20, wherein one or more polynucleotide molecules are contained in the delivery system, or the method of claim 20, wherein one or more vectors are contained in the delivery system.
22. Способ по любому из предшествующих пунктов, где не встречающуюся в природе или сконструированную способами инженерии композицию доставляют посредством носителя для доставки, включающего липосому(ы), частицу(ы), экзосому(ы), микровезикулу(ы), генную пушку или один или более вирусных векторов.22. The method of any one of the preceding claims, wherein the non-naturally occurring or engineered composition is delivered via a delivery vehicle comprising a liposome(s), particle(s), exosome(s), microvesicle(s), a gene gun, or one or more viral vectors.
23. Не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, имеющая характеристики не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, как определено в любом из предшествующих пунктов23. A non-naturally occurring or engineered composition having the characteristics of a non-naturally occurring or engineered composition as defined in any of the preceding claims.
24. Не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, включающая эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V и один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, где эффекторный белок образует комплекс с одним или более компонентами, являющимися нуклеиновыми кислотами, по меньшей мере один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, являются сконструированными способами инженерии и при связывании указанного комплекса с представляющим интерес локусом-мишенью эффекторный белок индуцирует модификацию представляющего интерес локуса-мишени, где эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V включает C2c1p или C2c3p.24. A non-naturally occurring or engineered composition comprising an effector protein of CRISPR-Cas type V loci and one or more nucleic acid components, wherein the effector protein forms a complex with one or more nucleic acid components, at least one or more nucleic acid components are engineered and upon binding of said complex to a target locus of interest, the effector protein induces modification of the target locus of interest, wherein the effector protein of type V CRISPR-Cas loci includes C2c1p or C2c3p.
25. Композиция по п.24, где представляющий интерес локус-мишень включает ДНК.25. The composition of claim 24, wherein the target locus of interest comprises DNA.
26. Композиция по п.24 или 25, где модификация представляющего интерес локуса-мишени включает разрыв цепи.26. A composition according to claim 24 or 25, wherein the modification of the target locus of interest comprises chain breaking.
27. Композиция по пп.24, 25 или 26, где эффекторный белок кодируется локусами CRISPR-Cas подтипа V-B.27. The composition according to claim 24, 25 or 26, wherein the effector protein is encoded by CRISPR-Cas subtype V-B loci.
28. Композиция по пп.24, 25 или 26, где эффекторный белок включает C2c1p.28. A composition according to claim 24, 25 or 26, wherein the effector protein comprises C2c1p.
29. Композиция по пп.24, 25 или 26, где эффекторный белок кодируется локусами CRISPR-Cas подтипа V-C.29. The composition according to claim 24, 25 or 26, wherein the effector protein is encoded by CRISPR-Cas subtype V-C loci.
30. Композиция по пп.24, 25 или 26, где эффекторный белок включает C2c3p.30. A composition according to claim 24, 25 or 26, wherein the effector protein comprises C2c3p.
31. Композиция по любому из пп.24-30, где представляющий интерес локус-мишень содержится в молекуле ДНК in vitro.31. A composition according to any one of claims 24-30, wherein the target locus of interest is contained within the DNA molecule in vitro .
32. Композиция по любому из пп.24-30, где представляющий интерес локус-мишень содержится в ДНК в клетке.32. A composition according to any one of claims 24-30, wherein the target locus of interest is contained within the DNA in the cell.
33. Композиция по п.32, где клетка включает прокариотическую клетку.33. The composition of claim 32, wherein the cell comprises a prokaryotic cell.
34. Композиция по п.32, где клетка включает эукариотическую клетку.34. The composition of claim 32, wherein the cell comprises a eukaryotic cell.
35. Композиция по любому из пп.24-34, где представляющий интерес локус-мишень включает представляющий интерес геномный локус.35. A composition according to any one of claims 24-34, wherein the target locus of interest comprises a genomic locus of interest.
36. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где в комплексе с эффекторным белком компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, способен осуществлять или осуществляет специфическое для последовательности связывание комплекса с последовательностью-мишенью представляющего интерес локуса-мишени.36. A composition according to any one of the preceding claims, wherein, in complex with the effector protein, the nucleic acid component(s) is capable of, or performs, sequence-specific binding of the complex to the target sequence of the target locus of interest.
