Claims (138)
1. Способ определения субпопуляции клеток, имеющей биологический признак, причем способ включает:1. A method for determining a subpopulation of cells having a biological trait, the method comprising:
(a) обеспечение библиотеки секвенирования одиночных клеток,(a) providing a single cell sequencing library,
причем библиотека секвенирования содержит множество модифицированных целевых нуклеиновых кислот, wherein the sequencing library contains a plurality of modified target nucleic acids,
при этом модифицированные целевые нуклеиновые кислоты содержат по меньшей мере одну индексную последовательность; wherein the modified target nucleic acids contain at least one index sequence;
(b) анализ библиотеки секвенирования с помощью прицельного секвенирования для определения индексных последовательностей, которые присутствуют на той же модифицированной целевой нуклеиновой кислоте, что и биологический признак,(b) analyzing the sequencing library by targeted sequencing to determine index sequences that are present on the same modified target nucleic acid as the biological trait,
причем индексные последовательности, связанные с биологическим признаком, представляют собой маркерные индексные последовательности;wherein the index sequences associated with the biological trait are marker index sequences;
(c) изменение библиотеки секвенирования для получения подбиблиотеки,(c) changing the sequencing library to obtain a sub-library,
при этом подбиблиотека содержит увеличенное представительство модифицированных целевых нуклеиновых кислот, содержащих маркерные индексные последовательности, по сравнению с другими модифицированными целевыми нуклеиновыми кислотами, присутствующими в библиотеке секвенирования, которые не содержат маркерную индексную последовательность;wherein the sub-library contains an increased representation of modified target nucleic acids containing marker index sequences compared to other modified target nucleic acids present in the sequencing library that do not contain a marker index sequence;
(d) определение нуклеотидной последовательности модифицированных целевых нуклеиновых кислот, содержащих маркерную индексную последовательность.(d) determining the nucleotide sequence of the modified target nucleic acids containing the marker index sequence.
2. Способ по п. 1, в котором библиотека секвенирования одиночных клеток содержит нуклеиновые кислоты из множества образцов.2. The method of claim 1, wherein the single cell sequencing library contains nucleic acids from a plurality of samples.
3. Способ по п. 2, в котором множество образцов содержит (i) образцы одной и той же ткани, полученной из разных организмов, (ii) образцы разных тканей из одного организма или (iii) образцы разных тканей из разных организмов.3. The method of claim 2, wherein the plurality of samples comprises (i) samples of the same tissue from different organisms, (ii) different tissue samples from the same organism, or (iii) different tissue samples from different organisms.
4. Способ по п. 1, в котором на стадии (b) определяют более одной маркерной индексной последовательности.4. The method of claim 1, wherein more than one marker index sequence is determined in step (b).
5. Способ по п. 1, в котором комбинаторная библиотека секвенирования одиночных клеток содержит целевые нуклеиновые кислоты, представляющие весь геном клеток или ядер или подгруппу генома.5. The method of claim 1, wherein the combinatorial single cell sequencing library contains target nucleic acids representing the entire genome of the cells or nuclei or a subset of the genome.
6. Способ по п. 5, в котором подгруппа генома содержит целевые нуклеиновые кислоты, представляющие транскриптом, доступный хроматин, ДНК, конформационное состояние или белки клеток или ядер.6. The method of claim 5, wherein the genome subgroup contains target nucleic acids representing the transcriptome, accessible chromatin, DNA, conformational state, or proteins of cells or nuclei.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором изменение предусматривает обогащение модифицированных целевых нуклеиновых кислот, содержащих маркерные индексные последовательности.7. The method according to any one of paragraphs. 1-6, in which the change involves the enrichment of modified target nucleic acids containing marker index sequences.
8. Способ по п. 7, в котором обогащение включает способ на основе гибридизации.8. The method of claim 7 wherein the enrichment comprises a hybridization based method.
9. Способ по п. 8, в котором способ на основе гибридизации включает гибридный захват, амплификацию или короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (CRISPR) (d)Cas9.9. The method of claim 8, wherein the hybridization-based method comprises hybrid capture, amplification, or regularly arrayed short palindromic repeats (CRISPR) (d)Cas9.
10. Способ по любому из п. 9, в котором изменение предусматривает истощение модифицированных целевых нуклеиновых кислот, которые не содержат маркерных индексных последовательностей.10. The method of any one of claim 9, wherein the change comprises depleting modified target nucleic acids that do not contain marker index sequences.
