Claims (76)
1. Способ определения процента (%) потребления нуклеозидтрифосфатов (NTP) в реакции транскрипции (IVT) in vitro, включающий:1. A method for determining the percentage (%) of consumption of nucleoside triphosphates (NTP) in the transcription reaction (IVT) in vitro , including:
(а) проведение реакции IVT с реакционной смесью, которая содержит известные исходные концентрации NTP, дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), кодирующей рибонуклеиновую кислоту (РНК), представляющую интерес, и РНК-полимеразу;(a) performing an IVT reaction with a reaction mixture that contains known starting concentrations of NTP, deoxyribonucleic acid (DNA) encoding the ribonucleic acid (RNA) of interest, and RNA polymerase;
(b) измерение концентраций отдельных NTP через дискретные интервалы в течение периода времени; а также(b) measuring individual NTP concentrations at discrete intervals over a period of time; and
(c) расчет значения потребления в процентах (%) для каждого NTP в реакционной смеси. (c) calculating the consumption value in percent (%) for each NTP in the reaction mixture.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что NTP включают аденозинтрифосфат (ATP), цитидинтрифосфат (CTP), уридинтрифосфат (UTP) и гуанозинтрифосфат (GTP).2. The method of claim 1, wherein the NTPs include adenosine triphosphate (ATP), cytidine triphosphate (CTP), uridine triphosphate (UTP), and guanosine triphosphate (GTP).
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этап (b) включает (i) деление скорости потребления отдельного NTP на общую скорость потребления NTP.3. The method of claim 1, wherein step (b) comprises (i) dividing the individual NTP consumption rate by the total NTP consumption rate.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что скорость потребления отдельного NTP рассчитывается путем измерения концентраций отдельных NTP через дискретные интервалы в течение определенного периода времени; и общая скорость потребления NTP рассчитывается путем измерения общей концентрации NTP через дискретные интервалы в течение определенного периода времени.4. The method according to p. 3, characterized in that the consumption rate of an individual NTP is calculated by measuring the concentrations of individual NTP at discrete intervals over a certain period of time; and the total NTP consumption rate is calculated by measuring the total NTP concentration at discrete intervals over a period of time.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что измерения концентрации отдельного NTP и общей концентрации NTP собирают до тех пор, пока концентрация по меньшей мере одного из NTP не упадет ниже пороговой концентрации.5. The method of claim 4, wherein measurements of individual NTP concentration and total NTP concentration are collected until the concentration of at least one of the NTPs falls below a threshold concentration.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что пороговая концентрация является выше нулевой (0) миллимолярной (мМ) концентрации, необязательно при этом пороговая концентрация составляет от 5 до 20 мМ, и необязательно при этом пороговая концентрация находится в пределах 5-75% от исходной концентрации NTP.6. The method according to p. 5, characterized in that the threshold concentration is above zero (0) millimolar (mM) concentration, optionally, the threshold concentration is from 5 to 20 mm, and optionally, the threshold concentration is in the range of 5-75 % of the original NTP concentration.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что известные исходные концентрации NTP включают эквимолярные концентрации NTP каждого из [ATP], [CTP], [UTP] и [GTP].7. The method of claim 1, wherein the known starting NTP concentrations include equimolar NTP concentrations of each of [ATP], [CTP], [UTP], and [GTP].
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что известные исходные концентрации NTP включают соотношение [ATP]:[UTP] от 1:1 до 4:1, необязательно от 1:1 до 2:1, и/или соотношение [GTP]:[CTP] от 1:1 до 4:1.8. The method of claim. 1, characterized in that the known initial concentrations of NTP include the ratio of [ATP]:[UTP] from 1:1 to 4:1, optionally from 1:1 to 2:1, and/or the ratio of [GTP ]:[CTP] 1:1 to 4:1.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что известные исходные концентрации NTP включают соотношение [ATP]:[UTP]:[CTP]:[GTP], составляющее 2:1:1:4.9. The method of claim 1, wherein the known starting NTP concentrations include a ratio of [ATP]:[UTP]:[CTP]:[GTP] of 2:1:1:4.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что NTP представляет собой химически модифицированный NTP, встречающийся в природе NTP или синтетический NTP.10. The method of claim 1, wherein the NTP is a chemically modified NTP, a naturally occurring NTP, or a synthetic NTP.
11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реакцию IVT проводят в течение интервала времени от 20 до 40 минут.11. The method according to p. 1, characterized in that the IVT reaction is carried out over a time interval of 20 to 40 minutes.
