Claims (21)
1. Способ получения афлиберцепта, включающий 1. A method for producing aflibercept, comprising
(a) получение осветленного сбора клеток, культивированных в химически определенной среде (ХОС);(a) obtaining a clarified collection of cells cultured in a chemically defined medium (CDM);
(b) связывание афлиберцепта из указанного осветленного сбора со смолой с белком A, причем указанный афлиберцепт включает варианты, которые имеют по меньшей мере один окисленный аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из метионина, триптофана, гистидина, фенилаланина, тирозина и их комбинации;(b) binding aflibercept from said clarified collection to a Protein A resin, wherein said aflibercept includes variants that have at least one oxidized amino acid residue selected from the group consisting of methionine, tryptophan, histidine, phenylalanine, tyrosine, and combinations thereof;
(c) элюирование указанного афлиберцепта со стадии (b) с образованием аффинного элюата, причем указанный элюат имеет первый цвет;(c) eluting said aflibercept from step (b) to form an affinity eluate, said eluate having a first color;
(d) подвергание указанного элюата, содержащего афлиберцепт, колонке для анионообменной хроматографии (AEX); и(d) subjecting said eluate containing aflibercept to an anion exchange chromatography (AEX) column; And
(e) сбор проточной фракции, причем указанная проточная фракция имеет второй цвет, и при этом указанный первый цвет указанного аффинного элюата представляет собой более интенсивный желто-коричневый цвет, чем указанный второй цвет указанной проточной фракции, если концентрации указанного аффинного элюата и проточной фракции белка нормализованы. (e) collecting a flow-through fraction, wherein said flow-through fraction has a second color, and wherein said first color of said affinity eluate is a more intense yellow-brown color than said second color of said flow-through fraction, if the concentrations of said affinity eluate and the protein flow-through fraction are normalized.
2. Способ по п.1, в котором указанные клетки выбраны из группы, состоящей из CHO, NS0, Sp2/0, эмбриональных клеток почки и BHK. 2. The method of claim 1, wherein said cells are selected from the group consisting of CHO, NS0, Sp2/0, fetal kidney cells and BHK.
3. Способ по п.1, в котором указанный окисленный аминокислотный остаток представляет собой гистидин.3. The method of claim 1, wherein said oxidized amino acid residue is histidine.
4. Способ по п.1, в котором указанный окисленный аминокислотный остаток представляет собой триптофан.4. The method of claim 1, wherein said oxidized amino acid residue is tryptophan.
5. Способ получение афлиберцепта из осветленного сбора клетки, культивированной в химически определенной среде (ХОС), включающий 5. A method for obtaining aflibercept from a clarified cell collection cultured in a chemically defined medium (CDM), including
(a) связывание афлиберцепта из указанного осветленного сбора в смоле с белком A;(a) binding aflibercept from said clarified collection in resin to protein A;
(b) элюирование указанного афлиберцепта со стадии (a) с образованием аффинного элюата, причем указанный элюат содержит кислотные формы афлиберцепта;(b) eluting said aflibercept from step (a) to form an affinity eluate, said eluate containing acid forms of aflibercept;
(c) подвергание указанного элюата афлиберцепта колонке для анионообменной (AEX) хроматографии; и(c) subjecting said aflibercept eluate to an anion exchange (AEX) chromatography column; And
(d) сбор одной или более проточных фракций, и при этом процент кислотных форм афлиберцепта в указанном аффинном элюате со стадии (b) превышает процент кислотных форм афлиберцепт в указанных одной или более проточных фракциях со стадии (d), если концентрации белка в указанном аффинном элюате и проточных фракциях нормализованы до 10,0 г/л, и (d) collecting one or more flow-through fractions, and wherein the percentage of aflibercept acid species in said affinity eluate from step (b) exceeds the percentage of aflibercept acid species in said one or more flow-through fractions from step (d), if the protein concentrations in said affinity eluate eluate and flow-through fractions are normalized to 10.0 g/l, and
причем указанные кислотные формы афлиберцепта соответствуют пикам, которые элюируют раньше главного пика в хроматограмме катионообменной хроматографии (CEX) афлиберцепта, при этом хроматограмма сгенерирована с использованием первой подвижной фазы 20 мМ 2-(N-морфолино)этаносульфоновой кислоты (MES), pH 5,7, и второй подвижной фазы 40 мМ фосфата натрия, 100 мМ хлорида натрия pH 9,0 (подвижная фаза B), и при этом хроматограмма сгенерирована с использованием обнаружения при 280 нм.wherein said acidic forms of aflibercept correspond to peaks that elute before the main peak in the cation exchange chromatography (CEX) chromatogram of aflibercept, the chromatogram being generated using a first mobile phase of 20 mM 2-(N-morpholino)ethanosulfonic acid (MES), pH 5.7 , and a second mobile phase of 40 mM sodium phosphate, 100 mM sodium chloride pH 9.0 (mobile phase B), and the chromatogram was generated using detection at 280 nm.
6. Способ по п.5, в котором указанные кислотные формы афлиберцепта содержат афлиберцепт, имеющий по меньшей мере один окисленный аминокислотный остаток, выбранный из В группы, состоящей из метионина, триптофана, гистидина, фенилаланина, тирозина их комбинации.6. The method according to claim 5, wherein said acid forms of aflibercept contain aflibercept having at least one oxidized amino acid residue selected from group B consisting of methionine, tryptophan, histidine, phenylalanine, tyrosine, combinations thereof.
7. Способ по п.5, который дополнительно включает после связывания афлиберцепта из указанного осветленного сбора подвергание афлиберцепта одной или более дополнительным хроматографическим стадиям, выбранным из группы, состоящей из катионообменной хроматографии (CEX), хроматографии с гидрофобным взаимодействием, эксклюзионной хроматографии и их комбинации.7. The method of claim 5, which further comprises, after binding the aflibercept from said clarified harvest, subjecting the aflibercept to one or more additional chromatographic steps selected from the group consisting of cation exchange chromatography (CEX), hydrophobic interaction chromatography, size exclusion chromatography, and combinations thereof.
8. Способ по п.5, в котором указанная клетка выбрана из группы, состоящей из CHO, NSO, Sp2/0, эмбриональных клеток почки и BHK.8. The method of claim 5, wherein said cell is selected from the group consisting of CHO, NSO, Sp2/0, fetal kidney cells and BHK.
9. Способ по п.6, в котором указанная клетка выбрана из группы, состоящей из CHO, NSO, Sp2/0, эмбриональных клеток почки и BHK.9. The method of claim 6, wherein said cell is selected from the group consisting of CHO, NSO, Sp2/0, fetal kidney cells and BHK.
10. Способ по п.6, в котором указанные кислотные формы афлиберцепта содержат афлиберцепт, имеющий по меньшей мере один окисленный аминокислотный остаток триптофана.10. The method of claim 6, wherein said acid forms of aflibercept contain aflibercept having at least one oxidized tryptophan amino acid residue.
11. Способ по п.6, в котором указанные кислотные формы афлиберцепта содержат афлиберцепт, имеющий по меньшей мере один окисленный аминокислотный остаток гистидина.11. The method of claim 6, wherein said acid forms of aflibercept contain aflibercept having at least one oxidized histidine amino acid residue.