RU2022021C1

RU2022021C1 - Method for determining digestibility of proteins

Info

Publication number: RU2022021C1
Authority: RU
Inventors: Игорь Михайлович Савич; Галина Михайловна Жолдаспаева
Original assignee: Казахский научно-исследовательский институт земледелия им.В.Р.Вильямса
Priority date: 1991-09-03
Filing date: 1991-09-03
Publication date: 1994-10-30

Abstract

FIELD: food industry, medical biochemistry, enzymology, agriculture. SUBSTANCE: method involves applying protein preparation to several points on filtering paper strip, treating some of samples with proteolytic ferment (pepsin, papain) and leaving the rest for control; after incubation all samples are colored with amid black 10B, then the protein-colorant complex is eluated, protein content determined in produced colored solutions by spectrophotometric method and digestibility of sample is assessed as a fraction of hydrolyzed protein expressed in percent of initial quantity. EFFECT: higher efficiency. 2 tbl

Description

Изобретение относится к физико-химической биологии и биотехнологии, а именно к биологической химии, молекулярной биологии, биоорганичиеской химии, и может быть использовано научными учреждениями при изучении свойств белков и ферментов. The invention relates to physico-chemical biology and biotechnology, namely to biological chemistry, molecular biology, bioorganic chemistry, and can be used by scientific institutions in the study of the properties of proteins and enzymes.

Известны методы определения переваримости белков, заключающиеся в воздействии протеолитических ферментов на соответствующие белки с последующим определением оставшегося белка в растворах (Axtell et al., 1981; Salgo et al., 1985, Kaczkowski et al., 1985; Bromel-Cox et al, 1990). Known methods for determining the digestibility of proteins, which include the action of proteolytic enzymes on the corresponding proteins, followed by determination of the remaining protein in solutions (Axtell et al., 1981; Salgo et al., 1985, Kaczkowski et al., 1985; Bromel-Cox et al, 1990 )

Однако основным недостатком данных методов является невозможность определения переваримости некоторых труднорастворимых в водных растворах белков типа проламинов и глютелинов зерна злаковых. Последние белки могут находиться в растворенном состоянии только при наличии мочевины, спиртов или детергентов. Однако последние соединения значительно снижают или полностью ингибируют активность протеолитических ферментов, и сведения о переваримости не могут быть получены либо будут искажены. Для устранения этого недостатка предложено тестируемую растительную массу помещать в пакет из фильтрованной бумаги с последующим выдерживанием в растворе фермента (Похиленко, 1985; Левицкий А.П., Похиленко Л.И., 1987). Данный способ, зарегистрированный как изобретение (авт.св. N 1247750) и выбранный в качестве прототипа, обладает рядом существенных недостатков. Во-первых, анализ довольно длителен, и только процедура ферментативной обработки занимает 15-24 ч. Во-вторых, с помощью данного способа невозможно определить переваримость водорастворимых белков. В-третьих, ферментативному гидролизу подвергаются все белки, которые имеются в зерне, и судить о переваримости отдельных белков не представляется возможным. В-четвертых, способом не предусмотрено изучение денатурированных белков. However, the main drawback of these methods is the impossibility of determining the digestibility of some proteins, such as prolamins and glutelins of cereal grains, which are hardly soluble in aqueous solutions. The latter proteins can be in a dissolved state only in the presence of urea, alcohols or detergents. However, the latter compounds significantly reduce or completely inhibit the activity of proteolytic enzymes, and information about digestibility cannot be obtained or will be distorted. To eliminate this drawback, it was proposed to place the tested plant mass in a bag of filtered paper with subsequent aging in an enzyme solution (Pohilenko, 1985; Levitsky A.P., Pohilenko L.I., 1987). This method, registered as an invention (ed. St. N 1247750) and selected as a prototype, has several significant drawbacks. Firstly, the analysis is quite lengthy, and only the enzymatic processing procedure takes 15-24 hours. Secondly, using this method it is impossible to determine the digestibility of water-soluble proteins. Thirdly, all proteins that are in the grain undergo enzymatic hydrolysis, and it is not possible to judge the digestibility of individual proteins. Fourth, the method does not provide for the study of denatured proteins.