11. Способ по п. 10, в котором истощение предусматривает способ на основе гибридизации.11. The method of claim 10 wherein the depletion comprises a hybridization based method.
12. Способ по п. 11, в котором способ на основе гибридизации включает гибридный захват, амплификацию или CRISPR (d)Cas9.12. The method of claim 11, wherein the hybridization-based method comprises hybrid capture, amplification, or CRISPR (d)Cas9.
13. Способ по п. 1, в котором биологический признак включает нуклеотидную последовательность, указывающую на видовой тип.13. The method of claim 1, wherein the biological feature includes a nucleotide sequence indicating the species type.
14. Способ по п. 13, в котором видовой тип включает вид клетки.14. The method of claim 13, wherein the species type includes the cell type.
15. Способ по п. 14, в котором биологический признак включает нуклеотиды субъединицы 16s, субъединицы 18s или нетранскрипционную область ITS.15. The method of claim 14, wherein the biological feature comprises 16s subunit nucleotides, 18s subunit nucleotides, or an ITS non-transcriptional region.
16. Способ по п. 1, в котором биологический признак включает нуклеотидную последовательность, указывающую на класс клеток.16. The method of claim 1, wherein the biological feature includes a nucleotide sequence indicative of a cell class.
17. Способ по п. 16, в котором класс клеток имеет паттерн экспрессии, эпигенетический паттерн, рекомбинацию иммунных генов или их комбинацию.17. The method of claim 16, wherein the cell class has an expression pattern, an epigenetic pattern, immune gene recombination, or a combination thereof.
18. Способ по п. 17, в котором эпигенетический паттерн содержит метку метилирования, паттерн метилирования, доступную ДНК или их комбинацию.18. The method of claim 17, wherein the epigenetic pattern contains a methylation mark, a methylation pattern, available DNA, or a combination thereof.
19. Способ по п. 1, в котором биологический признак включает нуклеотидную последовательность, указывающую на состояние или риск заболевания.19. The method of claim 1, wherein the biological feature comprises a nucleotide sequence indicative of a disease condition or risk.
20. Способ по п. 19, в котором состояние или риск заболевания включает вариантную последовательность ДНК, вариантный паттерн экспрессии или вариантный эпигенетический паттерн, который коррелирует с заболеванием.20. The method of claim 19, wherein the disease condition or risk comprises a variant DNA sequence, a variant expression pattern, or a variant epigenetic pattern that correlates with the disease.
21. Способ по п. 20, в котором вариантная последовательность ДНК содержит по меньшей мере один однонуклеотидный полиморфизм.21. The method of claim 20, wherein the variant DNA sequence contains at least one single nucleotide polymorphism.
22. Способ по п. 21, в котором вариантный паттерн экспрессии предусматривает экспрессию биомаркера.22. The method of claim 21, wherein the variant expression pattern provides for the expression of a biomarker.
23. Способ по п. 22, в котором вариантный эпигенетический паттерн включает метку метилирования, паттерн метилирования.23. The method of claim 22, wherein the variant epigenetic pattern includes a methylation mark, a methylation pattern.
24. Способ по п. 1, в котором модифицированные целевые нуклеиновые кислоты содержат связный индекс по меньшей мере 2 специфических для компартмента индексных последовательностей, причем между 2 индексными последовательностями имеется не более 6 нуклеотидов.24. The method of claim 1, wherein the modified target nucleic acids comprise a linking index of at least 2 compartment-specific index sequences, with no more than 6 nucleotides between the 2 index sequences.
25. Способ по п. 24, в котором связный индекс присутствует на каждом конце модифицированных целевых нуклеиновых кислот.25. The method of claim 24 wherein the linking index is present at each end of the modified target nucleic acids.
26. Способ по п. 24 или 25, в котором длина связного индекса составляет по меньшей мере 55 нуклеотидов.26. The method of claim 24 or 25, wherein the linked index is at least 55 nucleotides long.
27. Способ по любому из пп. 24-26, в котором на модифицированных целевых нуклеиновых кислотах присутствует одна копия связного индекса.27. The method according to any one of paragraphs. 24-26, in which one copy of the linked index is present on the modified target nucleic acids.
28. Способ по любому из пп. 24-26, в котором на модифицированных целевых нуклеиновых кислотах присутствуют две копии связного индекса.28. The method according to any one of paragraphs. 24-26, in which two copies of the linked index are present on the modified target nucleic acids.
