Claims (128)
1. Способ культивирования клеток-мишеней, который включает инкубацию композиции, содержащей клетки-мишени, в присутствии рецепторсвязывающего средства, где рецепторсвязывающее средство i) обратимо связывают с реактивом, содержащим множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию с рецепторсвязывающим средством; и ii) специфически связывается с молекулой на поверхности клеток-мишеней, отличной от CD28, CD3 или CD40, таким образом, который индуцирует или модулирует сигнал в клетках-мишенях и/или изменяет функцию клеток-мишеней, тем самым создавая культивируемые клетки-мишени.1. A method of culturing target cells, which includes incubation of a composition containing target cells in the presence of a receptor-binding agent, where the receptor-binding agent i) is reversibly associated with a reagent containing a plurality of binding sites capable of reversibly binding to the receptor-binding agent; and ii) binds specifically to a molecule on the surface of target cells other than CD28, CD3, or CD40 in a manner that induces or modulates a signal in target cells and/or alters target cell function, thereby creating cultured target cells.
2. Способ по п. 1, в котором молекула не представляет собой CD137.2. The method of claim 1 wherein the molecule is not CD137.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором сигнал не представляет собой ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал.3. The method of claim 1 or 2, wherein the signal is not a TCR/CD3 complex-associated signal.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором молекула представляет собой костимулирующую молекулу, вспомогательную молекулу, цитокиновый рецептор, хемокиновый рецептор, молекулу иммунной контрольной точки, молекулу адгезии, элемент семейства TNF или семейства рецепторов TNF и/или рецептор или корецептор Wnt. 4. The method according to any one of paragraphs. 1-3, wherein the molecule is a co-stimulatory molecule, an accessory molecule, a cytokine receptor, a chemokine receptor, an immune checkpoint molecule, an adhesion molecule, a member of the TNF family or the TNF receptor family, and/or a Wnt receptor or co-receptor.
5. Способ по любому из пп. 1, 3 и 4, в котором5. The method according to any one of paragraphs. 1, 3 and 4, in which
молекулу выбирают из CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 и HVEM.the molecule is selected from CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 and HVEM.
6. Способ по любому из пп. 1 и 3-5, в котором молекулу выбирают из CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB) и CD154 (CD40L).6. The method according to any one of paragraphs. 1 and 3-5, wherein the molecule is selected from CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB) and CD154 (CD40L).
7. Способ по любому из пп. 1-4, в котором молекула представляет собой цитокиновый рецептор, выбранный из IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-γR, TNF-αR, IL-4R, IL-10R, IFNR I типа, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 и TNFR2.7. The method according to any one of paragraphs. 1-4, wherein the molecule is a cytokine receptor selected from IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-γR, TNF-αR, IL-4R, IL-10R, type I IFNR, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 and TNFR2.
8. Способ по любому из пп. 1-4 и 7, в котором8. The method according to any one of paragraphs. 1-4 and 7, in which
рецепторсвязывающее средство представляет собой IL-2, IL-1, IL-15, IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17 или TNF, или представляет собой его биологически активный фрагмент.the receptor binding agent is or is IL-2, IL-1, IL-15, IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17 or TNF biologically active fragment.
9. Способ по любому из пп. 1-4, 7 и 8, в котором молекула представляет собой цитокиновый рецептор, выбранный из IL-12R, IFN-γR, IL-4R и IL-17R.9. The method according to any one of paragraphs. 1-4, 7 and 8, wherein the molecule is a cytokine receptor selected from IL-12R, IFN-γR, IL-4R and IL-17R.
10. Способ по любому из пп. 1-4 и 7-9, в котором рецепторсвязывающее средство представляет собой IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-15 или IL-17, или представляет собой его биологически активный фрагмент.10. The method according to any one of paragraphs. 1-4 and 7-9, wherein the receptor-binding agent is IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-15, or IL-17, or a biologically active fragment thereof.
11. Способ по любому из пп. 1-4, в котором молекула представляет собой цитокиновый рецептор, выбранный из IL-7R, IL-21R и CD132 (общая γ цепь IL рецептора).11. The method according to any one of paragraphs. 1-4, wherein the molecule is a cytokine receptor selected from IL-7R, IL-21R and CD132 (common IL γ chain receptor).
12. Способ по любому из пп. 7-11, в котором12. The method according to any one of paragraphs. 7-11, in which
рецепторсвязывающее средство представляет собой лиганд, который специфически связывается с цитокиновым рецептором.a receptor binding agent is a ligand that specifically binds to a cytokine receptor.
13. Способ по любому из 1-4, 11 и 12, в котором рецепторсвязывающее средство представляет собойIL-7, IL-21, IL-2, IL-4, IL-9 и IL-15, или представляет собой его биологически активный фрагмент.13. The method of any one of 1-4, 11 and 12 wherein the receptor binding agent is IL-7, IL-21, IL-2, IL-4, IL-9 and IL-15, or is a biologically active fragment thereof .
14. Способ по любому из пп. 1-4, в котором молекула представляет собой хемокиновый рецептор, выбранный из CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 и CXCR4.14. The method according to any one of paragraphs. 1-4, wherein the molecule is a chemokine receptor selected from CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 and CXCR4.