37. Композиция по любому из пп.24-36, где компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, включает предполагаемую последовательность РНК CRISPR (cr-РНК) и/или предполагаемую последовательность трансактивирующей РНК CRISPR (tracr-РНК).37. A composition according to any one of claims 24-36, wherein the nucleic acid component(s) comprises a putative CRISPR RNA (cr-RNA) sequence and/or a putative CRISPR transactivating RNA (tracr-RNA) sequence.
38. Композиция по любому из пп.24-36, где компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, включает предполагаемую последовательность РНК CRISPR (cr-РНК) и не включает никакую последовательность трансактивирующей РНК CRISPR (tracr-РНК).38. A composition according to any one of claims 24-36, wherein the nucleic acid component(s) comprises a putative CRISPR RNA (cr-RNA) sequence and does not include any CRISPR transactivating RNA (tracr-RNA) sequence.
39. Композиция по любому из пп.25-38, где разрыв цепи включает одноцепочечный разрыв цепи.39. A composition according to any one of claims 25-38, wherein the chain break comprises a single chain break.
40. Композиция по любому из пп.25-38, где разрыв цепи включает двухцепочечный разрыв цепи.40. A composition according to any one of claims 25-38, wherein the chain break comprises a double-strand break.
41. Композиция по любому из пп.24-40, где эффекторный белок и компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, предоставляются посредством одной или более полинуклеотидных молекул, кодирующих полипептид и/или компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, и где одна или более полинуклеотидных молекул функционально организованы таким образом, чтобы происходила экспрессия полипептидов и/или компонента(ов), являющегося нуклеиновой кислотой.41. The composition of any one of claims 24-40, wherein the effector protein and nucleic acid component(s) are provided by one or more polynucleotide molecules encoding the polypeptide and/or nucleic acid component(s), and wherein one or more polynucleotide molecules are operatively organized such that expression of the polypeptides and/or nucleic acid component(s) occurs.
42. Композиция по п.41, где одна или более полинуклеотидных молекул содержат один или более регуляторных элементов, функционально организованных таким образом, чтобы происходила экспрессия полипептидов и/или компонента(ов), являющегося нуклеиновой кислотой, необязательно где один или более регуляторных элементов включают индуцибельные промоторы.42. The composition according to claim 41, where one or more polynucleotide molecules contain one or more regulatory elements, functionally organized in such a way that the expression of polypeptides and / or component (s) that is a nucleic acid occurs, optionally where one or more regulatory elements include Inducible promoters.
43. Композиция по п.41 или 42, где одна или более полинуклеотидных молекул содержатся в одном или более векторах.43. The composition according to claim 41 or 42, where one or more polynucleotide molecules are contained in one or more vectors.
44. Композиция по любому из пп.41-43, где одна или более полинуклеотидных молекул содержатся в системе доставки, или композиция по п.43, где один или более векторов содержатся в системе доставки.44. The composition according to any one of claims 41-43, where one or more polynucleotide molecules are contained in the delivery system, or the composition according to claim 43, where one or more vectors are contained in the delivery system.
45. Композиция по любому из пп.24-45, где не встречающуюся в природе или сконструированную способами инженерии композицию доставляют посредством носителя для доставки, включающего липосому(ы), частицу(ы), экзосому(ы), микровезикулу(ы), генную пушку или один или более вирусных векторов.45. The composition of any one of claims 24-45, wherein the non-naturally occurring or engineered composition is delivered via a delivery vehicle comprising liposome(s), particle(s), exosome(s), microvesicle(s), gene gun or one or more viral vectors.
46. Векторная система, включающая один или более векторов, причем один или более векторов включают одну или более полинуклеотидных молекул, кодирующих компоненты не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, которая представляет собой композицию, имеющую характеристики, как определено в любом из пп.1-45.46. A vector system comprising one or more vectors, the one or more vectors comprising one or more polynucleotide molecules encoding components of a non-naturally occurring or engineered composition, which is a composition having the characteristics as defined in any of paragraphs. 1-45.
47. Система доставки, один или более векторов или одну или более полинуклеотидных молекул, причем один или более векторов или полипептидных молекул включают одну или более полинуклеотидных молекул, кодирующих компоненты не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, которая представляет собой композицию, имеющую характеристики, как определено в любом из пп.1-45.47. A delivery system, one or more vectors, or one or more polynucleotide molecules, wherein the one or more vectors or polypeptide molecules comprise one or more polynucleotide molecules encoding components of a non-naturally occurring or engineered composition that is a composition having the characteristics , as defined in any one of claims 1-45.