12. Способ периодической реакции транскрипции in vitro (IVT) с подпиткой для представляющей интерес рибонуклеиновой кислоты (РНК), включающий:12. A fed-batch in vitro transcription (IVT) method for a ribonucleic acid (RNA) of interest, comprising:
(а) проведение реакции IVT с исходной реакционной смесью, которая содержит дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), кодирующую представляющую интерес РНК, РНК-полимеразу, нуклеозидтрифосфаты (NTP); а также(a) carrying out an IVT reaction with an initial reaction mixture that contains a deoxyribonucleic acid (DNA) encoding an RNA of interest, an RNA polymerase, nucleoside triphosphates (NTPs); and
(b) подача в текущую реакционную смесь IVT смеси сырья для подпитки с течением времени, которая содержит NTP, при этом каждый NTP присутствует в смеси сырья для подпитки в молярном соотношении, основанном на процентном значении потребления, рассчитанном отдельно для каждого NTP, при этом процентные значения потребления специфичны для представляющей интерес РНК, и при этом смесь сырья для подпитки доставляется в количестве, которое поддерживает общую концентрацию NTP в реакционной смеси выше нуля мМ,(b) feeding to the current IVT reaction mixture a make-up feed mixture over time that contains NTP, wherein each NTP is present in the feed mixture in a molar ratio based on a percentage consumption value calculated separately for each NTP, wherein the percentage consumption values are specific to the RNA of interest, and the feedstock mixture is delivered in an amount that maintains the total concentration of NTP in the reaction mixture above zero mM,
тем самым продуцируя представляющую интерес транскрибированную РНК.thereby producing the transcribed RNA of interest.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что NTP включают аденозинтрифосфат (ATP), цитидинтрифосфат (CTP), уридинтрифосфат (UTP) и гуанозинтрифосфат (GTP).13. The method of claim 12 wherein the NTPs include adenosine triphosphate (ATP), cytidine triphosphate (CTP), uridine triphosphate (UTP), and guanosine triphosphate (GTP).
14. Способ по п. 12, отличающийся тем, что исходная реакционная смесь (а) содержит соотношение [ATP]:[UTP] от 1:1 до 4:1, необязательно от 1:1 до 2:1, и/или соотношение [GTP]:[CTP] от 1:1 до 4:1.14. The method according to p. 12, characterized in that the initial reaction mixture (a) contains a ratio of [ATP]:[UTP] from 1:1 to 4:1, optionally from 1:1 to 2:1, and / or the ratio [GTP]:[CTP] 1:1 to 4:1.
15. Способ по п.12, отличающийся тем, что исходная реакционная смесь (а) содержит соотношение [ATP]:[UTP]:[CTP]:[GTP], составляющее 2:1:1:4.15. The method according to claim 12, characterized in that the initial reaction mixture (a) contains a ratio of [ATP]:[UTP]:[CTP]:[GTP] of 2:1:1:4.
16. Способ по п. 12, отличающийся тем, что каждый NTP в исходной реакционной смеси (a) присутствует в эквивалентном молярном соотношении, которое отличается от значения потребления в процентах (%), рассчитанного для каждого NTP.16. Method according to claim 12, characterized in that each NTP in the initial reaction mixture (a) is present in an equivalent molar ratio, which differs from the percentage (%) consumption value calculated for each NTP.
17. Способ по п. 12, отличающийся тем, что каждый NTP в исходной реакционной смеси (a) присутствует в эквимолярной концентрации для каждого NTP.17. The method according to claim 12, characterized in that each NTP in the initial reaction mixture (a) is present in an equimolar concentration for each NTP.
18. Способ по п. 12, отличающийся тем, что каждый NTP в исходной реакционной смеси (a) присутствует в концентрации 1-10 мМ, 1-6 мМ, 2-6 мМ или 3-6 мМ.18. The method according to p. 12, characterized in that each NTP in the initial reaction mixture (a) is present at a concentration of 1-10 mm, 1-6 mm, 2-6 mm or 3-6 mm.
19. Способ по п. 12, отличающийся тем, что концентрация каждого NTP в текущей реакционной смеси IVT поддерживается в диапазоне от 5% до 200%, 5-100%, 5-75%, 20-100%, 20-75% или 25-50% от соответствующей исходной концентрации NTP.19. The method according to claim 12, characterized in that the concentration of each NTP in the current IVT reaction mixture is maintained in the range from 5% to 200%, 5-100%, 5-75%, 20-100%, 20-75% or 25-50% of the corresponding initial concentration of NTP.