15. Способ по любому из пп. 1-4, в котором15. The method according to any one of paragraphs. 1-4, in which
рецепторсвязывающее средство представляет собой лиганд, который специфически связывается с цитокиновым рецептором. a receptor binding agent is a ligand that specifically binds to a cytokine receptor.
16. Способ по любому из пп. 1-4, 14 и 15, в котором рецепторсвязывающее средство представляет собой CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 и CCL25, или представляет собой его биологически активный фрагмент.16. The method according to any one of paragraphs. 1-4, 14 and 15, in which the receptor-binding agent is CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 and CCL25, or is a biologically active fragment thereof.
17. Способ по любому из пп. 1-4 и 14-16, в котором молекула представляет собой хемокиновый рецептор, выбранный из CXCR3, CCR7, CXCR1 и CXCR4.17. The method according to any one of paragraphs. 1-4 and 14-16, wherein the molecule is a chemokine receptor selected from CXCR3, CCR7, CXCR1 and CXCR4.
18. Способ по любому из пп. 1-4 и 14-17, в котором рецепторсвязывающее средство представляет собой CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 и CCL25, или представляет собой его биологически активный фрагмент.18. The method according to any one of paragraphs. 1-4 and 14-17, wherein the receptor-binding agent is CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 and CCL25, or is a biologically active fragment thereof.
19. Способ по любому из пп. 1-4, в котором молекулу адгезии выбирают из CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-селектин) и CD29/CD49d (VLA-4) и CD106 (VCAM-1).19. The method according to any one of paragraphs. 1-4 wherein the adhesion molecule is selected from CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-selectin) and CD29/CD49d (VLA-4) and CD106 ( VCAM-1).
20. Способ по любому из пп. 1-4 и 19, в котором молекулу адгезии выбирают из LFA-1, L-селектина, VCAM-1 и VLA-4 или она представляет собой биологически активный фрагмент этого.20. The method according to any one of paragraphs. 1-4 and 19, in which the adhesion molecule is selected from LFA-1, L-selectin, VCAM-1 and VLA-4 or it is a biologically active fragment of this.
21. Способ по любому из пп. 1-4, в котором рецепторсвязывающее средство представляет собой фактор, который индуцирует продуцирование цитокинов, продуцирование хемокинов или экспрессию молекулы адгезии.21. The method according to any one of paragraphs. 1-4, wherein the receptor binding agent is a factor that induces cytokine production, chemokine production, or expression of an adhesion molecule.
22. Способ по п. 21, в котором фактор представляет собой ядерный фактор.22. The method of claim 21 wherein the factor is a nuclear factor.
23. Способ по п. 21 или 22, в котором фактор представляет собой связанный с рецептором ретиноевой кислоты сиротский рецептор γ (RORγ) или RORα.23. The method of claim 21 or 22, wherein the factor is retinoic acid receptor-coupled orphan receptor γ (RORγ) or RORα.
24. Способ по любому из пп. 1-23, в котором рецепторсвязывающее средство представляет собой первое рецепторсвязывающее средство и молекула представляет собой первую молекулу, и инкубацию дополнительно осуществляют в присутствии второго рецепторсвязывающего средства, которое специфически связывается со второй молекулой на поверхности одной или нескольких клеток-мишеней.24. The method according to any one of paragraphs. 1-23, wherein the receptor binder is the first receptor binder and the molecule is the first molecule, and the incubation is further carried out in the presence of a second receptor binder that specifically binds to the second molecule on the surface of one or more target cells.
25. Способ по п. 24, в котором:25. The method according to claim 24, in which:
второе рецепторсвязывающее средство обратимо связывают с реактивом, указанный реактив содержит множество сайтов связывания для первого рецепторсвязывающего средства и второго рецепторсвязывающего средства. илиthe second receptor-binding agent is reversibly associated with the reagent, said reagent contains a plurality of binding sites for the first receptor-binding agent and the second receptor-binding agent. or
первое рецепторсвязывающее средство обратимо связывают со вторым реактивом, содержащим множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию с первым рецепторсвязывающим средством.the first receptor-binding agent is reversibly associated with a second reagent containing a plurality of binding sites capable of reversibly binding to the first receptor-binding agent.
26. Способ по п. 24 или 25, в котором сигнал представляет собой первый сигнал, и второе рецепторсвязывающее средство специфически связывается со второй молекулой таким образом, чтобы индуцировать второй сигнал в одной или более клеток-мишеней.26. The method of claim 24 or 25, wherein the signal is a first signal and the second receptor binding agent specifically binds to the second molecule so as to induce the second signal in one or more target cells.
27. Способ по п. 26, в котором27. The method according to p. 26, in which
второй сигнал представляет собой ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал.the second signal is a TCR/CD3 complex-associated signal.
28. Способ по любому из пп. 24-27, в котором вторая молекула являлась элемент комплекса TCR/CD3.28. The method according to any one of paragraphs. 24-27, in which the second molecule was an element of the TCR/CD3 complex.
29. Способ по любому из пп. 24-28, в котором вторая молекула представляет собой CD3.29. The method according to any one of paragraphs. 24-28, in which the second molecule is CD3.