29. Способ по п. 1, в котором множество модифицированных целевых нуклеиновых кислот из библиотеки секвенирования представляет по меньшей мере 100 000 различных клеток или ядер.29. The method of claim 1, wherein the set of modified target nucleic acids from the sequencing library is at least 100,000 distinct cells or nuclei.
30. Способ по п. 1, в котором обеспечение комбинаторной библиотеки секвенирования одиночных клеток включает:30. The method of claim 1, wherein providing a combinatorial single cell sequencing library comprises:
обработку образца для получения библиотеки, причем образец представляет собой метагеномический образец, полученный из организма.processing the sample to obtain a library, and the sample is a metagenomic sample obtained from the organism.
31. Способ по п. 30, в котором организм представляет собой млекопитающее.31. The method of claim 30 wherein the organism is a mammal.
32. Способ по п. 30 или 31, в котором метагеномический образец содержит ткань, предположительно содержащую симбиотический или патогенный микроорганизм.32. The method of claim 30 or 31, wherein the metagenomic sample contains tissue suspected of containing a commensal or pathogenic microorganism.
33. Способ по п. 32, в котором микроорганизм является прокариотическим или эукариотическим.33. The method of claim 32, wherein the microorganism is prokaryotic or eukaryotic.
34. Способ по любому из пп. 30, 31 или 33, в котором метагеномический образец содержит образец микробиома.34. The method according to any one of paragraphs. 30, 31, or 33, wherein the metagenomic sample contains a microbiome sample.
35. Способ по п. 1, в котором обеспечение комбинаторной библиотеки секвенирования одиночных клеток включает обработку образца для обеспечения библиотеки, причем образец получен из организма.35. The method of claim 1, wherein providing a combinatorial single cell sequencing library comprises processing a sample to provide the library, wherein the sample is derived from an organism.
36. Способ по п. 35, в котором организм представляет собой млекопитающее.36. The method of claim 35, wherein the organism is a mammal.
37. Способ по п. 35, в котором первичный источник нуклеиновых кислот из образца содержит РНК.37. The method of claim 35, wherein the primary source of nucleic acids from the sample contains RNA.
38. Способ по п. 37, в котором РНК предусматривает мРНК.38. The method of claim 37 wherein the RNA provides mRNA.
39. Способ по п. 35, в котором первичный источник нуклеиновых кислот из образца содержит ДНК.39. The method of claim 35, wherein the primary source of nucleic acids from the sample contains DNA.
40. Способ по п. 39, в котором ДНК предусматривает геномную ДНК всей клетки.40. The method of claim 39, wherein the DNA comprises the genomic DNA of the entire cell.
41. Способ по п. 40, в котором геномная ДНК всей клетки содержит нуклеосомы.41. The method of claim 40, wherein the genomic DNA of the entire cell contains nucleosomes.
42. Способ по п. 35, в котором первичный источник нуклеиновых кислот из образца содержит бесклеточную ДНК.42. The method of claim 35, wherein the primary source of nucleic acids from the sample contains cell-free DNA.
43. Способ по п. 35, в котором образец содержит раковые клетки.43. The method of claim 35, wherein the sample contains cancer cells.
44. Способ по п. 1, в котором обеспечение комбинаторной библиотеки секвенирования одиночных клеток включает получение библиотеки методом комбинаторного индексирования одиночных клеток, выбранным из секвенирования транскриптома одиночных ядер, секвенирования транскриптома одиночных клеток, секвенирования транскриптома одиночных клеток и хроматина, доступного транспозонам, полногеномного секвенирования одиночных ядер, секвенирования одиночных ядер хроматина, доступного транспозонам, секвенирования эпитопа одиночных клеток, sci-HiC и sci-MET.44. The method of claim 1, wherein providing a combinatorial single cell sequencing library comprises obtaining a library by a combinatorial single cell indexing method selected from single nuclear transcriptome sequencing, single cell transcriptome sequencing, single cell transcriptome sequencing and transposon accessible chromatin, whole genome single cell sequencing. nuclei, sequencing of single nuclei of transposon-accessible chromatin, single cell epitope sequencing, sci-HiC and sci-MET.
45. Способ по п. 44, в котором обеспечение включает обеспечение из каждой клетки или ядра двух разных комбинаторных библиотек секвенирования одиночных клеток.45. The method of claim 44, wherein providing includes providing from each cell or nucleus two different combinatorial single cell sequencing libraries.