20. Способ по п. 12, отличающийся тем, что исходную реакционную смесь поддерживают при соотношении [ATP]:[UTP] от 1:1 до 4:1, необязательно от 1:1 до 2:1, и/или при соотношении [GTP]:[CTP] от 1:1 до 4:1.20. The method according to p. 12, characterized in that the initial reaction mixture is maintained at a ratio of [ATP]:[UTP] from 1:1 to 4:1, optionally from 1:1 to 2:1, and / or at a ratio of [ GTP]:[CTP] 1:1 to 4:1.
21. Способ по п. 12, отличающийся тем, что исходную реакционную смесь поддерживают при соотношении [ATP]:[UTP]:[CTP]:[GTP], составляющем 2:1:1:4.21. The method according to p. 12, characterized in that the initial reaction mixture is maintained at a ratio of [ATP]:[UTP]:[CTP]:[GTP] of 2:1:1:4.
22. Способ периодической реакции транскрипции in vitro (IVT) с подпиткой для представляющей интерес рибонуклеиновой кислоты (РНК), включающий:22. A fed-batch in vitro transcription reaction (IVT) method for a ribonucleic acid (RNA) of interest, comprising:
(а) проведение реакции IVT с исходной реакционной смесью, которая содержит дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), кодирующую представляющую интерес РНК, РНК-полимеразу и нуклеозидтрифосфаты (NTP), при этом NTP находятся в соотношении [ATP]:[UTP] 2:1 и в соотношении [GTP]:[CTP] 4:1; а также(a) performing an IVT reaction with an initial reaction mixture that contains deoxyribonucleic acid (DNA) encoding the RNA of interest, RNA polymerase, and nucleoside triphosphates (NTPs), wherein the NTPs are in a ratio of [ATP]:[UTP] 2:1, and in the ratio [GTP]:[CTP] 4:1; and
(b) подачу в текущую реакционную смесь IVT смеси сырья для подпитки с течением времени, которая содержит NTP, при этом каждый NTP присутствует в смеси сырья для подпитки в молярном соотношении, основанном на процентном значении потребления, рассчитанном отдельно для каждого NTP, при этом процентные значения потребления специфичны для представляющей интерес РНК, и при этом смесь сырья для подпитки доставляется в количестве, которое поддерживает соотношение [ATP]:[UTP], составляющее 2:1, и соотношение [GTP]:[CTP] составляющее 4:1,(b) feeding to the current IVT reaction mixture a make-up mixture over time that contains NTP, wherein each NTP is present in the make-up mixture in a molar ratio based on a percentage consumption value calculated separately for each NTP, wherein the percentages consumption values are specific to the RNA of interest, and the feedstock mixture is delivered in an amount that maintains a 2:1 [ATP]:[UTP] ratio and a 4:1 [GTP]:[CTP] ratio,
тем самым продуцируя представляющую интерес транскрибированную РНК.thereby producing the transcribed RNA of interest.
23. Способ по п. 12, отличающийся тем, что NTP представляют собой химически модифицированные NTP, встречающиеся в природе NTP или синтетические NTP.23. The method of claim 12, wherein the NTPs are chemically modified NTPs, naturally occurring NTPs, or synthetic NTPs.
24. Способ по п. 12, отличающийся тем, что смесь сырья для подпитки доставляют в текущую реакционную смесь IVT с применением непрерывной подпитки с течением времени.24. The method of claim. 12, characterized in that the feed mixture is delivered to the current IVT reaction mixture using continuous feed over time.
25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что смесь сырья для подпитки доставляют в текущую реакционную смесь IVT каждые 10-250 минут, необязательно каждые 20-200 минут.25. The process of claim 24, wherein the feed mixture is added to the current IVT reaction mixture every 10-250 minutes, optionally every 20-200 minutes.
26. Способ по п. 12, отличающийся тем, что смесь сырья для подпитки доставляют в текущую реакционную смесь IVT с применением непрерывной подпитки с течением времени.26. The method of claim. 12, characterized in that the feed mixture is delivered to the current IVT reaction mixture using continuous feed over time.
