Claims (33)
1. Слитый белок, содержащий домен белка с цинковыми пальцами (ZFP) и домен репрессора транскрипции, где домен ZFP связывается с областью-мишенью в интронном сегменте между экзонами 1a и 1b на мутантном аллеле гена C9orf72 человека, где область-мишень содержит более 30 тандемных повторов G4C2 (SEQ ID NO:1).1. A fusion protein containing a zinc finger protein (ZFP) domain and a transcriptional repressor domain, where the ZFP domain binds to a target region in the intron segment between exons 1a and 1b on a mutant allele of the human C9orf72 gene, where the target region contains more than 30 tandem G 4 C 2 repeats (SEQ ID NO:1).
2. Слитый белок по п.1, где слитый белок подавляет транскрипцию содержащей повторы мРНК с мутантного аллеля и не подавляет транскрипцию с гена мРНК дикого типа.2. The fusion protein of claim 1, wherein the fusion protein represses transcription of the repeat-containing mRNA from the mutant allele and does not repress transcription from the wild-type mRNA gene.
3. Слитый белок по п.1 или 2, где домен ZFP связывается со смысловой последовательностью в области-мишени, где смысловая последовательность содержит от одного до трех тандемных повторов гексануклеотида GGGGCC (SEQ ID NO:1), GGGCCG (SEQ ID NO:2), GGCCGG (SEQ ID NO:3), GCCGGG (SEQ ID NO:4), CCGGGG (SEQ ID NO:5) или CGGGGC (SEQ ID NO:6).3. The fusion protein according to claim 1 or 2, where the ZFP domain binds to a sense sequence in the target region, where the sense sequence contains from one to three tandem repeats of the hexanucleotide GGGGCC (SEQ ID NO:1), GGGCCG (SEQ ID NO:2 ), GGCCGG (SEQ ID NO:3), GCCGGG (SEQ ID NO:4), CCGGGG (SEQ ID NO:5) or CGGGGC (SEQ ID NO:6).
4. Слитый белок по любому из пп.1-3, где слитый белок подавляет смысловую транскрипцию с мутантного аллеля C9orf72 в клетке человека.4. A fusion protein according to any one of claims 1 to 3, wherein the fusion protein represses sense transcription from the mutant C9orf72 allele in a human cell.
5. Слитый белок по п.4, где слитый белок подавляет смысловую транскрипцию с промотора C9orf72 1a и не подавляет смысловую транскрипцию с промотора C9orf72 1b.5. The fusion protein of claim 4, wherein the fusion protein represses sense transcription from the C9orf72 1a promoter and does not repress sense transcription from the C9orf72 1b promoter.
6. Слитый белок по п.1 или 2, где домен ZFP связывается с антисмысловой последовательностью в области-мишени, где антисмысловая последовательность содержит от одного до трех тандемных повторов гексануклеотидов GGCCCC (SEQ ID NO:7), GCCCCG (SEQ ID NO:8), CCCCGG (SEQ ID NO:9), CCCGGC (SEQ ID NO:10), CCGGCC (SEQ ID NO:11) или CGGCCC (SEQ ID NO:12).6. A fusion protein according to claim 1 or 2, where the ZFP domain binds to an antisense sequence in the target region, where the antisense sequence contains from one to three tandem repeats of the hexanucleotides GGCCCC (SEQ ID NO: 7), GCCCCG (SEQ ID NO: 8 ), CCCCGG (SEQ ID NO:9), CCCGGC (SEQ ID NO:10), CCGGCC (SEQ ID NO:11) or CGGCCC (SEQ ID NO:12).
7. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где слитый белок подавляет антисмысловую транскрипцию с мутантного аллеля C9orf72 в клетке человека.7. A fusion protein according to any one of the preceding claims, wherein the fusion protein represses antisense transcription from the mutant C9orf72 allele in a human cell.
8. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где слитый белок подавляет как смысловую транскрипцию, так и антисмысловую транскрипцию, с мутантного аллеля C9orf72 в клетке человека.8. A fusion protein according to any one of the preceding claims, wherein the fusion protein represses both sense transcription and antisense transcription from a mutant C9orf72 allele in a human cell.
9. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где слитый белок подавляет смысловую и/или антисмысловую транскрипцию с мутантного аллеля C9orf72 по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 75%, 90% или 95%, необязательно где слитый белок не подавляет смысловую транскрипцию с промотора C9orf72 1b.9. A fusion protein according to any one of the preceding claims, wherein the fusion protein inhibits sense and/or antisense transcription from the mutant C9orf72 allele by at least about 30%, 40%, 75%, 90%, or 95%, optionally wherein the fusion protein does not inhibit sense transcription from the C9orf72 1b promoter.
10. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где домен ZFP10. A fusion protein according to any one of the preceding claims, wherein the ZFP domain
содержит шесть цинковых пальцев; contains six zinc fingers;
связывается с последовательностью-мишенью, представленной в таблице 1; и/илиbinds to the target sequence shown in Table 1; and/or
содержит шесть последовательностей цинковых пальцев фактора транскрипции ZFP, представленных в таблице 1, необязательно содержащих одну или несколько мутаций в остатках вне областей распознающей спирали, как указано в таблице 1.contains six zinc finger sequences of the transcription factor ZFP shown in Table 1, optionally containing one or more mutations in residues outside the regions of the recognition helix, as indicated in Table 1.
11. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где домен репрессора транскрипции содержит аминокислотную последовательность домена KRAB из KOX1 человека.11. A fusion protein according to any one of the preceding claims, wherein the transcriptional repressor domain comprises the amino acid sequence of the KRAB domain from human KOX1.
12. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где домен ZFP связан с доменом репрессора транскрипции через пептидный линкер.12. A fusion protein according to any one of the preceding claims, wherein the ZFP domain is linked to a transcriptional repressor domain via a peptide linker.
13. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая кодирующую последовательность для слитого белка по любому из пп.1-12, где кодирующая последовательность функционально связана с элементом регуляции транскрипции.13. A nucleic acid construct comprising a coding sequence for a fusion protein according to any one of claims 1 to 12, wherein the coding sequence is operably linked to a transcriptional regulatory element.
14. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.13, где элемент регуляции транскрипции представляет собой промотор млекопитающего, который является конститутивно активным или индуцибельным в клетке головного мозга, необязательно где промотор представляет собой промотор синапсина I человека.14. The nucleic acid construct of claim 13, wherein the transcriptional regulatory element is a mammalian promoter that is constitutively active or inducible in a brain cell, optionally wherein the promoter is a human synapsin I promoter.
15. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.13 или 14, где конструкция представляет собой вирусную конструкцию, необязательно где вирусная конструкция представляет собой рекомбинантную конструкцию аденоассоциированного вируса.15. The nucleic acid construct of claim 13 or 14, wherein the construct is a viral construct, optionally wherein the viral construct is a recombinant adeno-associated virus construct.
16. Клетка-хозяин, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп.13-15.16. A host cell containing a nucleic acid construct according to any one of claims 13-15.
17. Клетка-хозяин по п.16, где клетка-хозяин представляет собой клетку человека.17. The host cell of claim 16, wherein the host cell is a human cell.
18. Клетка-хозяин по п.17, где клетка человека представляет собой нейрон или плюрипотентную стволовую клетку, где стволовая клетка необязательно представляет собой эмбриональную стволовую клетку или индуцибельную плюрипотентную стволовую клетку (iPSC).18. The host cell of claim 17, wherein the human cell is a neuron or a pluripotent stem cell, where the stem cell is optionally an embryonic stem cell or an inducible pluripotent stem cell (iPSC).
19. Рекомбинантный вирус, содержащий конструкцию нуклеиновой кислоты по п.15, необязательно где рекомбинантный вирус представляет собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV).19. A recombinant virus containing the nucleic acid construct of claim 15, optionally wherein the recombinant virus is a recombinant adeno-associated virus (rAAV).
20. Фармацевтическая композиция, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп.13-15 или рекомбинантный вирус по п.19, и фармацевтически приемлемый носитель.20. A pharmaceutical composition containing a nucleic acid construct according to any one of claims 13-15 or a recombinant virus according to claim 19, and a pharmaceutically acceptable carrier.