46. Способ по п. 45, в котором две разные комбинаторные библиотеки секвенирования одиночных клеток выбраны из метода комбинаторного индексирования одиночных клеток, выбранного из секвенирования транскриптома одиночных ядер, секвенирования транскриптома одиночных клеток, секвенирования транскриптома одиночных клеток и хроматина, доступного транспозонам, полногеномного секвенирования одиночных ядер, секвенирования одиночных ядер хроматина, доступного транспозонам, sci-HiC и sci-MET.46. The method of claim 45, wherein the two different combinatorial single cell sequencing libraries are selected from a combinatorial single cell indexing method selected from single nuclear transcriptome sequencing, single cell transcriptome sequencing, single cell transcriptome sequencing and transposon accessible chromatin, whole genome single cell sequencing. nuclei, sequencing of single nuclei of chromatin accessible to transposons, sci-HiC and sci-MET.
47. Способ по п. 1, дополнительно включающий выполнение процедуры секвенирования для определения нуклеотидных последовательностей для нуклеиновых кислот.47. The method of claim 1, further comprising performing a sequencing procedure to determine nucleotide sequences for the nucleic acids.
48. Способ получения библиотеки секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты из множества одиночных ядер или клеток, причем способ включает:48. A method for obtaining a sequencing library containing nucleic acids from a plurality of single nuclei or cells, the method comprising:
(a) обеспечение множества ядер или клеток, причем ядра или клетки содержат нуклеосомы;(a) providing a plurality of nuclei or cells, wherein the nuclei or cells contain nucleosomes;
(b) приведение множества ядер или клеток в контакт с транспосомным комплексом, содержащим транспозазу и универсальную последовательность, причем приведение в контакт дополнительно включает условия, подходящие для встраивания универсальной последовательности в нуклеиновые кислоты ДНК, что приводит к образованию двухцепочечных нуклеиновых кислот ДНК, содержащих универсальную последовательность;(b) bringing a plurality of nuclei or cells into contact with a transposome complex containing a transposase and a universal sequence, the contact further comprising conditions suitable for inserting the universal sequence into DNA nucleic acids, resulting in the formation of double-stranded DNA nucleic acids containing the universal sequence ;
(d) распределение множества ядер или клеток в первое множество компартментов,(d) distributing a plurality of nuclei or cells into a first plurality of compartments,
причем каждый компартмент содержит подгруппу ядер или клеток; wherein each compartment contains a subgroup of nuclei or cells;
(e) процессинг молекул ДНК в каждой подгруппе ядер или клеток для создания индексированных ядер или клеток,(e) processing DNA molecules in each subgroup of nuclei or cells to create indexed nuclei or cells,
причем процессинг предусматривает добавление к нуклеиновым кислотам ДНК, присутствующим в каждой подгруппе ядер или клеток, индексной последовательности, специфичной для первого компартмента, с получением индексированных нуклеиновых кислот, присутствующих в индексированных ядрах или клетках,moreover, the processing involves adding to the nucleic acids of DNA present in each subgroup of nuclei or cells, an index sequence specific for the first compartment, to obtain indexed nucleic acids present in the indexed nuclei or cells,
при этом процессинг предусматривает лигирование, достройку праймера, гибридизацию, амплификацию или их комбинацию; иwherein the processing involves ligation, primer extension, hybridization, amplification, or a combination thereof; And
(g) объединение индексированных ядер или клеток для получения объединенных индексированных ядер или клеток.(g) combining indexed nuclei or cells to obtain combined indexed nuclei or cells.
49. Способ по п. 48, в котором обеспечение включает обеспечение множества ядер или клеток во множестве компартментов, причем каждый компартмент содержит подгруппу ядер или клеток, причем приведение в контакт предусматривает приведение каждого компартмента в контакт с транспосомным комплексом, и при этом способ дополнительно включает объединение ядер или клеток после приведения в контакт с образованием объединенных ядер или клеток.49. The method of claim 48, wherein providing includes providing a plurality of nuclei or cells in a plurality of compartments, each compartment containing a subgroup of nuclei or cells, wherein the contacting involves bringing each compartment into contact with a transposome complex, and the method further comprising the union of nuclei or cells after bringing into contact with the formation of the combined nuclei or cells.