27. Способ по п. 26, отличающийся тем, что смесь сырья для подпитки доставляют в текущую реакционную смесь IVT при постоянной скорости потока 27. The method according to p. 26, characterized in that the feed mixture is delivered to the current IVT reaction mixture at a constant flow rate
(i) 2-8 мл/мин, необязательно 4-6 мл/мин; или (i) 2-8 ml/min, optionally 4-6 ml/min; or
(ii) 0,0030-0,007 мл/мин на мл исходного объема, необязательно 0,0040-0,0060 мл/мин на мл исходного объема.(ii) 0.0030-0.007 ml/min per ml of initial volume, optionally 0.0040-0.0060 ml/min per ml of initial volume.
28. Способ по п. 12, отличающийся тем, что каждый NTP в исходной реакционной смеси (a) присутствует в молярном соотношении, эквивалентном значению расхода в процентах (%), рассчитанному для каждого NTP.28. The method according to claim 12, characterized in that each NTP in the initial reaction mixture (a) is present in a molar ratio equivalent to the percentage (%) value calculated for each NTP.
29. Способ по п. 12, отличающийся тем, что общая концентрация NTP в текущей реакционной смеси IVT поддерживается выше нижнего предела 0,5 мМ, необязательно от 10 мМ до 20 мМ.29. The method of claim. 12, characterized in that the total concentration of NTP in the current IVT reaction mixture is maintained above the lower limit of 0.5 mm, optionally from 10 mm to 20 mm.
30. Способ по п. 12, отличающийся тем, что исходные и/или текущие реакционные смеси IVT дополнительно содержат аналог кэпа РНК.30. The method of claim 12, wherein the initial and/or current IVT reaction mixtures additionally contain an RNA cap analog.
31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что аналог кэпа РНК представляет собой химически модифицированный аналог кэпа РНК, встречающийся в природе аналог кэпа РНК или синтетический аналог кэпа РНК.31. The method of claim 30, wherein the RNA cap analog is a chemically modified RNA cap analog, a naturally occurring RNA cap analog, or a synthetic RNA cap analog.
32. Способ по п. 30, отличающийся тем, что аналог кэпа РНК представляет собой (i) аналог тринуклеотидного кэпа РНК, необязательно выбранный из аналогов тринуклеотидного кэпа, содержащих структуру Кэп 1, Кэп 2, Кэп 3 или Кэп 4, или (ii) аналог тетрануклеотидной кэпа РНК, необязательно выбранный из аналогов тринуклеотидного кэпа, содержащих структуру Кэп 5, Кэп 6, Кэп 7 или Кэп 8.32. The method of claim 30, wherein the RNA cap analog is (i) an RNA trinucleotide cap analog, optionally selected from trinucleotide cap analogs containing the structure Cap 1, Cap 2, Cap 3, or Cap 4, or (ii) an RNA tetranucleotide cap analog, optionally selected from trinucleotide cap analogs containing the structure Cap 5, Cap 6, Cap 7, or Cap 8.
33. Способ по п. 30, отличающийся тем, что исходная и текущая реакционные смеси IVT содержат соотношение [аналог кэпа РНК]:[пурин] от 1:1 до 20:1, от 1:1 до 15:1, от 1:1 до 10:1, от1:1 до 5:1, от 1:1 до 3:1 или от 1:1 до 2:1. 33. The method according to claim 30, characterized in that the initial and current IVT reaction mixtures contain a ratio of [RNA cap analogue]: [purine] from 1:1 to 20:1, from 1:1 to 15:1, from 1: 1 to 10:1, 1:1 to 5:1, 1:1 to 3:1, or 1:1 to 2:1.
34. Способ по п. 12, отличающийся тем, что выход транскрибированной РНК, представляющей интерес, больше, чем выход РНК, транскрибированной с помощью периодической реакции IVT.34. The method of claim 12, wherein the yield of the transcribed RNA of interest is greater than the yield of the RNA transcribed by the batch IVT reaction.
35. Способ по п. 34, отличающийся тем, что выход транскрибированной РНК, представляющей интерес, по меньшей мере на 100% больше, чем выход РНК, транскрибированной с помощью периодической реакции IVT.35. The method of claim 34, wherein the yield of the transcribed RNA of interest is at least 100% greater than the yield of the RNA transcribed by the batch IVT reaction.
36. Способ по п. 12, отличающийся тем, что выход транскрибированной РНК, представляющей интерес, превышает исходный реакционный объем больше чем на 5, 10, 15, 20, 25 или 30 мг/мл.36. The method according to claim 12, characterized in that the yield of transcribed RNA of interest exceeds the initial reaction volume by more than 5, 10, 15, 20, 25, or 30 mg/ml.