48. Не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, векторная система или система доставки по любому из предшествующих пунктов для применения в терапевтическом способе лечения.48. A non-naturally occurring or engineered composition, vector system or delivery system according to any one of the preceding claims for use in a therapeutic method of treatment.
49. Не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, векторная система или система доставки по п.48, где указанный терапевтический способ лечения включает редактирование гена или генома или генную терапию.49. The non-naturally occurring or engineered composition, vector system, or delivery system of claim 48, wherein said therapeutic treatment comprises gene or genome editing or gene therapy.
50. Эукариотическая клетка, содержащая модифицированный представляющий локус-мишень, где представляющий интерес локус-мишень модифицирован способом или посредством применения композиции по любому из предшествующих пунктов50. A eukaryotic cell comprising a modified target locus of interest, wherein the target locus of interest is modified by the method or use of a composition according to any one of the preceding claims.
51. Эукариотическая клетка по п.50, где модификация представляющего интерес локуса-мишени приводит к:51. The eukaryotic cell of claim 50, wherein the modification of the target locus of interest results in:
эукариотической клетке, имеющий измененную экспрессию по меньшей мере одного продукта гена;a eukaryotic cell having an altered expression of at least one gene product;
эукариотической клетке, имеющей измененную экспрессию по меньшей мере одного продукта гена, где экспрессия по меньшей мере одного продукта гена увеличена;a eukaryotic cell having an altered expression of at least one gene product, wherein the expression of at least one gene product is increased;
эукариотической клетке, имеющей измененную экспрессию по меньшей мере одного продукта гена, где экспрессия по меньшей мере одного продукта гена снижена; илиa eukaryotic cell having an altered expression of at least one gene product, wherein the expression of at least one gene product is reduced; or
эукариотической клетке, имеющей отредактированный геном.eukaryotic cell with an edited genome.
52. Эукариотическая клетка по п.50 или 51, где эукариотическая клетка включает клетку млекопитающего.52. A eukaryotic cell according to claim 50 or 51, wherein the eukaryotic cell includes a mammalian cell.
53. Эукариотическая клетка по п.52, где клетка млекопитающего включает клетку человека.53. The eukaryotic cell of claim 52, wherein the mammalian cell includes a human cell.
54. Не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, векторная система или система доставки по любому из предшествующих пунктов для применения в:54. A non-naturally occurring or engineered composition, vector system or delivery system according to any one of the preceding claims for use in:
сайт-специфическом нокауте гена;site-specific gene knockout;
сайт-специфическом редактировании генома;site-specific genome editing;
специфической для последовательности ДНК-интерференции; илиsequence-specific DNA interference; or
мультиплексной модификации способами инженерии генома.multiplex modification by genome engineering methods.
55. Клеточная линия клетки по любому из пп.50-53 или содержащая клетку по любому из пп.50-53, или их потомство.55. A cell line of a cell according to any one of claims 50-53, or containing a cell according to any one of claims 50-53, or progeny thereof.
56. Многоклеточный организм, содержащий одну или более клеток по любому из пп.50-53.56. A multicellular organism containing one or more cells according to any one of claims 50-53.
57. Модель на растениях или животных, включающая одну или более клеток по любому из пп.50-53.57. A plant or animal model comprising one or more cells according to any one of claims 50-53.
58. Продукт гена из клетки по любому из пп.50-53, или клеточной линии по п.55, или организма по п.56, или модели на растениях или животных по п.57.58. A gene product from a cell according to any one of claims 50-53, or a cell line according to claim 55, or an organism according to claim 56, or a plant or animal model according to claim 57.
59. Продукт гена по п.58, где количество экспрессированного продукта гена превышает или является меньшим, чем количество продукта гена из клетки, не имеющей измененной экспрессии или отредактированного генома.59. The gene product of claim 58, wherein the amount of the expressed gene product is greater than or less than the amount of the gene product from the cell not having the altered expression or the edited genome.
60. Продукт гена по п.58, где продукт гена изменен по сравнению с продуктом гена из клетки, не имеющей измененной экспрессии или отредактированного генома.60. The gene product of claim 58, wherein the gene product is altered from a gene product from a cell not having altered expression or an edited genome.