50. Способ по п. 48, в котором обеспечение включает подвергание ядер химической обработке с образованием ядер с истощенными нуклеосомами и сохранением при этом целостности выделенных ядер.50. The method of claim. 48, wherein providing includes subjecting the nuclei to chemical processing with the formation of nuclei with depleted nucleosomes while maintaining the integrity of the isolated nuclei.
51. Способ по п. 48, дополнительно включающий:51. The method of claim 48, further comprising:
распределение объединенных индексированных ядер или клеток, содержащих индексированные ядра или клетки, во второе множество компартментов,distribution of the combined indexed nuclei or cells containing indexed nuclei or cells into a second set of compartments,
причем каждый компартмент содержит подгруппу ядер или клеток;wherein each compartment contains a subgroup of nuclei or cells;
процессинг молекул ДНК в каждой подгруппе ядер или клеток для получения ядер или клеток с двойным индексированием,processing of DNA molecules in each subgroup of nuclei or cells to obtain nuclei or cells with double indexing,
причем процессинг предусматривает добавление к нуклеиновым кислотам ДНК, присутствующим в каждой подгруппе ядер или клеток, индексной последовательности, специфичной для второго компартмента, с получением нуклеиновых кислот с двойным индексированием, присутствующих в индексированных ядрах или клетках,moreover, the processing involves adding to the DNA nucleic acids present in each subgroup of nuclei or cells, an index sequence specific for the second compartment, to obtain double-indexed nucleic acids present in the indexed nuclei or cells,
при этом процессинг предусматривает лигирование, достройку праймера, гибридизацию, амплификацию или их комбинацию;wherein the processing involves ligation, primer extension, hybridization, amplification, or a combination thereof;
объединение ядер или клеток с двойным индексированием для получения объединенных ядер или клеток с двойным индексированием.combining nuclei or cells with double indexing to obtain combined nuclei or cells with double indexing.
52. Способ по п. 51, дополнительно включающий:52. The method of claim 51, further comprising:
распределение объединенных ядер или клеток, содержащих ядра или клетки с двойным индексированием, в третье множество компартментов,distributing pooled nuclei or cells containing nuclei or cells with double indexing into a third set of compartments,
причем каждый компартмент содержит подгруппу ядер или клеток;wherein each compartment contains a subgroup of nuclei or cells;
процессинг молекул ДНК в каждой подгруппе ядер или клеток с образованием ядер или клеток с тройным индексированием,processing of DNA molecules in each subgroup of nuclei or cells with the formation of nuclei or cells with triple indexing,
причем процессинг предусматривает добавление к нуклеиновым кислотам ДНК, присутствующим в каждой подгруппе ядер или клеток, индексной последовательности, специфичной для третьего компартмента, с получением нуклеиновых кислот с тройным индексированием, присутствующих в индексированных ядрах или клетках,moreover, the processing involves adding to the DNA nucleic acids present in each subgroup of nuclei or cells, an index sequence specific for the third compartment, to obtain triple-indexed nucleic acids present in the indexed nuclei or cells,
при этом процессинг предусматривает лигирование, достройку праймера, гибридизацию, амплификацию или их комбинацию;wherein the processing involves ligation, primer extension, hybridization, amplification, or a combination thereof;
объединение ядер или клеток с тройным индексированием для получения объединенных ядер или клеток с тройным индексированием.combining nuclei or cells with triple indexing to obtain pooled nuclei or cells with triple indexing.
53. Способ по любому из пп. 48, 51 или 52, в котором стадия распределения включает разведение.53. The method according to any one of paragraphs. 48, 51, or 52, wherein the distribution step includes dilution.
54. Способ по любому из пп. 48, 51 или 52, в котором компартмент содержит лунку, микрожидкостный компартмент или каплю.54. The method according to any one of paragraphs. 48, 51 or 52, in which the compartment contains a well, a microfluidic compartment, or a drop.
55. Способ по п. 48, в котором компартменты из первого множества компартментов содержат от 50 до 100 000 000 ядер или клеток.55. The method of claim 48, wherein the compartments of the first plurality of compartments contain from 50 to 100,000,000 nuclei or cells.
56. Способ по п. 51, в котором компартменты из второго множества компартментов содержат от 50 до 100 000 000 ядер или клеток.56. The method of claim 51, wherein the compartments of the second plurality of compartments contain from 50 to 100,000,000 nuclei or cells.
