RU2021131423A - Сконструированные аденоассоциированные (aav) векторы для экспрессии трансгена - Google Patents

Claims (40)

1. Капсидный белок AAV, содержащий аминокислотную последовательность, которая включает по меньшей мере четыре смежные аминокислоты последовательности STTLYSP (SEQ ID NO: 1) или FVVGQSY (SEQ ID NO: 2).

2. Капсидный белок AAV по п. 1, содержащий аминокислотную последовательность, которая включает по меньшей мере пять смежных аминокислот последовательности STTLYSP (SEQ ID NO: 1) или FVVGQSY (SEQ ID NO: 2).

3. Капсидный белок AAV по п. 1, содержащий аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере шесть смежных аминокислот последовательности STTLYSP (SEQ ID NO: 1) или FVVGQSY (SEQ ID NO: 2).

4. Капсидный белок AAV по пп. 1-3, где AAV представляет собой AAV9.

5. Капсидный белок AAV по пп. 1-4, содержащий VP1 AAV9.

6. Капсидный белок AAV по п. 5, где последовательность встроена в положение, соответствующее аминокислотам 588 и 589 SEQ ID NO: 6.

7. Нуклеиновая кислота, кодирующая капсидный белок AAV по пп. 1-6.

8. AAV, содержащий капсидный белок по пп. 1-6 и предпочтительно не содержащий капсидный белок VP1, VP2 или VP3 дикого типа.

9. AAV по п. 8, дополнительно содержащий трансген, а предпочтительно терапевтический трансген.

10. Способ доставки трансгена в клетку, включающий контактирование клетки с AAV по пп. 1-9.

11. Способ по п. 10, где клетка представляет собой нейрон (необязательно нейрон спинномозговых узлов или нейрон спиральных узлов), астроцит, кардиомиоцит или миоцит, астроцит, глиальную клетку, внутреннюю волосковую клетку, внешнюю волосковую клетку, поддерживающую клетку, фиброцит внутреннего уха, фоторецепторы, интернейроны, узлы сетчатки или пигментный эпителий сетчатки.

12. Способ по п. 11, где клетка присутствует у живого индивидуума.

13. Способ по п. 11, где индивидуум является млекопитающим.

14. Способ по пп. 10-13, где клетка присутствует в ткани, выбранной из ткани головного мозга, спинного мозга, спинномозговых узлов, сердца, внутреннего уха, глаза или мышцы, а также их комбинаций.

15. Способ по п. 14, где индивидуум страдает болезнью Альцгеймера; болезнью Паркинсона; Х-сцепленной адренолейкодистрофией; болезнью Канавана; болезнью Нимана-Пика; спинальной мышечной атрофией; болезнью Гентингтона; болезнью, ассоциированной с коннексином-26; болезнью Ашера типа 3A; болезнью Ашера типа 2D; потерей слуха, ассоциированной с волосковыми клетками; потерей слуха, ассоциированной с волосковыми клетками (DFNB7/11); потерей слуха, ассоциированной с внутренними волосковыми клетками (DFNB9); болезнью Ашера типа 1F; болезнью Ашера типа 1B; пигментным ретинитом (RP; несиндромным); врожденным амаврозом Лебера; наследственной невропатией зрительного нерва Лебера; синдромом Ашера (RP; синдромом, ассоциированным с глухотой); мышечной дистрофией Дюшенна; васкулопатией после аллотрансплантации; гемофилией А и В.

16. Способ по любому из пп. 10-13, где клетка находится в головном мозге индивидуума, и AAV вводят парентерально, интрацеребрально или интратекально.

17. Способ по п. 16, где интратекальную доставку осуществляют путем поясничной инъекции, интрацистернальной инъекции или интрапаренхимальной инъекции.

18. Способ по пп. 10-16, где AAV вводят парентерально, а предпочтительно внутривенно, внутриартериально, подкожно, внутрибрюшинно или внутримышечно.

19. Способ по любому из пп. 10-13, где клетка находится в глазу индивидуума, и AAV вводят путем субретинальной инъекции или инъекции в стекловидное тело.

20. Способ по любому из пп. 10-13, где клетка находится во внутреннем ухе индивидуума, и AAV вводят в улитку путем нанесения поверх или через мембрану круглого окна, посредством кохлеостомии, проводимой хирургически путем просверливания отверстия рядом с круглым окном, через отверстие в костном овальном окне или через полукруглый канал.

21. Конструкция библиотеки AAV, содержащая:

(i) последовательность, кодирующую рекомбиназу Cre, находящуюся под контролем промотора;

(ii) последовательность, кодирующую белок капсида AAV9 с гептамерным пептидом, встроенным между последовательностями, кодирующими аминокислоты (а.к.) 588-589 капсида под контролем промотора, расположенного ниже кластера Cre.

22. Конструкция библиотеки AAV по п. 21, где гептамер включает рандомизированный гептамерный пептид или предварительно отобранный гептамерный пептид.

23. Библиотека, содержащая множество конструкций библиотеки по п. 21 или 22.

24. Библиотека по п. 23, где библиотека содержит конструкции библиотеки, имеющие последовательности, кодирующие все возможные варианты гептамера.

25. Способ идентификации сконструированного капсида, который опосредует экспрессию трансгена в клетках предварительно отобранного типа, где указанный способ включает:

(a) введение библиотеки по п. 23 или 24 животному-модели, не являющемуся человеком, а предпочтительно млекопитающему, где клетки животного-модели экспрессирует loxP-фланкированный кластер STOP, расположенный перед репортерной последовательностью;

(b) выделение клеток предварительно отобранного типа;

(c) отбор клеток, в которых экспрессируется репортерная последовательность;

(d) выделение по меньшей мере части конструкции библиотеки, а предпочтительно части, содержащей гептамер, из выбранных клеток, в которых репортерная последовательность экспрессируется на стадии (c); и

(e) определение идентичности гептамеров в конструкциях библиотеки, выделенных на стадии (d), где выделенные гептамеры могут опосредовать экспрессию трансгена в клетках предварительно отобранного типа.

26. Способ по п. 25, где репортерная последовательность кодирует флуоресцентный репортерный белок.

27. Способ по п. 25, где животное-модель является трансгенным по loxP-фланкированному кластеру STOP, расположенному перед репортерной последовательностью, или где loxP-фланкированный кластер STOP, расположенный перед репортерной последовательностью, может экспрессироваться из второй конструкции.

28. Способ по п. 25, где определение идентичности гептамеров в конструкциях библиотеки включает проведение анализа методом секвенирования ДНК.

29. Способ по п. 25, дополнительно включающий, до и/или после стадии (е):

проведение ПЦР для амплификации последовательностей, содержащих последовательности гептамера и необязательно включающих последовательности полного капсида, из конструкций библиотеки, выделенных на стадии (d);

клонирование амплифицированных последовательностей обратно во второй набор векторов библиотеки;

повторную упаковку второго набора векторов библиотеки; и

проведение стадий (a)-(d) или (a)-(e) на втором наборе векторов библиотеки.