Целью изобретения является ускорение диагностики и повышение эффективности при определении переваримости белков. The aim of the invention is to accelerate the diagnosis and increase efficiency in determining the digestibility of proteins.

Это достигается тем, что анализируемые белки или их смесь наносят на фильтровальную бумагу, фиксируют (денатурируют) с помощью высокой температуры до или после ферментативной обработки, а затем на участки, содержащие белок, наносят раствор фермента и после инкубирования в течение требуемого времени (не более 2 ч) определяют оставшийся связанный белок. This is achieved by the fact that the analyzed proteins or their mixture is applied to filter paper, fixed (denatured) using high temperature before or after enzymatic treatment, and then the enzyme solution is applied to the areas containing protein and after incubation for the required time (no more 2 h) determine the remaining bound protein.

Существенный признак прототипа, общий для него и заявляемого объекта исследования, обработка препаратов белков раcтвором фермента. An essential feature of the prototype, common to it and the claimed research object, is the processing of protein preparations with an enzyme solution.

Предлагаемый cпоcоб отличаетcя от прототипа следующим:
анализируют как водорастворимые, так и нерастворимые в воде белки,
позволяет исследовать как нативные, так и денатурированные белки,
препараты белков наносят на фильтровальную бумагу,
расход белка оценивают по связыванию его с красителем.The proposed method differs from the prototype in the following:
analyze both water-soluble and water-insoluble proteins,
allows you to explore both native and denatured proteins,
protein preparations are applied to filter paper,
protein consumption is estimated by binding it to a dye.

П р и м е р 1. По 10 мг коммерческих белков человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) и ингибитора трипсина из сои растворяют отдельно в 2 мл дистиллированной воды. На полоски фильтровальной бумаги шириной 2-3 см наносят по 5 мкл каждого белка в восьмикратной повторности и помещают в термостат на 15 мин при температуре 110^оС. Затем полоски бумаги промывают в течение 5 мин в 5%-ном растворе уксусной кислоты, слегка подсушивают и наносят по 5 мкл 0,025%-ного раствора пепсина, приготовленного на 5%-ной уксусной кислоте, на четыре участка, содержащие белок (опытные образцы). Другие четыре участка с белком на фильтровальной бумаге оставляют для контроля. Полоски бумаги помещают над раствором 5%-ной уксусной кислоты в эксикатор на 2 ч при температуре 37^оС. Затем окрашивают на белок в течение 20 мин с помощью 1%-ного раствора амидочерного 10Б, приготовленного на смеси этанол - трихлоруксусная кислота - вода, взятых в соотношении 8:1:1. Избыток красителя удаляют промывкой 7%-ным раствором уксусной кислоты и высушивают бумагу под феном. Окрашенные кружки фильтровальной бумаги с белком, обработанные пепсином, и контрольные образцы вырезают и помещают в пробирки, содержащие по 2 мл 0,1 М раствора NаОН и экстрагируют краситель при встряхивании в течение 1 ч. Оптическую плотность окрашенных растворов измеряют на спектрофотометре при длине волны 620 нм, и содержание белка в каждом образце рассчитывают по калибровочной кривой, построенной на различных разведениях ЧСА (от 5 до 50 мкг белка на 5 мкл раствора). Для определения переваримости находят среднее содержание из четырех параллельных контрольного образца ЧСА, равное 14,84 мкг белка. Из полученного значения вычитают среднее содержание четырех параллельных опытного образца, подвергавшегося действию пепсина и равное 4,87 мкг белка. Полученную разницу (9,97 мкг) делят на значение контрольного образца и умножают на 100%. Переваримость ЧСА пепсином равна 67,2% . Аналогичным образом находят переваримость ингибитора трипсина из сои, которая равна 53,2%. В общем виде расчет переваримости можно представить в виде следующей формулы:

100% , где А_контр и А_опыт - содержание белка в контрольных и опытных образцах.EXAMPLE 1. 10 mg of commercial proteins of human serum albumin (HSA) and soybean trypsin inhibitor are dissolved separately in 2 ml of distilled water. On filter paper strips 2-3 cm in width is applied on 5 l of each protein in repetition eight times, and placed in thermostat for 15 min at 110 ^C. Then, a strip of paper was washed for 5 minutes in 5% acetic acid solution, slightly dried and 5 μl of a 0.025% pepsin solution prepared on 5% acetic acid are applied to four sections containing protein (test samples). The other four areas with protein on filter paper are left for control. Paper strips were placed on a solution of 5% acetic acid in a desiccator for 2 hours at ³⁷ ° C. Then stained for protein for 20 minutes with a 1% solution amidochernogo 10B prepared in a mixture of ethanol - Trichloroacetic acid - water, taken in a ratio of 8: 1: 1. Excess dye is removed by washing with a 7% solution of acetic acid and the paper is dried under a hairdryer. Pepsin-treated colored circles of filter paper with protein and control samples were cut out and placed in test tubes containing 2 ml of 0.1 M NaOH solution and the dye was extracted with shaking for 1 h. The optical density of the colored solutions was measured on a spectrophotometer at a wavelength of 620 nm, and the protein content in each sample is calculated by a calibration curve built on various dilutions of HSA (from 5 to 50 μg of protein per 5 μl of solution). To determine digestibility, the average content of four parallel control HSA samples is found to be 14.84 μg of protein. From the obtained value, the average content of four parallel test samples subjected to pepsin and equal to 4.87 μg of protein is subtracted. The resulting difference (9.97 μg) is divided by the value of the control sample and multiplied by 100%. The digestibility of HSA with pepsin is 67.2%. The digestibility of a trypsin inhibitor from soy, which is equal to 53.2%, is likewise found. In general, the digestibility calculation can be represented as the following formula:

100%, where A and A _counter _experience - the protein content in control and test samples.

П р и м е р 2. Зерна кукурузы и сорго (у кукурузы предварительно удаляют зародыш) размалывают до тонкого порошка, отвешивают по 600 мг каждого образца в центрифужные пробирки, приливают по 1,2 мл 1 М раствора NaCl и ставят в холодильник на 1 ч с периодическим перемешиванием каждые 15 мин. Затем центрифугируют при 7000 g в течение 15 мин. Раствор, содержащий альбумины и глобулины собирают и операцию по извлечению этих белков повторяют еще три раза. Затем осадок муки промывают 5 мл дистиллированной воды два раза для удаления соли и после центрифугирования приливают по 1,2 л 65%-ного или 70%-ного изопропанола для кукурузы или сорго соответственно. После перемешивания пробирки закрывают пробками и ставят на водяную баню на 1 ч при температуре 60^оС. Центрифугируют при 7000g в течение 15 мин и собирают раствор проламинов. Затем операцию по извлечению данных белков повторяют еще три раза. После этого к осадку муки приливают 5 мл дистиллированной воды, перемешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость отбра- сывают, а осадок заливают 1,2 мл 0,1 М раствора NaOH и экстрагируют глютелины в течение 1 ч при комнатной температуре, перемешивая каждые 15 мин. Центрифугируют при 7000g в течение 15 мин и надосадочную жидкость собирают.PRI me R 2. Grains of corn and sorghum (the corn is first removed the germ) is ground to a fine powder, weighed 600 mg of each sample in centrifuge tubes, pour 1.2 ml of 1 M NaCl solution and put in a refrigerator for 1 h with periodic stirring every 15 minutes Then centrifuged at 7000 g for 15 minutes A solution containing albumin and globulins is collected and the operation to extract these proteins is repeated three more times. Then, the flour cake is washed with 5 ml of distilled water twice to remove salt, and after centrifugation, 1.2 liters of 65% or 70% isopropanol are added for corn or sorghum, respectively. After stirring vials are stoppered and put in a water bath for 1 h at 60 ^C. Centrifuge at 7000g for 15 minutes and collected prolamine solution. Then the operation to extract these proteins is repeated three more times. After that, 5 ml of distilled water is added to the flour precipitate, mixed and centrifuged. The supernatant was discarded and 1.2 ml of a 0.1 M NaOH solution was added and the glutelins were extracted for 1 h at room temperature, stirring every 15 minutes. Centrifuge at 7000g for 15 minutes and collect the supernatant.