61. Клетка, измененная в соответствии со способом или модифицированная способами инженерии таким образом, чтобы она содержала или экспрессировала композицию или ее компонент по любому из предшествующих пунктов.61. A cell modified in accordance with the method or modified by engineering methods so that it contains or expresses the composition or its component according to any of the preceding claims.
62. Сконструированная способами инженерии, не встречающаяся в природе система коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных кластерами (CRISPR)-CRISPR-ассоциированного белка (Cas) (CRISPR-Cas), включающая:62. An engineered, non-naturally occurring system of short palindromic repeats regularly arranged in clusters (CRISPR)-CRISPR-associated protein (Cas) (CRISPR-Cas), including:
a. одну или более полинуклеотидных последовательностей CRISPR-Cas типа V, включающих направляющую РНК (гРНК), которая содержит направляющую последовательность, соединенную с последовательностью прямого повтора, где направляющая последовательность способна гибридизоваться с последовательностью-мишенью, или одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих одну или более последовательностей CRISPR-Cas типа V; иa. one or more type V CRISPR-Cas polynucleotide sequences comprising a guide RNA (gRNA) that contains a guide sequence linked to a direct repeat sequence, where the guide sequence is capable of hybridizing to a target sequence, or one or more nucleotide sequences encoding one or more CRISPR-Cas type V sequences; And
b. эффекторный белок C2c1 или C2c3, или одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих эффекторный белок C2c1 или C2c3;b. a C2c1 or C2c3 effector protein, or one or more nucleotide sequences encoding a C2c1 or C2c3 effector protein;
где одна или более направляющих последовательностей гибридизуются с указанной последовательностью-мишенью, указанная последовательность-мишень находится с 3'-стороны от прилегающего к протоспэйсеру мотива (PAM), и указанная направляющая РНК образует комплекс с эффекторным белком C2c1 или C2c3.wherein one or more guide sequences hybridize to said target sequence, said target sequence is 3' to a protospacer adjacent motif (PAM), and said guide RNA is complexed with a C2c1 or C2c3 effector protein.
63. Сконструированная способами инженерии, не встречающаяся в природе векторная система коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных кластерами (CRISPR)-CRISPR-ассоциированного белка (Cas) (CRISPR-Cas), включающая один или более векторов, содержащих:63. An engineered, non-naturally occurring vector system of short palindromic repeats regularly clustered (CRISPR)-CRISPR-associated protein (Cas) (CRISPR-Cas), comprising one or more vectors containing:
a. первый регуляторный элемент, функционально связанный с одной или более нуклеотидными последовательностями, кодирующими одну или более полинуклеотидных последовательностей CRISPR-Cas типа V, включающих направляющую РНК, которая содержит направляющую последовательность, соединенную с последовательностью прямого повтора, где направляющая последовательность способна гибридизоваться с последовательностью-мишенью;a. a first regulatory element operably linked to one or more nucleotide sequences encoding one or more CRISPR-Cas type V polynucleotide sequences comprising a guide RNA that contains a guide sequence linked to a direct repeat sequence, where the guide sequence is capable of hybridizing to a target sequence;
b. второй регуляторный элемент, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей эффекторный белок C2c1 или C2c3;b. a second regulatory element operably linked to a nucleotide sequence encoding a C2c1 or C2c3 effector protein;
где компоненты (a) и (b) находятся на одном и том же или различных векторах системы,where components (a) and (b) are on the same or different system vectors,
где при транскрипции одна или более направляющих последовательностей гибридизуются с указанной последовательностью-мишенью, последовательность-мишень находится с 3'-стороны от прилегающего к протоспэйсеру мотива (PAM), и указанная направляющая РНК образует комплекс с эффекторным белком C2c1 или C2c3.wherein, upon transcription, one or more guide sequences hybridize to said target sequence, the target sequence is 3' to a protospacer adjacent motif (PAM), and said guide RNA is complexed with a C2c1 or C2c3 effector protein.
64. Система по п.62 или 63, где последовательность-мишень находится в клетке.64. The system of claim 62 or 63, wherein the target sequence is in a cage.
65. Система по п.62 или 63, где клетка включает эукариотическую клетку.65. The system of claim 62 or 63, wherein the cell includes a eukaryotic cell.