30. Способ по любому из пп. 26-29, в котором:30. The method according to any one of paragraphs. 26-29, in which:
специфическое связывание первого рецепторсвязывающего средства с первой молекулой способно усиливать, ослаблять или модифицировать второй сигнал. доставляемый через первую молекулу; илиspecific binding of the first receptor-binding agent to the first molecule is capable of enhancing, attenuating or modifying the second signal. delivered through the first molecule; or
31. Способ по любому из пп. 24-30, в котором специфическое связывание первого рецепторсвязывающего средства с первой молекулой способно усиливать или потенцировать ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал.31. The method according to any one of paragraphs. 24-30, wherein specific binding of the first receptor binding agent to the first molecule is capable of enhancing or potentiating the TCR/CD3 complex-associated signal.
32. Способ по любому из пп. 1-31, в котором клетки-мишени содержат клетки иммунной системы.32. The method according to any one of paragraphs. 1-31, in which the target cells contain cells of the immune system.
33. Способ по любому из пп. 1-32, в котором:33. The method according to any one of paragraphs. 1-32, in which:
клетки-мишени содержат клетки крови;target cells contain blood cells;
клетки-мишени содержат лейкоциты;target cells contain leukocytes;
клетки-мишени содержат лимфоциты;target cells contain lymphocytes;
клетки-мишени содержат B-клетки;target cells contain B cells;
клетки-мишени содержат T-клетки; и/илиtarget cells contain T cells; and/or
клетки-мишени содержат естественные киллерные (NK) клетки.target cells contain natural killer (NK) cells.
34. Способ по любому из пп. 1-33, в котором клетки-мишени содержат антиген-специфические T-клетки или их популяцию, T-хелперные клетки или их популяцию, цитотоксические T-клетки или их популяцию, T-клетки памяти или их популяцию, регуляторные T-клетки или их популяцию, NK клетки или их популяцию, антиген-специфические B-клетки или их популяцию, B-клетки памяти или их популяцию или регуляторные B-клетки или их популяцию.34. The method according to any one of paragraphs. 1-33, wherein the target cells comprise antigen-specific T cells or a population thereof, T helper cells or a population thereof, cytotoxic T cells or a population thereof, memory T cells or a population thereof, regulatory T cells or a population thereof. a population, NK cells or a population thereof, antigen-specific B cells or a population thereof, memory B cells or a population thereof, or regulatory B cells or a population thereof.
35. Способ по любому из пп. 1-34, в котором клетки-мишени представляют собой T-клетки.35. The method according to any one of paragraphs. 1-34, in which the target cells are T cells.
36. Способ по любому из пп. 1-35, в котором T-клетки представляют собой не фракционированные T-клетки, представляют собой обогащенные или выделенные CD3+ T-клетки, представляют собой обогащенные или выделенные CD4+ T-клетки или представляют собой обогащенные или выделенные CD8+ T-клетки.36. The method according to any one of paragraphs. 1-35, wherein the T cells are unfractionated T cells, are enriched or isolated CD3+ T cells, are enriched or isolated CD4+ T cells, or are enriched or isolated CD8+ T cells.
37. Способ по любому из пп. 1-36, в котором перед инкубацией T-клетки не обогащают по наивным T-клеткам.37. The method according to any one of paragraphs. 1-36 in which T cells are not enriched for naïve T cells prior to incubation.
38. Способ по любому из пп. 1-37, в котором клетки-мишени представляют собой эмбриональные клетки от субъекта.38. The method according to any one of paragraphs. 1-37, wherein the target cells are embryonic cells from a subject.
39. Способ по любому из пп. 1-38, в котором клетки-мишени представляют собой клетки человека.39. The method according to any one of paragraphs. 1-38, wherein the target cells are human cells.
40. Способ по любому из пп. 1-39, в котором по меньшей мере часть инкубации осуществляют в присутствии дополнительного средства, которое способно доставлять сигнал в T-клетки.40. The method according to any one of paragraphs. 1-39, in which at least part of the incubation is carried out in the presence of an additional agent that is capable of delivering a signal to T cells.
41. Способ п. 40, в котором дополнительное средство способно усиливать или индуцировать пролиферацию T-клеток.41. The method of claim 40 wherein the additional agent is capable of enhancing or inducing T cell proliferation.
42. Способ по п. 40 или 41, в котором дополнительное средство представляет собой цитокин, выбранный из IL-2, IL-15 и IL-7.42. The method of claim 40 or 41 wherein the additional agent is a cytokine selected from IL-2, IL-15 and IL-7.
43. Способ по любому из пп. 40-42, в котором дополнительное средство не связывается специфически с CD28 и/или индуцирует передачу сигнала CD28.43. The method according to any one of paragraphs. 40-42, wherein the additional agent does not specifically bind to CD28 and/or induces CD28 signaling.
44. Способ по любому из пп. 1-43, в котором реактив не связывают с основой во время указанной инкубации.44. The method according to any one of paragraphs. 1-43, in which the reagent is not bound to the base during said incubation.
45. Способ по любому из пп. 1-44, в котором реактив присутствует в растворимой форме.45. The method according to any one of paragraphs. 1-44, in which the reagent is present in soluble form.
