Claims (39)
1. Способ ферментативного получения сахарида, содержащего по меньшей мере одну группировку N-ацетилнейраминовой кислоты, включающий стадии1. A method for the enzymatic production of a saccharide containing at least one N-acetylneuraminic acid moiety, comprising the steps
a) предоставления по меньшей мере одной генетически модифицированной микробной клетки, которая содержитa) providing at least one genetically modified microbial cell that contains
(1) путь биосинтеза сиаловой кислоты, содержащий глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазу;(1) a sialic acid biosynthetic pathway containing glucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase;
(2) синтетазу цитидин-5'-монофосфо-(ЦМФ)-N-ацетилнейраминовой кислоты; и(2) cytidine-5'-monophospho-(CMP)-N-acetylneuraminic acid synthetase; and
(3) гетерологичную сиалилтрансферазу;(3) heterologous sialyltransferase;
b) культивирования по меньшей мере одной генетически модифицированной микробной клетки в ферментационном бульонее и в условиях, позволяющих получать указанный сахарид, содержащий по меньшей мере одну группировку N-ацетилнейраминовой кислоты; и возможноb) culturing at least one genetically modified microbial cell in a fermentation broth and under conditions to obtain said saccharide containing at least one N-acetylneuraminic acid moiety; and, perhaps
c) извлечения указанного сахарида, содержащего по меньшей мере одну группировку N-ацетилнейраминовой кислоты.c) recovering said saccharide containing at least one N-acetylneuraminic acid moiety.
2. Генетически модифицированная микробная клетка для ферментативного получения сахарида, содержащего по меньшей мере одну группировку N-ацетилнейраминовой кислоты, где генетически модифицированная микробная клетка содержит:2. A genetically modified microbial cell for enzymatic production of a saccharide containing at least one group of N-acetylneuraminic acid, where the genetically modified microbial cell contains:
(1) синтетический путь биосинтеза сиаловой кислоты, содержащий глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазу;(1) a synthetic sialic acid biosynthetic pathway containing glucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase;
(2) синтетазу цитидин-5'-монофосфо-(ЦМФ)-N-ацетилнейраминовой кислоты; и(2) cytidine-5'-monophospho-(CMP)-N-acetylneuraminic acid synthetase; and
(3) гетерологичную сиалилтрансферазу;(3) heterologous sialyltransferase;
3. Способ по п. 1 или генетически модифицированная микробная клетка по п. 2, где путь биосинтеза сиаловой кислоты дополнительно содержит a) N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-фосфатазу и N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу; и/или b) N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-эпимеразу и N-ацетилманнозамин-6-фосфат-фосфатазу.3. The method of claim 1 or the genetically modified microbial cell of claim 2, wherein the sialic acid biosynthesis pathway further comprises a) N-acetylglucosamine-6-phosphate phosphatase and N-acetylglucosamine-2-epimerase; and/or b) N-acetylglucosamine-6-phosphate epimerase and N-acetylmannosamine-6-phosphate-phosphatase.
4. Способ по любому из пп. 1-3 или генетически модифицированная микробная клетка по п. 2 или 3, где генетически модифицированная микробная клетка содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из4. The method according to any one of paragraphs. 1-3 or a genetically modified microbial cell according to claim 2 or 3, where the genetically modified microbial cell contains a nucleic acid molecule containing and expressing a nucleotide sequence selected from the group consisting of
1) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, который представлен в SEQ ID NO 91;1) nucleotide sequences encoding a polypeptide, which is presented in SEQ ID NO 91;
2) нуклеотидных последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO 92;2) nucleotide sequences, which are presented in SEQ ID NO 92;
3) нуклеотидных последовательностей, имеющих сходство последовательностей, составляющее по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99%, с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептид, который представлен в SEQ ID NO 91;3) nucleotide sequences having a sequence similarity of at least 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or greater than 99% with nucleotide sequences encoding a polypeptide as shown in SEQ ID NO 91;
4) нуклеотидных последовательностей, имеющих сходство последовательностей, составляющее по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99%, с одной из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO 92;4) nucleotide sequences having a sequence similarity of at least 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or greater than 99% with one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO 92 ;
5) нуклеотидных последовательностей, комплементарных любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3) и (4); и5) nucleotide sequences complementary to any of the nucleotide sequences from (1), (2), (3) and (4); and
6) фрагментов любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3), (4) и (5).6) fragments of any of the nucleotide sequences from (1), (2), (3), (4) and (5).