66. Система по п.62 или 63, где при транскрипции одна или более направляющих последовательностей гибридизуются с последовательностью-мишенью, и направляющая РНК образует комплекс с эффекторным белком C2c1 или C2c3, что вызывает расщепление дистальнее последовательности-мишени.66. The system of claim 62 or 63, wherein upon transcription, one or more guide sequences hybridize to the target sequence and the guide RNA forms a complex with a C2c1 or C2c3 effector protein that causes cleavage distal to the target sequence.
67. Система по п.66, где указанное расщепление образует ступенчатый двухцепочечный разрыв с 5'-выступающим концом из 4 или 5 нуклеотидов.67. The system of claim 66 wherein said cleavage forms a stepped double strand break with a 4 or 5 nucleotide 5' overhang.
68. Система по п.62 или 63, где PAM содержит 5'-тимин-богатый мотив.68. The system of claim 62 or 63, wherein the PAM contains a 5'-thymine-rich motif.
69. Система по п.62 или 63, где эффекторный белок представляет собой эффекторный белок C2c1, полученный из видов бактерий, отобранных из группы, состоящей из Alicyclobacillus acidoterrestris (например, ATCC 49025), Alicyclobacillus contaminans (например, DSM 171975), Desulfovibrio inopinaius (например, DSM 10711), Desulfonatronum ihiodismutans (например, штамм MLF-1), бактерий Opitutaceae TAV5, Tuberibacillus calidus (например, DSM 17572), Bacillus thermoamyiovorans (например, линия B4166), Brevibacillus sp. CF112, Bacillus sp. NSP2.1, Desulfatirhabdium butyrativorans (например, DSM 187134), Alicyclobacillus herbarius (например, DSM 13609), Citrobacier freundii (например, ATCC 8090), Brevibacilius agri (например, BAB-2500), Methylobacterium nodulans (например, ORS 2060).69. The system according to claim 62 or 63, wherein the effector protein is a C2c1 effector protein derived from bacterial species selected from the group consisting of Alicyclobacillus acidoterrestris (e.g. ATCC 49025), Alicyclobacillus contaminans (e.g. DSM 171975), Desulfovibrio inopinaius (e.g. DSM 10711), Desulfonatronum ihiodismutans ( e.g. strain MLF-1), bacteria Opitutaceae TAV5, Tuberibacillus calidus (e.g. DSM 17572), Bacillus thermoamyiovorans (e.g. line B4166), Brevibacillus sp. CF112, Bacillus sp. NSP2.1, Desulfatirhabdium butyrativorans (eg DSM 187134), Alicyclobacillus herbarius (eg DSM 13609), Citrobacier freundii (eg ATCC 8090), Brevibacilius agri (eg BAB-2500), Methylobacterium nodulans (eg ORS 2060).
70. Система по п.69, где PAM-последовательность представляет собой TTN, где N представляет собой A/C/G или T, а эффекторный белок являет собой AacC2c1, или где PAM-последовательность представляет собой TTTV, где V представляет собой A/С или G, а эффекторный белок являет собой AacC2c1.70. The system of claim 69 wherein the PAM sequence is TTN where N is A/C/G or T and the effector protein is AacC2c1 or where the PAM sequence is TTTV where V is A/ C or G, and the effector protein is AacC2c1.
71. Система по п.62 или 63, где эффекторный белок C2c1 или C2c3 содержит один или более сигналов ядерной локализации.71. The system of claim 62 or 63, wherein the C2c1 or C2c3 effector protein contains one or more nuclear localization signals.
72. Система по п.62 или 63, где последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие эффекторный белок C2c1 или C2c3, являются кодон-оптимизированными для экспрессии в эукариотической клетке.72. The system of claim 62 or 63, wherein the nucleic acid sequences encoding the C2c1 or C2c3 effector protein are codon-optimized for expression in a eukaryotic cell.
73. Система по п.62 или 63, где компоненты (a) и (b) или нуклеотидные последовательности расположены на одном векторе.73. The system according to claim 62 or 63, where components (a) and (b) or nucleotide sequences are located on the same vector.
74. Способ получения растения, имеющего модифицированный представляющий интерес признак, кодируемый представляющим интерес геном, причем указанный способ включает приведение клетки растения в контакт с системой по п.62 или 63 или воздействие на клетку растения способом по п.1, тем самым либо модифицируя, либо внося указанный представляющий интерес ген, и регенерацию растения из указанной клетки растения.74. A method of producing a plant having a modified trait of interest encoded by a gene of interest, said method comprising bringing the plant cell into contact with the system of claim 62 or 63 or exposing the plant cell to the method of claim 1, thereby either modifying, or by introducing said gene of interest, and regenerating the plant from said plant cell.