57. Способ по п. 52, в котором компартменты из третьего множества компартментов содержат от 50 до 100 000 000 ядер или клеток.57. The method of claim 52, wherein the compartments of the third set of compartments contain from 50 to 100,000,000 nuclei or cells.
58. Способ по п. 48, в котором приведение в контакт включает приведение каждой подгруппы в контакт с двумя транспосомными комплексами, причем один транспосомный комплекс содержит первую транспозазу, содержащую первую универсальную последовательность, а второй транспосомный комплекс содержит вторую транспозазу, содержащую вторую универсальную последовательность, при этом приведение в контакт дополнительно включает условия, подходящие для встраивания первой универсальной последовательности и второй универсальной последовательности в нуклеиновые кислоты ДНК, приводящего к образованию двухцепочечных нуклеиновых кислот ДНК, содержащих первую и вторую универсальные последовательности.58. The method according to p. 48, in which bringing into contact includes bringing each subgroup into contact with two transposome complexes, wherein one transposome complex contains a first transposase containing a first universal sequence, and the second transposome complex contains a second transposase containing a second universal sequence, wherein the contacting further comprises conditions suitable for inserting the first universal sequence and the second universal sequence into DNA nucleic acids, resulting in the formation of double-stranded DNA nucleic acids comprising the first and second universal sequences.
59. Способ по любому из пп. 48, 49 или 50, в котором добавление специфичной для компартмента индексной последовательности включает двухстадийный процесс добавления к нуклеиновым кислотам нуклеотидной последовательности, содержащей универсальную последовательность, и последующее добавление специфичной для компартмента индексной последовательности к нуклеиновым кислотам.59. The method according to any one of paragraphs. 48, 49, or 50, wherein the addition of a compartment-specific index sequence comprises a two-step process of adding a nucleotide sequence containing the universal sequence to the nucleic acids and then adding the compartment-specific index sequence to the nucleic acids.
60. Способ по п. 48, дополнительно включающий получение индексированных нуклеиновых кислот из объединенных индексированных ядер или клеток с образованием, таким образом, библиотеки секвенирования из множества ядер или клеток.60. The method of claim 48, further comprising obtaining indexed nucleic acids from the pooled indexed nuclei or cells, thereby forming a sequencing library from a plurality of nuclei or cells.
61. Способ по п. 49, дополнительно включающий получение нуклеиновых кислот с двойным индексированием из объединенных ядер или клеток с двойным индексированием с образованием, таким образом, библиотеки секвенирования из множества ядер или клеток.61. The method of claim 49, further comprising obtaining dual indexed nucleic acids from pooled nuclei or double indexed cells, thereby forming a sequencing library from a plurality of nuclei or cells.
62. Способ по п. 50, дополнительно включающий получение нуклеиновых кислот с тройным индексированием из объединенных ядер или клеток с тройным индексированием с образованием, таким образом, библиотеки секвенирования из множества ядер или клеток.62. The method of claim 50, further comprising generating triple indexed nucleic acids from pooled nuclei or triple indexed cells, thereby forming a sequencing library from a plurality of nuclei or cells.
63. Способ по любому из пп. 60-62, дополнительно включающий:63. The method according to any one of paragraphs. 60-62, further comprising:
обеспечение поверхности, содержащей множество сайтов амплификации,providing a surface containing a plurality of amplification sites,
причем сайты амплификации содержат по меньшей мере две популяции присоединенных одноцепочечных захватных олигонуклеотидов, имеющих свободный 3’-конец, иmoreover, the amplification sites contain at least two populations of attached single-stranded capture oligonucleotides having a free 3'-end, and
приведение поверхности, содержащей сайты амплификации, в контакт с фрагментами нуклеиновой кислоты, содержащими одну, две или три индексных последовательности, в условиях, подходящих для получения множества сайтов амплификации, каждый из которых содержит клональную популяцию ампликонов из отдельного фрагмента, содержащего множество индексов.bringing the surface containing the amplification sites into contact with nucleic acid fragments containing one, two or three index sequences, under conditions suitable for obtaining a plurality of amplification sites, each of which contains a clonal population of amplicons from a separate fragment containing a plurality of indices.