5. Способ по любому из пп. 1-4 или генетически модифицированная микробная клетка по любому из пп. 2-4, где генетически модифицированная микробная клетка содержит гетерологичную сиалилтрансферазу, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из5. The method according to any one of paragraphs. 1-4 or a genetically modified microbial cell according to any one of paragraphs. 2-4, where the genetically modified microbial cell contains a heterologous sialyl transferase, preferably selected from the group consisting of
1) полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность или состоящих из аминокислотной последовательности, которая представлена в любой из SEQ ID NO: 1-33;1) polypeptides containing an amino acid sequence or consisting of an amino acid sequence, which is presented in any of SEQ ID NO: 1-33;
2) полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность или состоящих из аминокислотной последовательности, которая имеет сходство последовательностей, составляющее по меньшей мере 80%, с любой из аминокислотных последовательностей, представленной в любой из SEQ ID NO: 1-33; и2) polypeptides comprising an amino acid sequence or consisting of an amino acid sequence that has at least 80% sequence similarity with any of the amino acid sequences shown in any of SEQ ID NOs: 1-33; and
3) фрагментов любого из полипептидов из (1) и (2).3) fragments of any of the polypeptides from (1) and (2).
6. Способ по любому из пп. 1-5 или генетически модифицированная микробная клетка по любому из пп. 2-5, где генетически модифицированная микробная клетка содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит и экспрессирует нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из6. The method according to any one of paragraphs. 1-5 or a genetically modified microbial cell according to any one of paragraphs. 2-5, where the genetically modified microbial cell contains a nucleic acid molecule that contains and expresses a nucleotide sequence selected from the group consisting of
1) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, который представлен в любой из SEQ ID NO: 1-33;1) nucleotide sequences encoding a polypeptide, which is presented in any of SEQ ID NO: 1-33;
2) нуклеотидных последовательностей, которые представлены в любой из SEQ ID NO: 34-66;2) nucleotide sequences, which are presented in any of SEQ ID NO: 34-66;
3) нуклеотидных последовательностей, имеющих сходство последовательностей, составляющее по меньшей мере 80%, с одной из нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, который представлен в любой из SEQ ID NO: 1-33;3) nucleotide sequences having a sequence similarity of at least 80% with one of the nucleotide sequences encoding the polypeptide shown in any of SEQ ID NOs: 1-33;
4) нуклеотидных последовательностей, имеющих сходство последовательностей, составляющее по меньшей мере 80%, с любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 34-66;4) nucleotide sequences having a sequence similarity of at least 80% with any of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 34-66;
5) нуклеотидных последовательностей, комплементарных любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3) и (4); и5) nucleotide sequences complementary to any of the nucleotide sequences from (1), (2), (3) and (4); and
6) фрагментов любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3), (4) и (5).6) fragments of any of the nucleotide sequences from (1), (2), (3), (4) and (5).