46. Способ по любому из пп. 1-43, в котором реактив связывают с основой во время по меньшей мере части инкубации, в соответствии с чем множество клеток-мишеней обратимо иммобилизуют на основе во время по меньшей мере части инкубации.46. The method according to any one of paragraphs. 1-43, wherein the reagent is bound to the base during at least part of the incubation, whereby a plurality of target cells are reversibly immobilized on the base during at least part of the incubation.
47. Способ по п. 46, в котором основа содержит твердый носитель.47. The method according to p. 46, in which the base contains a solid carrier.
48. Способ по п. 46 или 47, в котором основа содержит стационарную фазу.48. The method according to claim 46 or 47, in which the base contains a stationary phase.
49. Способ по любому из пп. 1-48, в котором рецепторсвязывающее средство содержит антитело, фрагмент антитела, белковую связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, молекулу, содержащую домены Ig, цитокин, хемокин, аптамер, молекулу MHC и связывающих фрагменты любого из них.49. The method according to any one of paragraphs. 1-48, wherein the receptor-binding agent comprises an antibody, an antibody fragment, a protein binding molecule with antibody-like binding properties, a molecule containing Ig domains, a cytokine, a chemokine, an aptamer, an MHC molecule, and binding fragments of any of them.
50. Способ по любому из пп. 1-49, в котором50. The method according to any one of paragraphs. 1-49, in which
рецепторсвязывающее средство содержит двухвалентный фрагмент антитела, выбранный из F(ab')2-фрагмента и двухвалентного одноцепочечного Fv (scFv) фрагмента.the receptor-binding agent comprises a divalent antibody fragment selected from an F(ab') 2 fragment and a divalent single chain Fv (scFv) fragment.
51. Способ по любому из пп. 1-49, в котором рецепторсвязывающее средство представляет собой одновалентный фрагмент антитела, выбранный из Fab-фрагмента, Fv-фрагмента и scFv-фрагмента.51. The method according to any one of paragraphs. 1-49, wherein the receptor binding agent is a monovalent antibody fragment selected from Fab fragment, Fv fragment and scFv fragment.
52. Способ по любому из пп. 1-49, в котором рецепторсвязывающее средство содержит белковую связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, выбранную из аптамеров, мутеинов, основанных на полипептиде семейства липокалина, глутел, белков, основанных на анкириновом каркасе, белков, основанных на кристаллиновом каркасе, аднектинов и авимеров.52. The method according to any one of paragraphs. 1-49, wherein the receptor binding agent comprises a protein binding molecule with antibody-like binding properties selected from aptamers, lipocalin family polypeptide-based muteins, glutels, ankyrin backbone-based proteins, crystallin backbone-based proteins, adnectins, and avimers.
53. Способ по любому из пп. 1-52, в котором реактив содержит стрептавидин; авидин; мутеин стрептавидина, который обратимо связывает биотин, аналог биотина или стрептавидинсвязывающий пептид; аналог авидина, который обратимо связывает биотин, аналог биотина или стрептавидинсвязывающий пептид; реактив, который содержит по меньшей мере две хелатирующие группы, где по меньшей мере две хелатирующие группы способны к связыванию с ионом переходного металла; средство, способное к связыванию с олигогистидиновой аффинной меткой; средство, способное к связыванию с глутатион-S-трансферазой; кальмодулин или его аналог; средство, способное к связыванию с кальмодулинсвязывающим пептидом (CBP); средство, способное к связыванию с FLAG-пептидом; средство, способное к связыванию с HA-меткой; средство, способное к связыванию с мальтозасвязывающим белком (MBP); средство, способное к связыванию с эпитопом HSV; средство, способное к связыванию с эпитопом myc; или средство, способное к связыванию с биотинилированным белком-переносчиком.53. The method according to any one of paragraphs. 1-52, in which the reagent contains streptavidin; avidin; a streptavidin mutein that reversibly binds biotin, a biotin analog, or a streptavidin-binding peptide; an avidin analog that reversibly binds biotin, a biotin analog, or a streptavidin-binding peptide; a reagent that contains at least two chelating groups, where at least two chelating groups are capable of binding to a transition metal ion; an agent capable of binding to an oligohistidine affinity tag; an agent capable of binding to glutathione-S-transferase; calmodulin or its analogue; an agent capable of binding to calmodulin-binding peptide (CBP); an agent capable of binding to a FLAG peptide; an agent capable of binding to an HA tag; an agent capable of binding to maltose-binding protein (MBP); an agent capable of binding to an HSV epitope; an agent capable of binding to a myc epitope; or an agent capable of binding to a biotinylated carrier protein.
54. Способ по п. 53, в котором реактив содержит олигомер или полимер стрептавидина, авидина, аналога или мутеина стрептавидина или аналога авидина.54. The method of claim 53, wherein the reagent comprises an oligomer or polymer of streptavidin, avidin, a streptavidin analog or mutein, or an avidin analog.
55. Способ по п. 54, в котором индивидуальные молекулы олигомера или полимера сшивают с помощью полисахарида или бифункционального линкера.55. The method according to p. 54, in which the individual molecules of the oligomer or polymer are crosslinked using a polysaccharide or a bifunctional linker.