21. Способ ингибирования транскрипции мутантного аллеля гена C9orf72 в клетке человека, где мутантный аллель содержит область экспансии повторов G4C2 (SEQ ID NO:1) в интронном сегменте между экзонами 1a и 1b, причем способ включает введение в клетку слитого белка по любому из пп.1-12, конструкции нуклеиновой кислоты по любому из пп.13-15, рекомбинантного вируса по п.19 или фармацевтической композиции по п.20.21. A method for inhibiting transcription of a mutant allele of the C9orf72 gene in a human cell, wherein the mutant allele contains a G 4 C 2 repeat expansion region (SEQ ID NO:1) in the intron segment between exons 1a and 1b, the method comprising introducing into the cell a fusion protein according to any from claims 1 to 12, a nucleic acid construct according to any one of claims 13 to 15, a recombinant virus according to claim 19 or a pharmaceutical composition according to claim 20.
22. Способ по п.21, где клетка человека представляет собой нейрон, глиальную клетку, эпендимную клетку или нейроэпителиальную клетку.22. The method of claim 21, wherein the human cell is a neuron, glial cell, ependymal cell, or neuroepithelial cell.
23. Способ по п.21 или 22, где клетка находится в головном мозге или спинном мозге пациента, страдающего от связанного с C9orf72 нарушения, необязательно выбранного из бокового амиотрофического склероза (ALS) и семейной лобно-височной деменции C9 (C9FTD).23. The method of claim 21 or 22, wherein the cell is in the brain or spinal cord of a patient suffering from a C9orf72 related disorder, optionally selected from amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and C9 familial frontotemporal dementia (C9FTD).
24. Способ лечения пациента, страдающего от связанного с C9orf72 нарушения, необязательно выбранный из бокового амиотрофического склероза (ALS) и семейной лобно-височной деменции C9 (C9FTD), причем способ включает введение пациенту слитого белка по любому из пп.1-12, конструкции нуклеиновой кислоты по любому из пп.13-15, рекомбинантного вируса по п.19 или фармацевтической композиции по п.20.24. A method of treating a patient suffering from a C9orf72 related disorder, optionally selected from amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and C9 familial frontotemporal dementia (C9FTD), the method comprising administering to the patient a fusion protein according to any one of claims 1-12, constructs a nucleic acid according to any one of claims 13 to 15, a recombinant virus according to claim 19 or a pharmaceutical composition according to claim 20.
25. Способ по любому из пп.21-24, где слитый белок вводят посредством рекомбинантного вируса, который экспрессирует слитый белок.25. The method according to any one of claims 21-24, wherein the fusion protein is administered via a recombinant virus that expresses the fusion protein.
26. Способ по п.25, где рекомбинантный вирус представляет собой аденоассоциированный вирус (AAV), необязательно серотипа 9 или псевдотипа AAV2/9 или AAV2/6/9.26. The method of claim 25, wherein the recombinant virus is an adeno-associated virus (AAV), optionally serotype 9 or pseudotype AAV2/9 or AAV2/6/9.
27. Способ по п.25 или 26, где рекомбинантный вирус вводят пациенту интрацеребравентрикулярным, интратекальным, внутричерепным, ретроорбитальным (RO), внутривенным, интраназальным и/или интрацистернальным путем.27. The method of claim 25 or 26, wherein the recombinant virus is administered to the patient via the intracerebraventricular, intrathecal, intracranial, retroorbital (RO), intravenous, intranasal, and/or intracisternal route.
28. Способ по любому из пп.21-27, где вводят два или более слитых белка по любому из пп.1-12, необязательно где кодирующие последовательности для двух или более слитых белков находятся на одном и том же рекомбинантном вирусном векторе.28. The method according to any one of claims 21-27, wherein two or more fusion proteins according to any one of claims 1-12 are introduced, optionally wherein the coding sequences for the two or more fusion proteins are on the same recombinant viral vector.
29. Слитый белок по любому из пп.1-12, конструкция нуклеиновой кислоты по любому из пп.13-15, рекомбинантный вирус по п.19 или фармацевтическая композиция по п.20 для применения в способе по любому из пп.21-28.29. A fusion protein according to any one of claims 1-12, a nucleic acid construct according to any one of claims 13-15, a recombinant virus according to claim 19, or a pharmaceutical composition according to claim 20 for use in the method according to any one of claims 21-28 .
30. Применение конструкции нуклеиновой кислоты по любому из пп.13-15 или рекомбинантного вируса по п.19 для производства лекарственного средства для лечения пациента, нуждающегося в этом, в способе по любому из пп.21-28. 30. Use of a nucleic acid construct according to any one of claims 13-15 or a recombinant virus according to claim 19 for the manufacture of a medicament for the treatment of a patient in need thereof, in the method of any one of claims 21-28.