37. Способ по п. 12, отличающийся тем, что исходные и/или текущие реакционные смеси IVT дополнительно содержат буфер и/или магний.37. The method according to p. 12, characterized in that the initial and / or current IVT reaction mixtures additionally contain a buffer and / or magnesium.
38. Способ по п. 37, отличающийся тем, что буфер представляет собой трис-HCl, необязательно при этом буфер представляет собой от 20 до 60 мМ трис-HCl, необязательно при этом буфер представляет собой 40 мМ трис-HCl.38. The method according to p. 37, characterized in that the buffer is Tris-HCl, optionally, the buffer is from 20 to 60 mm Tris-HCl, optionally, the buffer is 40 mm Tris-HCl.
39. Способ по п. 30, отличающийся тем, что по меньшей мере 90%, необязательно по меньшей мере 95% представляющей интерес транскрибированной РНК содержит аналог кэпа РНК.39. The method of claim 30 wherein at least 90%, optionally at least 95% of the transcribed RNA of interest contains an RNA cap analog.
40. Способ по п. 30, отличающийся тем, что соотношение аналога кэпа к ATP или соотношение аналога кэпа к GTP больше 0,6, и по меньшей мере 90% представляющей интерес транскрибированной РНК содержит аналог кэпа.40. The method of claim 30 wherein the ratio of cap analog to ATP or the ratio of cap analog to GTP is greater than 0.6 and at least 90% of the transcribed RNA of interest contains the cap analog.
41. Способ по п. 39, отличающийся тем, что транскрибированная РНК, представляющая интерес, имеет длину по меньшей мере 2000 нуклеотидов.41. The method of claim 39, wherein the transcribed RNA of interest is at least 2000 nucleotides in length.
42. Способ по п. 30, отличающийся тем, что по меньшей мере 90% транскрибированной РНК, представляющей интерес, содержит аналог кэпа РНК на 180-й минуте и/или на 360-й минуте реакции IVT.42. The method of claim 30 wherein at least 90% of the transcribed RNA of interest contains an RNA cap analog at 180 minutes and/or 360 minutes of the IVT reaction.
43. Способ по п. 12, отличающийся тем, что исходные и/или текущие реакционные смеси IVT не дополняются аналогом кэпа РНК во время реакции IVT.43. The method of claim 12, wherein the initial and/or current IVT reaction mixtures are not supplemented with an RNA cap analog during the IVT reaction.
44. Способ по п. 12, отличающийся тем, что концентрация ДНК в исходной реакционной смеси составляет 0,025-0,075 мг/мл, необязательно 0,05 мг/мл.44. The method according to claim 12, characterized in that the concentration of DNA in the initial reaction mixture is 0.025-0.075 mg/ml, optionally 0.05 mg/ml.
45. Способ по п. 12, отличающийся тем, что концентрация ДНК поддерживается на уровне выше 0,01 мг/мл во время реакции IVT, необязательно 0,01-0,05 мг/мл.45. The method of claim 12, wherein the DNA concentration is maintained above 0.01 mg/mL during the IVT reaction, optionally 0.01-0.05 mg/mL.
46. Способ по п. 12, отличающийся тем, что молярное соотношение транскрибированной РНК, представляющей интерес, к ДНК в реакции IVT, по меньшей мере в 2 раза или по меньшей мере в 3 раза больше, чем молярное соотношение транскрибированной РНК к ДНК в контрольном периодическом способе без подпитки.46. The method according to claim 12, characterized in that the molar ratio of transcribed RNA of interest to DNA in the IVT reaction is at least 2 times or at least 3 times greater than the molar ratio of transcribed RNA to DNA in the control intermittently without feeding.
47. Способ по п. 23, отличающийся тем, что UTP представляет собой модифицированный UTP, выбранный из 1-метилпсевдоуридина и 1-этилпсевдоуридина.47. The method of claim 23 wherein the UTP is a modified UTP selected from 1-methylpseudouridine and 1-ethylpseudouridine.
48. Способ по п. 12, отличающийся тем, что транскрибированная РНК, представляющая интерес, представляет собой информационную РНК (мРНК).48. The method of claim 12, wherein the transcribed RNA of interest is messenger RNA (mRNA).
49. Способ по п. 12, отличающийся тем, что транскрибированная РНК, представляющая интерес, имеет длину более 100 нуклеотидов.49. The method of claim 12, wherein the transcribed RNA of interest is greater than 100 nucleotides in length.