56. Способ по любому из пп. 53-55, в котором стрептавидинсвязывающий пептид представлен в любой из SEQ ID NO: 7, 8 и 15-19.56. The method according to any one of paragraphs. 53-55, in which the streptavidin-binding peptide is presented in any of SEQ ID NOs: 7, 8 and 15-19.
57. Способ по любому из пп. 53-56, в котором мутеин стрептавидина содержит аминокислотную последовательность Va144-Thr45-Ala46-Arg47 или lle44-Gly45-Ala46-Arg47 в положениях последовательности, соответствующих положениям с 44 до 47 последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 1.57. The method according to any one of paragraphs. 53-56, in which the streptavidin mutein contains the amino acid sequence Va1 44 -Thr 45 -Ala 46 -Arg 47 or lle 44 -Gly 45 -Ala 46 -Arg 47 at positions of the sequence corresponding to positions 44 to 47 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
58. Способ по п. 57, в котором мутеин стрептавидина дополнительно содержит замену или замены аминокислот в положении, соответствующем 117, 120 и/или 121 относительно положений в стрептавидине в последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 1.58. The method of claim 57 wherein the streptavidin mutein further comprises an amino acid substitution or substitutions at position corresponding to 117, 120 and/or 121 relative to the streptavidin positions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
59. Способ по п. 58, в котором59. The method of claim 58, wherein
замену или замены аминокислот выбирают из Glu117, Asp117, Arg117, Ser120, Ala120, Gly120, Trp121, Tyr121 или Phe121.the amino acid substitution or substitutions are selected from Glu 117 , Asp 117 , Arg 117 , Ser 120 , Ala 120 , Gly 120 , Trp 121 , Tyr 121 or Phe 121 .
60. Способ по п. 58 или п. 59, в котором замены аминокислот выбирают из одной или более из Glu117, Gly120 или Tyr121.61. Способ по любому из пп. 58-60, в котором замены аминокислот выбирают из Glu117, Gly120 и Tyr121.60. The method of claim 58 or claim 59, wherein the amino acid substitutions are selected from one or more of Glu 117 , Gly 120 or Tyr 121 .61. The method according to any one of paragraphs. 58-60, wherein the amino acid substitutions are selected from Glu 117 , Gly 120 and Tyr 121 .
62. Способ по любому из пп. 53-61, в котором мутеин стрептавидина содержит последовательность аминокислот, которая проявляет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более высокую идентичность последовательностей с любой из SEQ ID NO: 3-6, 27 и 28 или ее функциональный фрагмент, который обратимо связывается с биотином, аналогом биотина или стрептавидинсвязывающим пептидом, где последовательность аминокислот или ее функциональный фрагмент содержат последовательность аминокислот, соответствующую Val44-Thr45-Ala46-Arg47 или Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 в положениях последовательности, соответствующих положениям с 44 до 47 последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 1.62. The method according to any one of paragraphs. 53-61, wherein the streptavidin mutein contains an amino acid sequence that exhibits at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or greater sequence identity to any of SEQ ID NOs: 3-6, 27 and 28 or a functional fragment thereof that reversibly binds to biotin, a biotin analog, or a streptavidin-binding peptide, where the amino acid sequence or its functional fragment contains the amino acid sequence corresponding to Val 44 -Thr 45 -Ala 46 -Arg 47 or Ile 44 -Gly 45 -Ala 46 -Arg 47 in positions of the sequence corresponding to positions 44 to 47 of the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1.
63. Способ по любому из пп. 53-62, в котором аналог или мутеин стрептавидина содержит последовательность аминокислот, которая проявляет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более высокую идентичность последовательностей с SEQ ID NO: 27 или 28, или ее функциональный фрагмент, который обратимо связывается с биотином, аналогом биотина или стрептавидинсвязывающим пептидом, где последовательность аминокислот или ее функциональный фрагмент содержат аминокислотную последовательность, соответствующую Va144, Thr45, Ala46, Arg47, Glu117, Gly120 и Tyr121 в положениях последовательности, соответствующих положениям с 44 до 47 последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 1.63. The method according to any one of paragraphs. 53-62, wherein the streptavidin analog or mutein contains an amino acid sequence that exhibits at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or greater sequence identity to SEQ ID NO: 27 or 28, or a functional fragment thereof that reversibly binds to biotin, a biotin analog, or a streptavidin-binding peptide, wherein the amino acid sequence or its functional fragment contain the amino acid sequence corresponding to Va1 44 , Thr 45 , Ala 46 , Arg 47 , Glu 117 , Gly 120 and Tyr 121 at positions of the sequence corresponding to positions 44 to 47 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
64. Способ по любому из пп. 53-63, в котором мутеин стрептавидина содержит последовательность аминокислот, представленную в любой из SEQ ID NO: 3-6, 27 или 28, или ее функциональный фрагмент, который обратимо связывается с биотином, аналогом биотина или трептавидинсвязывающим пептидом, где указанный функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность, соответствующую Va144-Thr45-Ala46-Arg47 или lle44-Gly45-Ala46-Arg47 в положениях последовательности, соответствующих положениям с 44 до 47 последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 1.64. The method according to any one of paragraphs. 53-63, wherein the streptavidin mutein contains the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 3-6, 27, or 28, or a functional fragment thereof that reversibly binds to biotin, a biotin analog, or a treptavidin-binding peptide, wherein said functional fragment contains the amino acid sequence corresponding to Va1 44 -Thr 45 -Ala 46 -Arg 47 or lle 44 -Gly 45 -Ala 46 -Arg 47 at the sequence positions corresponding to positions 44 to 47 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
65. Способ по любому из пп. 53-64, где мутеин стрептавидина содержит последовательность аминокислот, представленную в любой из SEQ ID NO: 3-6, 27 и 28.65. The method according to any one of paragraphs. 53-64, wherein the streptavidin mutein contains the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 3-6, 27 and 28.
