Claims (36)
1. Способ получения композиции, содержащей функциональные мезенхимальные стволовые клетки, подходящие для введения в терапии, причем указанный способ включает следующие этапы1. A method for preparing a composition containing functional mesenchymal stem cells suitable for administration in therapy, said method comprising the following steps
а. суспендирование образца мезенхимальных стволовых клеток костного мозга ex vivo в криопротективной среде, содержащей от 5% до 10% диметилсульфоксида в концентрации от 5×106 до 10×106 клеток/мл;a. suspending a sample of mesenchymal bone marrow stem cells ex vivo in a cryoprotective medium containing 5% to 10% dimethyl sulfoxide at a concentration of 5×10 6 to 10×10 6 cells/ml;
b. криоконсервацию образца мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, охлаждение их вначале от -70°C до -90°C в течение по меньшей мере 24 часов перед хранением образца в жидком азоте;b. cryopreserving a sample of mesenchymal bone marrow stem cells, cooling them initially from -70°C to -90°C for at least 24 hours before storing the sample in liquid nitrogen;
c. восстановление образца мезенхимальных стволовых клеток костного мозга выполнением следующих этапов:c. recovery of a sample of mesenchymal bone marrow stem cells by performing the following steps:
c1. размораживание образца мезенхимальных стволовых клеток костного мозга путем постепенного повышения температуры до 35-39°C в течение 1-5 минут;c1. defrosting a sample of mesenchymal bone marrow stem cells by gradually increasing the temperature to 35-39°C for 1-5 minutes;
c2. разбавление образца в 10-30 раз по отношению к исходному объему образца подходящей питательной средой;c2. dilution of the sample by 10-30 times in relation to the initial volume of the sample with a suitable nutrient medium;
c3. центрифугирование образца, удаление супернатанта и ресуспендирование осадка мезенхимальных стволовых клеток в подходящей питательной среде;c3. centrifuging the sample, removing the supernatant, and resuspending the mesenchymal stem cell pellet in a suitable nutrient medium;
c4. отбор мезенхимальных стволовых клеток с жизнеспособностью по меньшей мере 70%;c4. selection of mesenchymal stem cells with a viability of at least 70%;
c5. посев мезенхимальных стволовых клеток, выбранных на этапе (c4), на пластиковый носитель и инкубирование указанных мезенхимальных стволовых клеток в подходящей питательной среде, содержащей от 7,5% до 10% CO2 и по меньшей мере 5% фетальной бычьей сыворотки при концентрации клеток от 1000 до 5000 клеток/см2, при подходящих условиях культивирования при 35-39°C,c5. seeding the mesenchymal stem cells selected in step (c4) onto a plastic carrier and incubating said mesenchymal stem cells in a suitable nutrient medium containing 7.5% to 10% CO 2 and at least 5% fetal bovine serum at a cell concentration of 1000 to 5000 cells/ cm2 , under suitable culture conditions at 35-39°C,
c6. замена подходящей свежей питательной средой, содержащей от 7,5% до 10% CO2 и по меньшей мере 5% фетальной бычьей сыворотки через равные промежутки времени и выделение мезенхимальных стволовых клеток с носителя, когда клетки занимают от 80 до 100% поверхности носителя;c6. replacing with a suitable fresh nutrient medium containing 7.5% to 10% CO 2 and at least 5% fetal bovine serum at regular intervals and isolating mesenchymal stem cells from the carrier when the cells occupy 80 to 100% of the surface of the carrier;
c7. отбор мезенхимальных стволовых клеток, которыеc7. selection of mesenchymal stem cells, which
демонстрируют адгезию к пластику; иdemonstrate adhesion to plastic; and
проявляют жизнеспособность по меньшей мере 70%; иshow a viability of at least 70%; and
проявляют экспрессию более или равную 90% CD90, CD166, CD73 и CD105; иshow expression greater than or equal to 90% of CD90, CD166, CD73 and CD105; and
проявляют экспрессию менее или равную 10% CD14, CD34, CD45 и HLA-DR менее или равную 10%; иshow expression less than or equal to 10% CD14, CD34, CD45 and HLA-DR less than or equal to 10%; and
не имеют хромосомных аберраций; иdo not have chromosomal aberrations; and
проявляют способность дифференцироваться в остеобласты, адипоциты и хондроциты; иshow the ability to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes; and
d. суспендирование мезенхимальных стволовых клеток, выделенных на этапе (c7), в подходящей среде для транспортировки и хранения при 2-8°C, для получения композиции, содержащей функциональные мезенхимальные стволовые клетки, причем указанная подходящая среда для транспортировки и хранения при 2-8°C представляет собой изотоническую среду, содержащую 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновую кислоту от 0,25 до 1 мМ.d. suspending the mesenchymal stem cells isolated in step (c7) in a suitable transport and storage medium at 2-8°C to obtain a composition containing functional mesenchymal stem cells, said suitable transport and storage medium at 2-8°C is an isotonic medium containing 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid from 0.25 to 1 mm.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что криопротективная среда этапа (а) содержит фетальную бычью сыворотку и от 5% до 10% ДМСО.2. The method according to p. 1, characterized in that the cryoprotective medium of step (a) contains fetal bovine serum and from 5% to 10% DMSO.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что криопротективная среда согласно этапу (а) представляет собой свободную от компонентов животного происхождения бессывороточную безбелковую среду, содержащую 5% или 10% ДМСО.3. The method according to claim 1, wherein the cryoprotective medium according to step (a) is a serum-free, protein-free medium containing 5% or 10% DMSO free of animal components.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что этап (b) включает криоконсервацию образца мезенхимальных стволовых клеток костного мозга со скоростью 1°C/мин от -70°C до -90°C в течение по меньшей мере 25 часов перед хранением образца в жидком азоте.4. The method according to any one of paragraphs. 1-3, characterized in that step (b) includes cryopreservation of a sample of mesenchymal bone marrow stem cells at a rate of 1°C/min from -70°C to -90°C for at least 25 hours before storing the sample in liquid nitrogen .