50. Способ по п. 12, отличающийся тем, что общее время реакции IVT составляет 150-1000 минут.50. The method according to claim 12, characterized in that the total IVT reaction time is 150-1000 minutes.
51. Способ по п. 12, отличающийся тем, что по меньшей мере 50% или по меньшей мере 70% транскрибированной РНК, представляющей интерес, содержит полиА-хвост на 420-й минуте реакции IVT.51. The method of claim 12 wherein at least 50% or at least 70% of the transcribed RNA of interest contains a polyA tail at 420 minutes of the IVT reaction.
52. Способ по п. 51, отличающийся тем, что полиА хвост представляет собой A100полиА хвост.52. The method of claim 51 wherein the polyA tail is an A 100 polyA tail.
53. Способ по п. 30, отличающийся тем, что исходная реакционная смесь включает концентрацию аналога кэпа РНК, которая по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на 20% превышает концентрацию NTP, присутствующего в первом кодирующем положении РНК, представляющей интерес.53. The method of claim 30, wherein the initial reaction mixture comprises an RNA cap analog concentration that is at least 10% or at least 20% greater than the concentration of NTP present at the first coding position of the RNA of interest.
54. Способ по п. 53, отличающийся тем, что NTP, присутствующий в первом кодирующем положении РНК, представляющей интерес, представляет собой ATP или GTP. 54. The method of claim 53, wherein the NTP present at the first coding position of the RNA of interest is ATP or GTP.
55. Способ по п. 12, отличающийся тем, что РНК-полимераза представляет собой РНК-полимеразу T7.55. The method of claim 12, wherein the RNA polymerase is T7 RNA polymerase.
56. Способ по п. 55, отличающийся тем, что РНК-полимераза Т7 содержит дополнительный глицин на С-конце относительно РНК-полимеразы Т7 дикого типа.56. The method of claim 55 wherein the T7 RNA polymerase contains an additional glycine at the C-terminus relative to the wild-type T7 RNA polymerase.
57. Способ по п. 55, отличающийся тем, что РНК-полимераза Т7 содержит замену G47A относительно РНК-полимеразы Т7 дикого типа.57. The method of claim 55, wherein the T7 RNA polymerase contains a G47A substitution relative to wild-type T7 RNA polymerase.
58. Способ по п. 55, отличающийся тем, что РНК-полимераза Т7 содержит замену G47A и дополнительный глицин на С-конце относительно РНК-полимеразы Т7 дикого типа.58. The method of claim 55, wherein the T7 RNA polymerase contains a G47A substitution and an additional glycine at the C-terminus relative to wild-type T7 RNA polymerase.
59. Способ по п. 30, отличающийся тем, что аналог кэпа РНК представляет собой динуклеотидный кэп, тринуклеотидный кэп или тетрануклеотидный кэп.59. The method of claim 30, wherein the RNA cap analog is a dinucleotide cap, a trinucleotide cap, or a tetranucleotide cap.
60. Способ по п. 59, отличающийся тем, что аналог кэпа РНК содержит тринуклеотидную последовательность GAG, необязательно GpppA2ʽOmepG.60. The method of claim 59, wherein the RNA cap analog contains a GAG trinucleotide sequence, optionally GpppA 2 ʽ Ome pG.
61. Способ по п. 60, отличающийся тем, что аналог кэпа РНК содержит тетрануклеотидную последовательность GGAG.61. The method of claim 60, wherein the RNA cap analog contains the GGAG tetranucleotide sequence.
62. Способ по п. 12, дополнительно включающий выделение транскрибированной РНК, представляющей интерес.62. The method of claim 12, further comprising isolating the transcribed RNA of interest.
63. Представляющая интерес РНК, выделенная посредством способа по п. 62.63. RNA of interest isolated by the method of claim 62.
64. Рибонуклеиновая кислота (РНК), полученная посредством способа по п. 12.64. Ribonucleic acid (RNA) obtained by the method of claim 12.
65. РНК по п. 63, составленная в виде наночастицы катионного липида, необязательно, при этом указанная наночастица катионного липида содержит молярное соотношение 20-60% ионизируемого катионного липида, 5-25% некатионного липида, 25-55% стерола и 0,5-15% PEG-модифицированных липидов.65. RNA according to claim 63, formulated as a cationic lipid nanoparticle, optionally, said cationic lipid nanoparticle contains a molar ratio of 20-60% ionizable cationic lipid, 5-25% non-cationic lipid, 25-55% sterol and 0.5 -15% PEG-modified lipids.