66. Способ по любому из пп. 1-65, где рецепторсвязывающее средство содержит партнера связывания C1, который обратимо связывается с одним или более сайтов связывания Z1 множества сайтов связывания.66. The method according to any one of paragraphs. 1-65, wherein the receptor binding agent comprises a C1 binding partner that reversibly binds to one or more Z1 binding sites of a plurality of binding sites.
67. Способ по п. 66, в котором67. The method of claim 66, wherein
константа диссоциации (KD) для обратимого связывания между указанным сайтом связывания Z1 и указанным партнером связывания C1 находится в диапазоне от 10-2 M до 10-13 M.the dissociation constant (K D ) for reversible binding between said Z1 binding site and said C1 binding partner ranges from 10 -2 M to 10 -13 M.
68. Способ по п. 66 или 67, в котором реактив содержит мутеин стрептавидина, и партнер связывания С1 содержит биотин, аналог биотина или стрептавидинсвязывающий пептид.68. The method of claim 66 or 67, wherein the reagent comprises a streptavidin mutein and the C1 binding partner comprises biotin, a biotin analog, or a streptavidin binding peptide.
69. Способ по любому из пп. 66-68, в котором69. The method according to any one of paragraphs. 66-68, in which
реактив содержит мутеин стрептавидина; иthe reagent contains a streptavidin mutein; and
партнер связывания C1 содержит стрептавидинсвязывающий пептид, где последовательность стрептавидинсвязывающего пептида представлена в любой из SEQ ID NO: 7, 8 и 15-19.binding partner C1 contains a streptavidin-binding peptide, where the sequence of the streptavidin-binding peptide is presented in any of SEQ ID NOs: 7, 8 and 15-19.
70. Способ по любому из пп. 1-69, который дополнительно включает разрушение обратимого связывания между рецепторсвязывающим средством и реактивом.70. The method according to any one of paragraphs. 1-69, which further includes breaking the reversible binding between the receptor binding agent and the reagent.
71. Способ по п. 70, в котором разрушение осуществляют в пределах 14 суток после инициации инкубации, в пределах 12 суток после инициации инкубации, в пределах 10 суток после инициации инкубации в пределах 8 суток после инициации инкубации или в пределах 6 суток после инициации инкубации.71. The method according to p. 70, in which the destruction is carried out within 14 days after the initiation of incubation, within 12 days after the initiation of incubation, within 10 days after the initiation of incubation, within 8 days after the initiation of incubation, or within 6 days after the initiation of incubation .
72. Способ по п. 70 или 71, в котором указанное разрушение завершает или уменьшает сигнал, индуцируемый рецепторсвязывающим средством в клетках-мишенях.72. The method of claim 70 or 71, wherein said disruption completes or reduces the signal induced by the receptor binding agent in target cells.
73. Способ по любому из пп. 70-72, в котором указанное разрушение включает введение в клетки композиции, содержащей вещество, способное к обращению связи между рецепторсвязывающим средством и реактивом.73. The method according to any one of paragraphs. 70-72, wherein said disruption comprises administering to cells a composition containing a substance capable of reversing the bond between the receptor binding agent and the reagent.
74. Способ по п. 73, в котором вещество представляет собой конкурентное средство.74. The method of claim 73, wherein the substance is a competitive agent.
75. Способ по п. 73 или 74, в котором вещество в композиции не является вредоносным для клеток-мишеней и/или в котором добавление указанного вещества не снижает процентную долю выживших клеток-мишеней до меньше чем 90%, 80%, 70%, 60% или 50%, по сравнению с инкубацией клеток-мишеней при сравнимых или тех же условиях, без вещества.75. The method according to p. 73 or 74, in which the substance in the composition is not harmful to target cells and / or in which the addition of said substance does not reduce the percentage of surviving target cells to less than 90%, 80%, 70%, 60% or 50%, compared to incubation of target cells under comparable or the same conditions, without substance.
76. Способ по любому из пп. 73-75, в котором:76. The method according to any one of paragraphs. 73-75, in which:
реактив содержит мутеин стрептавидина; иthe reagent contains a streptavidin mutein; and
вещество содержит стрептавидинсвязывающий пептид, биотин или аналог биотина.the substance contains a streptavidin-binding peptide, biotin or a biotin analogue.
77. Способ по п. 76, в котором последовательность77. The method of claim 76, wherein the sequence
стрептавидинсвязывающего пептида представлена в любой из SEQ ID NO: 7, 8 и 15-19.streptavidin binding peptide is represented in any one of SEQ ID NOs: 7, 8 and 15-19.
78. Способ по п. 76 или 77, в котором аналог биотина представляет собой дестиобиотин.78. The method of claim 76 or 77, wherein the biotin analog is dethiobiotin.