5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что изотоническая среда, содержащая 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновую кислоту от 0,25 мМ до 1 мМ, представляет собой свободную от компонентов животного происхождения бессывороточную безбелковую среду.5. The method according to any one of paragraphs. 1-4, characterized in that the isotonic medium containing 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid from 0.25 mm to 1 mm is a serum-free, protein-free medium free from animal components.
6. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что изотоническая среда, содержащая 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновую кислоту от 0,25 мМ до 1 мМ, содержит смесь от 1:9 до 9:1 (об/об) первой композиции, содержащей Na+ 130 мМ, K+ 4 мМ, Ca2+ 1,35 мМ, хлорид 109 мМ и лактат 16 мМ, со второй композицией, содержащей Na+ 159 мМ, K+ 5 мМ, Mg2+ 0,8 мМ, хлорид 77 мМ, дигидроген фосфат 28 мМ, цитрат 10 мМ и ацетат 32 мМ с добавкой 5 мМ глюкозы и сывороточного альбумина человека от 0,1% до 0,5%.6. The method according to any one of paragraphs. 1-4, characterized in that an isotonic medium containing 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid from 0.25 mm to 1 mm contains a mixture from 1:9 to 9:1 ( v/v) the first composition containing Na + 130 mM, K + 4 mM, Ca 2+ 1.35 mM, chloride 109 mM and lactate 16 mM, with the second composition containing Na + 159 mM, K + 5 mM, Mg 2+ 0.8 mM, chloride 77 mM, dihydrogen phosphate 28 mM, citrate 10 mM and acetate 32 mM supplemented with 5 mM glucose and human serum albumin from 0.1% to 0.5%.
7. Композиция, содержащая популяцию по меньшей мере 0,5×106 мезенхимальных стволовых клеток и 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновую кислоту от 0,25 мМ до 1 мМ, получаемая согласно способу по пп. 1-6, причем указанные мезенхимальные стволовые клетки сохраняют в течение по меньшей мере 72 часов в течение гипотермической транспортировки при температуре 2-8°С функциональность свежих мезенхимальных стволовых клеток, включая7. Composition containing a population of at least 0.5×10 6 mesenchymal stem cells and 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid from 0.25 mm to 1 mm, obtained according to the method according to pp. 1-6, moreover, these mesenchymal stem cells retain for at least 72 hours during hypothermic transportation at a temperature of 2-8°C the functionality of fresh mesenchymal stem cells, including
демонстрирование адгезии к пластику; demonstrating adhesion to plastic;
проявление жизнеспособности по меньшей мере 70%;showing viability of at least 70%;
проявление экспрессии более или равной 90% CD90, CD 166, CD73 и CD105;expression of greater than or equal to 90% of CD90, CD 166, CD73 and CD105;
проявление экспрессии менее или равной 10% CD14, CD34, CD45 и HLA-DR менее или равной 10%;expression of less than or equal to 10% CD14, CD34, CD45 and HLA-DR less than or equal to 10%;
отсутствие хромосомных аберраций; иabsence of chromosomal aberrations; and
проявление способности дифференцироваться в остеобласты, адипоциты и хондроциты.manifestation of the ability to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes.
8. Применение композиции по п. 7 в качестве лекарственного средства.8. Use of the composition according to claim 7 as a medicine.
9. Применение композиции по п. 7 в аутологичном или аллогенном лечении костно-суставных заболеваний, аутоиммунных заболеваний и сердечно-сосудистых заболеваний.9. The use of the composition according to claim 7 in the autologous or allogeneic treatment of osteoarticular diseases, autoimmune diseases and cardiovascular diseases.
10. Применение по любому из пп. 8 или 9, отличающееся тем, что указанную композицию вводят при плотности клеток от 1×106 до 10×106 клеток/мл и от 0,5 до 90 миллионов клеток.10. Application according to any one of paragraphs. 8 or 9, characterized in that said composition is administered at a cell density of 1×10 6 to 10×10 6 cells/ml and 0.5 to 90 million cells.
11. Применение по любому из пп. 9 или 10, отличающееся тем, что костно-суставные заболевания выбраны из группы, состоящей из остеохондроза, остеоартрита, повреждений мениска и ревматоидного артрита.11. Application according to any one of paragraphs. 9 or 10, characterized in that the osteoarticular diseases are selected from the group consisting of osteochondrosis, osteoarthritis, meniscal injuries and rheumatoid arthritis.
12. Применение по любому из пп. 9 или 10, отличающееся тем, что аутоиммунные заболевания выбраны из группы, состоящей из красной волчанки, болезни «трансплантат против хозяина» и системной склеродермии.12. Application according to any one of paragraphs. 9 or 10, characterized in that the autoimmune diseases are selected from the group consisting of lupus erythematosus, graft-versus-host disease, and systemic scleroderma.
13. Применение по любому из пп. 9 или 10, отличающееся тем, что сердечно-сосудистые заболевания выбраны из группы, состоящей из периферической сосудистой недостаточности, инфаркта миокарда, инсульта и ишемии.13. Application according to any one of paragraphs. 9 or 10, characterized in that cardiovascular diseases are selected from the group consisting of peripheral vascular insufficiency, myocardial infarction, stroke and ischemia.