Выделенные фракции белков наносят на полоски фильтровальной бумаги по 5 мкл в восьмикратной повторности. Дальнейшая процедура по определению переваримости белков с помощью пепсина совпадает с описанной в примере 1. Отношение фермент : субстрат 1 : 20. Переваримость белков из зерна кукурузы и сорго представлена в табл.1. The separated fractions of proteins are applied to the filter paper strips of 5 μl in eight-fold repetition. The further procedure for determining the digestibility of proteins using pepsin is the same as described in Example 1. The ratio of enzyme: substrate is 1: 20. The digestibility of proteins from corn and sorghum is presented in Table 1.

П р и ме р 3. Белки (альбумины - глобулины, проламины, глютелины) из зерен кукурузы и сорго выделяют, как описано в примере 2. Затем белки наносят по 5 мкл на фильтровальную бумагу в восьмикратной повторности и помещают в термостат на 15 мин при температуре 110^оС. После этого полоски бумаги выдерживают в течение 5 мин в 0,2 М растворе уксуснокислого натрия, доведенного до рН 6,5 с помощью уксусной кислоты, слегка подсушивают и наносят по 3-6 мкл 0,025%-ного раствора папаина, приготовленного на 0,2 М растворе уксуснокислого натрия и содержащего 1% 3-меркапто-1,2-пропандиола на четыре участка с белком (опытные образцы, соотношение фермент : субстрат 1 : 20). Другие четыре участка с белками на фильтровальной бумаге оставляют для контроля. Полоски бумаги помещают над 0,2 М раствором уксуснокислого натрия рН 6,5 в эксикатор на 2 ч при температуре 37^оС. Дальнейшая процедура по окрашиванию белков красителем и определению переваримости совпадает с описанной в примере 1. Данные о перева- римости белковых фракций зерна с помощью папаина представлены в табл.1.Example 3. Proteins (albumin — globulins, prolamins, glutelins) from corn and sorghum grains were isolated as described in Example 2. Then, the proteins were applied 5 μl onto filter paper in eight-fold repetition and placed in a thermostat for 15 min at temperature of 110 ^C. Thereafter, the strip of paper is kept for five minutes in a 0.2M sodium acetate solution adjusted to pH 6.5 with acetic acid, and slightly dried coated 3-6 l 0.025% solution of papain solution, prepared on a 0.2 M sodium acetate solution and containing 1% 3-mercapto-1,2 -propanediol in four sections with protein (experimental samples, the ratio of the enzyme: substrate 1: 20). The other four sites with proteins on filter paper are left for control. Strips of paper placed over 0.2 M solution of sodium acetate pH 6.5 in a desiccator for 2 hours at ³⁷ ° C. The subsequent procedure by staining dye and protein digestibility determination coincides with that described in Example 1. Data on grain digestibility of protein fractions using papain are presented in table 1.