79. Способ по любому из пп. 73-78, где вещество содержит D-биотин.79. The method according to any one of paragraphs. 73-78, where the substance contains D-biotin.
80. Способ по любому из пп. 1-79, в котором80. The method according to any one of paragraphs. 1-79, in which
перед инкубацией, приведение в контакт клеток со средством отбора, которое специфически связывается с маркером, который содержат клетки-мишени композиции, тем самым создавая или получая композицию, содержащую клетки-мишени.prior to incubation, contacting the cells with a selection agent that specifically binds to a marker that the target cells of the composition contain, thereby creating or obtaining a composition containing the target cells.
81. Способ по любому из пп. 1-80, в котором по меньшей мере часть инкубации осуществляют дополнительно в присутствии средства отбора, которое специфически связывается с маркером, который содержат клетки-мишени композиции, где культивируемые клетки-мишени обогащают по клеткам-мишеням, содержащим маркер.81. The method according to any one of paragraphs. 1-80, in which at least part of the incubation is carried out additionally in the presence of a selection agent that specifically binds to a marker that contains the target cells of the composition, where the cultured target cells are enriched for target cells containing the marker.
82. Способ по п. 80 или 81, в котором82. The method according to claim 80 or 81, in which
средство отбора обратимо связывают с дополнительным реактивом, содержащим множеством сайтов связывания, способных к специфическому связыванию со средством отбора.the selection agent is reversibly associated with an additional reagent containing a plurality of binding sites capable of specifically binding to the selection agent.
83. Способ по любому из пп. 1-82, в котором индукция сигнала вызывает увеличение размножения и/или активации культивируемых клеток-мишеней по сравнению с инкубацией клеток-мишеней в отсутствие индукции сигнала.83. The method according to any one of paragraphs. 1-82, wherein signal induction causes an increase in expansion and/or activation of cultured target cells as compared to incubation of target cells in the absence of signal induction.
84. Способ по любому из пп. 26-83, в котором индукция первого сигнала и второго сигналаувеличивает размножение и/или активацию клеток-мишеней по сравнению с инкубацией клеток-мишеней в отсутствие индукции первого сигнала или второго сигнала.84. The method according to any one of paragraphs. 26-83, wherein the induction of the first signal and the second signal increases the expansion and/or activation of target cells compared to incubation of the target cells in the absence of the induction of the first signal or the second signal.
85. Способ по п. 83 или 84, в котором увеличение является по меньшей мере 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 6-кратным, 7-кратным, 8-кратным, 9-кратным, 10-кратным или более.85. The method according to p. 83 or 84, in which the increase is at least 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10 multiple or more.
86. Способ по любому из пп. 1-85, в котором способ увеличивает размножение T-клеток в композиции, изменяет метаболический профиль T-клеток в композиции, изменяет подмножество CD8+ T-клеток в композиции; и/или увеличивает процентную долю долгоживущих T-клеток памяти в композиции, каждое по сравнению с T-клетками в композиции перед инкубацией или после инкубации, но в присутствии средства, которое специфически связывает CD28.86. The method according to any one of paragraphs. 1-85, in which the method increases the expansion of T cells in the composition, changes the metabolic profile of T cells in the composition, changes the subset of CD8+ T cells in the composition; and/or increases the percentage of long-lived memory T cells in the composition, each compared to T cells in the composition before incubation or after incubation, but in the presence of an agent that specifically binds CD28.
87. Способ по любому из пп. 1-86, где способы ведут к культивируемым клеткам-мишеням, в которых87. The method according to any one of paragraphs. 1-86, where the methods lead to cultured target cells in which
число или процентную долю CD3+ T-клеток, CD4+ T-клеток или CD8+ клеток увеличивают по меньшей мере 2-кратно, 3-кратно, 4-кратно, 5-кратно, 6-кратно, 7-кратно, 8-кратно, 9-кратно или 10-кратно по сравнению с числом или процентной долей CD3+ T-клеток, CD4+ T-клеток или CD8+ T-клеток, соответственно, в композиции перед инкубацией или после аналогичной инкубации, но выполняемой в присутствии средства, которое специфически связывает CD28 и/или индуцирует или модулирует передачу сигнала CD28;the number or percentage of CD3+ T cells, CD4+ T cells, or CD8+ cells is increased by at least 2-fold, 3-fold, 4-fold, 5-fold, 6-fold, 7-fold, 8-fold, 9-fold fold or 10-fold compared to the number or percentage of CD3+ T cells, CD4+ T cells or CD8+ T cells, respectively, in the composition before incubation or after a similar incubation, but performed in the presence of an agent that specifically binds CD28 and/ or induces or modulates CD28 signaling;
соотношение CD8+ T-клеток или относительное или нормализованное соотношение CD8+ T-клеток в композиции увеличивают по меньшей мере 2-кратно, 3-кратно, 4-кратно, 5-кратно, 6-кратно, 7-кратно, 8-кратно, 9-кратно или 10-кратно по сравнению с соотношением или относительным или нормализованным соотношением CD8+ T-клеток в композиции перед инкубацией или после аналогичной инкубации, но в присутствии средства, которое специфически связывает CD28; и/или число или процентную долю CD62L+ T-клеток памяти в композиции увеличивают по меньшей мере 2-кратно, 3-кратно, 4-кратно, 5-кратно, 6-кратно, 7-кратно, 8-кратно, 9-кратно или 10-кратно по сравнению с числом или процентной долей CD62L+ T-клеток в композиции перед инкубацией, или после аналогичной инкубации, но в присутствии средства, которое специфически связывает CD28.the ratio of CD8+ T cells or the relative or normalized ratio of CD8+ T cells in the composition is increased by at least 2-fold, 3-fold, 4-fold, 5-fold, 6-fold, 7-fold, 8-fold, 9- fold or 10-fold compared to the ratio or relative or normalized ratio of CD8+ T cells in the composition before incubation or after similar incubation, but in the presence of an agent that specifically binds CD28; and/or the number or percentage of CD62L+ memory T cells in the composition is increased by at least 2-fold, 3-fold, 4-fold, 5-fold, 6-fold, 7-fold, 8-fold, 9-fold, or 10-fold compared to the number or percentage of CD62L+ T cells in the composition before incubation, or after a similar incubation but in the presence of an agent that specifically binds CD28.