75. Способ идентификации представляющего интерес признака в растении, где указанный представляющий интерес признак кодируется представляющим интерес геном; причем указанный способ включает приведение клетки растения в контакт с системой по п.62 или 63 или воздействие на клетку растения способа по п.1, тем самым идентифицируя представляющий интерес ген.75. A method for identifying a trait of interest in a plant, wherein said trait of interest is encoded by a gene of interest; said method comprising bringing the plant cell into contact with the system of claim 62 or 63 or exposing the plant cell to the method of claim 1, thereby identifying the gene of interest.
76. Способ по п.75, дополнительно включающий внесение идентифицированного представляющего интерес гена в клетку растения, или линию клеток растения, или зародышевую плазму растения, и получение растения из них, в результате чего растение содержит представляющий интерес ген.76. The method of claim 75, further comprising introducing the identified gene of interest into a plant cell, or plant cell line, or plant germplasm, and producing a plant therefrom, whereby the plant contains the gene of interest.
77. Способ по п.76, где растение имеет представляющий интерес признак.77. The method of claim 76, wherein the plant has a trait of interest.
78. Частица, содержащая систему по п.62 или 63.78. Particle containing the system according to item 62 or 63.
79. Частица по п.78, где частица содержит эффекторный белок C2c1 или C2c3 в комплексе с направляющей РНК.79. The particle of claim 78, wherein the particle contains a C2c1 or C2c3 effector protein complexed with a guide RNA.
80. Система или способ по пп.1, 62 или 63, где комплекс, направляющая РНК или белок конъюгированы по меньшей мере с одной сахарной частью, необязательно с N-ацетилгалактозамином (GalNAc), в частности, с трехантенным GalNAc.80. The system or method according to claim 1, 62 or 63, wherein the complex, guide RNA or protein is conjugated to at least one sugar moiety, optionally N-acetylgalactosamine (GalNAc), in particular a three-antennary GalNAc.
81. Сконструированная способами инженерии не встречающаяся в природе композиция, содержащая систему CRISPR-Cas, причем указанная система содержит функциональный эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V и направляющую РНК (гРНК):81. An engineered, non-naturally occurring composition comprising a CRISPR-Cas system, said system comprising a functional CRISPR-Cas type V loci effector protein and a guide RNA (gRNA):
где гРНК содержит нефункциональную мертвую направляющую последовательность;where gRNA contains a non-functional dead guide sequence;
где гРНК способна гибридизоваться с последовательностью-мишенью;where gRNA is able to hybridize with the target sequence;
где система CRISPR-Cas направлена на последовательность-мишень с уменьшенной инсерционно-делеционной активностью, происходящей из нуклеазной активности немутантного эффекторного белка локусов CRISPR-Cas типа V системы; иwhere the CRISPR-Cas system is directed to a target sequence with reduced insertion-deletion activity derived from the nuclease activity of the wild-type effector protein of the CRISPR-Cas type V loci of the system; And
где фунциональный эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V представляет собой C2c1p или C2c3p.where the functional effector protein of CRISPR-Cas type V loci is C2c1p or C2c3p.
82. Способ ингибирования роста клеток, причем способ включает доставку в клетку не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, содержащей функциональный эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V и направляющую РНК (гРНК):82. A method for inhibiting cell growth, the method comprising delivering to a cell a non-naturally occurring or engineered composition containing a functional effector protein of type V CRISPR-Cas loci and a guide RNA (gRNA):
где гРНК способна гибридизоваться с последовательностью ДНК-мишени клетки;where the gRNA is capable of hybridizing with the target DNA sequence of the cell;
где система CRISPR-Cas направлена на последовательность ДНК-мишень с уменьшенной инсерционно-делеционной активностью, происходящей из нуклеазной активности немутантного эффекторного белка локусов CRISPR-Cas типа V системы; иwhere the CRISPR-Cas system is directed to a target DNA sequence with reduced insertion-deletion activity derived from the nuclease activity of the wild-type effector protein of the CRISPR-Cas type V loci of the system; And
где фунциональный эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа V представляет собой C2c1p или C2c3p.where the functional effector protein of CRISPR-Cas type V loci is C2c1p or C2c3p.