П р и м е р 4. Белки (альбумины-глобулины, проламины и глютелины) выделяют, как описано в примере 2. Затем белки наносят на фильтровальную бумагу по 5 мкл в восьмикратной повторности, слегка подсушивают и на каждый участок добавляют по 10-15 мкл 5%-ного раствора уксусной кислоты. Затем на четыре опытных участка, содержащих белок, капают по 5-10 мкл 0,025%-ного раствора пепсина, приготовленного на 5%-ной уксусной кислоте (соотношение фермент : субстрат 1 : 20), а другие четыре участка оставляют для контроля. Полоски фильтровальной бумаги помещают над раствором 5%-ной уксусной кислоты в эксикатор на 2 ч при температуре 37^оС. Затем выдерживают в термостате в течение 15 мин при 110^оС и определяют содержание белка в пробах с помощью амидочерного 10 Б, как описано в примере 1. Данные по переваримости неденатурированных белков представлены в табл.2.Example 4. Proteins (albumin globulins, prolamins and glutelins) are isolated as described in Example 2. Then, the proteins are applied to filter paper 5 μl in eight-fold repetition, slightly dried, and 10-15 are added to each section. μl of a 5% solution of acetic acid. Then, 5-10 μl of a 0.025% solution of pepsin prepared on 5% acetic acid (enzyme: substrate ratio of 1: 20) is dripped into four experimental sections containing protein, and the other four sections are left for control. Strips of filter paper was placed over the solution of 5% acetic acid in a desiccator for 2 hours at ³⁷ ° C. Then incubated for 15 minutes at ¹¹⁰ ° C and the protein content in the samples using amidochernogo 10 B, as described in example 1. Data on the digestibility of undenatured proteins are presented in table.2.

П р и м е р 5. Белки выделяют и наносят на фильтровальную бумагу, как описано в примере 2. Бумагу слегка подсушивают и на каждый участок, содержащий белок, наносят по 10-15 мкл 0,2 М раствора уксуснокислого натрия, рН 6,5. Затем на четыре участка (опытные образцы) добавляют по 5-10 мкл 0,025% -ного раствора папаина, приготовленного на буфере, состав которого описан в примере 3 (соотношение фермент : субстрат 1 : 20), а четыре другие участка оставляют для контроля. Полоски фильтро- вальной бумаги помещают над 0,2 М раствором уксуснокислого натрия, рН 6,5 в эксикатор на 2 ч при температуре 37^оС. Дальнейшая процедура совпадает с описанной в примере 4. Данные по переваримости неденатурированных белков представлены в табл.2.PRI me R 5. Proteins are isolated and applied to filter paper, as described in example 2. The paper is slightly dried and 10-15 μl of 0.2 M sodium acetate solution, pH 6, is applied to each area containing protein. 5. Then, 5-10 μl of a 0.025% papain solution prepared on a buffer, the composition of which is described in Example 3 (ratio of enzyme: substrate 1: 20), is added to four sections (test samples), and four other sections are left for control. Strips FILTER Valnju paper placed over 0.2 M sodium acetate, pH 6.5 in a desiccator for 2 hours at ³⁷ ° C. The subsequent procedure the same as described in Example 4. Data on digestibility undenatured proteins are presented in Table 2.

Использование предлагаемого способа определения переваримости белков по сравнению с известным имеет следующие преимущества:
сокращает время анализа в 2-3 раза и более;
позволяет определять переваримость индивидуальных белков, как водорастворимых, так и не растворимых в водных растворах;
дает возможность проводить сравнительный анализ переваримости денатурированных белков и белков в нативном состоянии;
можно определять переваримость микрограммовых количеств белка.Using the proposed method for determining the digestibility of proteins compared with the known has the following advantages:
reduces analysis time by 2-3 times or more;
allows you to determine the digestibility of individual proteins, both water-soluble and insoluble in aqueous solutions;
makes it possible to conduct a comparative analysis of the digestibility of denatured proteins and proteins in their native state;
the digestibility of microgram amounts of protein can be determined.

Claims

METHOD FOR DETERMINING PROTEIN digestibility, including processing protein preparations deposited on a filter paper matrix with a proteolytic enzyme and evaluating the efficiency of proteolysis by substrate loss in the reaction zone, characterized in that the test and untreated enzyme control samples are stained after incubation, then the dye is eluted, and the dye is eluted, determined the optical density of the resulting solutions and the protein content in them, and protein digestibility is calculated by the formula

100%
where A _about and A _to - the protein content in the experimental and control samples, respectively.