88. Способ по любому из пп. 1-87, в котором культивируемые клетки-мишени содержат больше чем 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% подмножества T-клеток, содержащих фенотип, который представляет собой поверхность, положительную по CD62L (CD62L+), в виде процентной доли от всех T-клеток в композиции или всех клеток в композиции.88. The method according to any one of paragraphs. 1-87, in which the cultured target cells contain more than 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of a subset of T cells containing a phenotype that is a surface positive by CD62L (CD62L+), as a percentage of all T cells in the composition or all cells in the composition.
89. Способ по п. 88, в котором подмножество T-клеток дополнительно содержит фенотип, содержащий:89. The method of claim 88, wherein the subset of T cells further comprises a phenotype comprising:
a) CD127+; и/илиa) CD127+; and/or
b) любое одно или несколько из CD45RA+, CD45RO-, CCR7+ и CD27+ и любое одно или несколько из t-betнизк., IL-7Ra+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ и LFA-1+.b) any one or more of CD45RA+, CD45RO-, CCR7+ and CD27+ and any one or more of t-bet low. , IL-7Ra+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ and LFA-1+.
90. Способ по п. 88 или 89, в котором подмножество T-клеток:90. The method of claim 88 or 89, wherein the subset of T cells:
a) содержит низкий уровень эксцизионных колец реаранжировки TCR (TREC); и/илиa) contains a low level of excisional TCR rearrangement rings (TRECs); and/or
b) экспрессирует маркер пролиферации, который необязательно представляет собой Ki-67; и/илиb) expresses a proliferation marker, which is optionally Ki-67; and/or
c) демонстрирует способность пролиферировать в присутствии стимулирующего средства; и/илиc) demonstrates the ability to proliferate in the presence of a stimulant; and/or
d) демонстрирует способность продуцировать цитокин, выбранный из IFN-γ, TNF и IL-2, в присутствии стимулирующего средства.d) demonstrates the ability to produce a cytokine selected from IFN-γ, TNF and IL-2 in the presence of a stimulant.
91. Способ по п. 90, в котором стимулирующее средство представляет собой антиген, гомеостатический цитокин или представляет собой средство, которое способно к инициации ассоциированного с комплексом TCR/CD3 сигнала в T-клетках.91. The method of claim 90, wherein the stimulatory agent is an antigen, a homeostatic cytokine, or is an agent that is capable of initiating a TCR/CD3 complex-associated signal in T cells.
92. Способ по любому из пп. 88-91, в котором подмножество T-клеток представляет собой или содержит долгоживущие T-клетки памяти.92. The method according to any one of paragraphs. 88-91, wherein the subset of T cells are or contain long-lived memory T cells.
93. Способ по любому из пп. 88-92, в котором подмножество T-клеток представляет собой или содержит стволовые T-клетки памяти (TSCM).93. The method according to any one of paragraphs. 88-92, wherein the subset of T cells is or contains memory stem T cells (T SCM ).
94. Способ по любому из пп. 1-93, который дополнительно включает введение рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты в клетки-мишени популяции, эта молекула нуклеиновой кислоты кодирует рекомбинантный белок, в соответствии с чем клетки экспрессируют рекомбинантный белок.94. The method according to any one of paragraphs. 1-93, which further comprises introducing the recombinant nucleic acid molecule into the target cells of the population, the nucleic acid molecule encodes the recombinant protein, whereby the cells express the recombinant protein.
95. Способ по п. 94, в котором рекомбинантный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор или трансгенный T-клеточный рецептор (TCR).95. The method of claim 94 wherein the recombinant receptor is a chimeric antigen receptor or transgenic T cell receptor (TCR).
96. Способ по любому из пп. 1-95, в котором способ осуществляют in vitro или ex vivo.96. The method according to any one of paragraphs. 1-95, wherein the method is carried out in vitro or ex vivo .
97. Способ по любому из пп. 1-96, который дополнительно включает введение культивируемых клеток субъекту, имеющему заболевание или состояние.97. The method according to any one of paragraphs. 1-96, which further comprises administering the cultured cells to a subject having a disease or condition.