64. Способ получения библиотеки нуклеиновых кислот, включающий:64. A method for obtaining a library of nucleic acids, including:
(a) обеспечение множества образцов, причем каждый образец содержит множество клеток или ядер, при этом множество клеток или ядер каждого образца находится в одном или более отдельных компартментах;(a) providing a plurality of samples, each sample containing a plurality of cells or nuclei, wherein the plurality of cells or nuclei of each sample are in one or more distinct compartments;
(b) приведение множества ядер или клеток в контакт с транспосомным комплексом, содержащим транспозазу и универсальную последовательность, и при условии, что транспосомный комплекс не содержит индексной последовательности, причем приведение в контакт дополнительно предусматривает условия, подходящие для встраивания универсальной последовательности в нуклеиновые кислоты;(b) bringing a plurality of nuclei or cells into contact with a transposome complex containing a transposase and a universal sequence, and provided that the transposome complex does not contain an index sequence, the contact further providing conditions suitable for embedding the universal sequence into nucleic acids;
(c) добавление первой индексной последовательности к нуклеиновым кислотам каждого отдельного компартмента;(c) adding a first index sequence to the nucleic acids of each individual compartment;
(d) объединение клеток или ядер разделенных компартментов;(d) joining cells or nuclei of separated compartments;
(e) распределение клеток или ядер во множество компартментов; и(e) distribution of cells or nuclei into multiple compartments; And
(f) добавление второй индексной последовательности к нуклеиновым кислотам множества компартментов.(f) adding a second index sequence to nucleic acids of multiple compartments.
65. Способ по п. 64, в котором первую индексную последовательность, вторую индексную последовательность или их комбинацию добавляют путем лигирования, достройки праймера, гибридизации, амплификации или их комбинации.65. The method of claim 64, wherein the first index sequence, the second index sequence, or a combination thereof is added by ligation, primer extension, hybridization, amplification, or combinations thereof.
66. Способ по п. 64 или 65, в котором стадии (d)-(e) повторяют для добавления третьей или более индексных последовательностей к клеткам или ядрам множества компартментов.66. The method of claim 64 or 65, wherein steps (d)-(e) are repeated to add a third or more index sequences to cells or nuclei of multiple compartments.
67. Способ по любому из пп. 64 или 65, в котором множество ядер или клеток зафиксированы.67. The method according to any one of paragraphs. 64 or 65, in which a plurality of nuclei or cells are fixed.
68. Способ по любому из пп. 64 или 65, дополнительно включающий амплификацию индексированных нуклеиновых кислот после стадии (c) или стадии (f).68. The method according to any one of paragraphs. 64 or 65, further comprising amplifying the indexed nucleic acids after step (c) or step (f).
69. Способ по любому из пп. 64 или 65, дополнительно включающий стадию (g) объединения нуклеиновых кислот из множества компартментов и определения последовательности нуклеиновых кислот.69. The method according to any one of paragraphs. 64 or 65, further comprising the step of (g) combining nucleic acids from multiple compartments and determining the nucleic acid sequence.
70. Способ по п. 64, дополнительно включающий выполнение процедуры секвенирования для определения нуклеотидных последовательностей для нуклеиновых кислот.70. The method of claim 64, further comprising performing a sequencing procedure to determine nucleotide sequences for the nucleic acids.
71. Способ секвенирования одиночной клетки или ядра, включающий:71. A method for sequencing a single cell or nucleus, including:
(a) уникальное индексирование нуклеиновых кислот каждой клетки или ядер в образце с образованием таким образом индексированной библиотеки для каждой клетки или ядра;(a) uniquely indexing the nucleic acids of each cell or nucleus in the sample, thereby forming an indexed library for each cell or nucleus;
(b) использование биологического признака для определения одной или более интересующих индексированных библиотек со стадии (a);(b) using a biological feature to determine one or more indexed libraries of interest from step (a);
(c) обогащение интересующих индексированных библиотек со стадии (b) с образованием таким образом обогащенной библиотеки; и(c) enriching the indexed libraries of interest from step (b) to thereby form an enriched library; And
(d) секвенирование обогащенной библиотеки со стадии (c).(d) sequencing the enriched library from step (c).
72. Способ по п. 71, в котором библиотеки происходят от ДНК, РНК или белка клеток или ядер.72. The method of claim 71, wherein the libraries are derived from DNA, RNA, or protein of cells or nuclei.
73. Способ по любому из пп. 71 или 72, в котором биологический признак представляет собой ДНК, РНК или белок или их комбинацию.73. The method according to any one of paragraphs. 71 or 72, in which the biological trait is DNA, RNA or protein, or a combination thereof.
74. Способ по любому из пп. 71 или 72, в котором уникальная индексация на стадии (а) включает связывание по меньшей мере двух различных индексов с нуклеиновыми кислотами клеток или ядер.74. The method according to any one of paragraphs. 71 or 72, wherein the unique indexing in step (a) comprises linking at least two different indexes to cell or nuclear nucleic acids.
75. Способ по п. 74, в котором по меньшей мере два различных индекса представляют собой связный индекс.75. The method of claim 74, wherein the at least two different indices are a linked index.
76. Способ по любому из пп. 71 или 72, в котором обогащенная библиотека получена посредством позитивного обогащения.76. The method according to any one of paragraphs. 71 or 72, in which the enriched library is obtained by positive enrichment.
77. Способ по п. 76, в котором позитивное обогащение предусматривает амплификацию.77. The method of claim 76 wherein the positive enrichment involves amplification.
78. Способ по п. 76, в котором позитивное обогащение предусматривает захватный агент.78. The method of claim 76 wherein the positive enrichment comprises a capture agent.
79. Способ по п. 76, в котором позитивное обогащение предусматривает твердую подложку.79. The method of claim 76 wherein the positive enrichment comprises a solid support.
80. Способ по п. 76, в котором обогащенная библиотека получена посредством негативного обогащения.80. The method of claim 76, wherein the enriched library is obtained by negative enrichment.
81. Способ по любому из пп. 71 или 72, в котором определение интересующей индексированной библиотеки на стадии (c) предусматривает секвенирование индексов.81. The method according to any one of paragraphs. 71 or 72, wherein determining the indexed library of interest in step (c) involves sequencing the indexes.
82. Способ секвенирования одиночной клетки или ядра, включающий: 82. A method for sequencing a single cell or nucleus, including:
(a) обеспечение образца, причем образец содержит множество ядер или клеток;(a) providing a sample, wherein the sample contains a plurality of nuclei or cells;
(b) связывание первого индекса на каждом ядре или клетке в образце;(b) linking the first index on each nucleus or cell in the sample;
(c) разделение образца на множество компартментов;(c) dividing the sample into multiple compartments;
(d) связывание второго индекса на каждом ядре или клетке из множества компартментов;(d) linking the second index on each nucleus or cell from the plurality of compartments;
(e) объединение множества компартментов;(e) combining a plurality of compartments;
(f) секвенирование объединенных компартментов;(f) sequencing of pooled compartments;
(g) определение комбинации первого и второго индексов, связанных с биологическим признаком;(g) determining a combination of first and second indices associated with a biological trait;
(h) обогащение биологического признака из объединенных компартментов с использованием идентифицированной комбинации первого и второго индексов со стадии (g).(h) enriching the biological trait from the pooled compartments using the identified combination of the first and second indices from step (g).
83. Набор, содержащий:83. A set containing:
(a) множество транспосомных комплексов, причем каждый транспосомный комплекс содержит транспозазу и транспозонную последовательность, при этом транспозонная последовательность не индексирована;(a) a plurality of transposome complexes, each transposome complex containing a transposase and a transposon sequence, with the transposon sequence not indexed;
(b) первое множество индексных олигонуклеотидов, причем первое множество индексных олигонуклеотидов содержит олигонуклеотиды, имеющие по меньшей мере две разные последовательности; и(b) the first set of index oligonucleotides, and the first set of index oligonucleotides contains oligonucleotides having at least two different sequences; And
(c) фермент лигазу для применения с индексными олигонуклеотидами.(c) a ligase enzyme for use with index oligonucleotides.
84. Набор по п. 83, дополнительно содержащий второе множество индексных олигонуклеотидов, причем второе множество индексных олигонуклеотидов содержит олигонуклеотид, имеющий последовательности, отличающиеся от первого множества индексных олигонуклеотидов.84. The kit of claim 83, further comprising a second set of index oligonucleotides, wherein the second set of index oligonucleotides comprises an oligonucleotide having sequences different from the first set of index oligonucleotides.
85. Набор по п. 83, дополнительно содержащий третье множество индексных олигонуклеотидов, причем третье множество индексных олигонуклеотидов содержит олигонуклеотид, имеющий последовательности, отличающиеся от первого множества индексных олигонуклеотидов и второго множества индексных олигонуклеотидов.85. The kit of claim 83, further comprising a third set of index oligonucleotides, wherein the third set of index oligonucleotides comprises an oligonucleotide having sequences different from the first set of index oligonucleotides and the second set of index oligonucleotides.