7. Способ по любому из пп. 1-6 или генетически модифицированная микробная клетка по любому из пп. 2-6, где акцепторная молекула выбрана из группы, состоящей из N-ацетилглюкозамина, галактозы, N-ацетилгалактозамина, лактозы, лактулозы, N-ацетиллактозамина, лакто-N-биозы, мелибиозы, раффинозы, лакто-N-триозы II, 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, 3'-сиалил-N-ацетиллактозамина, 6'-сиалил-N-ацетиллактозамина, 3'-галактозиллактозы, 6'-галактозиллактозы, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, 2',3-дифукозиллактозы, 3-фукозил-3'-сиалиллактозы, 3-фукозил-6'-сиалиллактозы, сиалиллакто-N-тетраозы а, сиалиллакто-N-тетраозы b, сиалиллакто-N-тетраозы с, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-фукопентаозы II, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, лакто-N-неофукопентаозы I и лакто-N-неофукопентаозы V.7. The method according to any one of paragraphs. 1-6 or a genetically modified microbial cell according to any one of paragraphs. 2-6 wherein the acceptor molecule is selected from the group consisting of N-acetylglucosamine, galactose, N-acetylgalactosamine, lactose, lactulose, N-acetyllactosamine, lacto-N-biose, melibiose, raffinose, lacto-N-triose II, 2' -fucosyllactose, 3-fucosyllactose, 3'-sialyl lactose, 6'-sialyl lactose, 3'-sialyl-N-acetyllactosamine, 6'-sialyl-N-acetyllactosamine, 3'-galactosyl lactose, 6'-galactosyl lactose, lacto-N-tetraose , lacto-N-neotetraose, 2',3-difucosyl lactose, 3-fucosyl-3'-sialyl lactose, 3-fucosyl-6'-sialyl lactose, sialyl lacto-N-tetraose a, sialyl lacto-N-tetraose b, sialyl lacto-N- tetraose c, lacto-N-fucopentaose I, lacto-N-fucopentaose II, lacto-N-fucopentaose III, lacto-N-fucopentaose V, lacto-N-neo-fucopentaose I, and lacto-N-neo-fucopentaose V.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где ферментационный бульон содержит по меньшей мере один источник углерода, и по меньшей мере один источник углерода предпочтительно выбран из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, сахарозы, глицерина и их комбинаций.8. The method according to any one of paragraphs. 1-7, where the fermentation broth contains at least one carbon source, and at least one carbon source is preferably selected from the group consisting of glucose, fructose, sucrose, glycerol, and combinations thereof.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где по меньшей мере одну генетически модифицированную микробную клетку культивируют в отсутствие и/или без добавления одного или более чем одного из: глюкозамина, N-ацетилглюкозамина, N-ацетилманнозамина и N-ацетилнейраминовой кислоты.9. The method according to any one of paragraphs. 1-8, where at least one genetically modified microbial cell is cultured in the absence and/or without the addition of one or more of: glucosamine, N-acetylglucosamine, N-acetylmannosamine and N-acetylneuraminic acid.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где сахарид, содержащий по меньшей мере одну группировку N-ацетилнейраминовой кислоты, выбран из группы, состоящей из 3'-сиалилгалактозы, 6'-сиалилгалактозы, 3'-сиалил-N-ацетиллактозамина, 6'-сиалил-N-ацетиллактозамина, 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, сиалиллакто-N-тетраозы а, сиалиллакто-N-тетраозы b, сиалиллакто-N-тетраозы с, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы а, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы b, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы с, дисиалиллакто-N-тетраозы, фукозилдисиалиллакто-N-тетраозы I, фукозилдисиалиллакто-N-тетраозы II.10. The method according to any one of paragraphs. 1-9, wherein the saccharide containing at least one N-acetylneuraminic acid moiety is selected from the group consisting of 3'-sialylgalactose, 6'-sialylgalactose, 3'-sialyl-N-acetyllactosamine, 6'-sialyl-N- acetyllactosamine, 3'-sialyllactose, 6'-sialyllactose, sialyllacto-N-tetraose a, sialyllacto-N-tetraose b, sialyllacto-N-tetraose c, fucosyl-sialyllacto-N-tetraose a, fucosyl-sialyllacto-N-tetraose b , fucosyl-sialyllacto-N-tetraoses c, disialyllacto-N-tetraoses, fucosyldisialyllacto-N-tetraoses I, fucosyldisialyllacto-N-tetraoses II.
11. Применение генетически модифицированной микробной клетки по любому из пп. 2-7 для получения сиалилированного сахарида в способе ферментации с применением цельных клеток.11. The use of a genetically modified microbial cell according to any one of paragraphs. 2-7 to produce the sialylated saccharide in a whole cell fermentation process.
12. Сиалилированный сахарид, где указанный сиалилированный сахарид получен способом по любому из пп. 1-10 или путем применения генетически модифицированной микробной клетки по любому из пп. 2-7.12. Siallylated saccharide, where the specified sialylated saccharide obtained by the method according to any one of paragraphs. 1-10 or by using a genetically modified microbial cell according to any one of paragraphs. 2-7.
13. Применение сиалилированного сахарида по п. 12 для приготовления пищевой композиции.13. The use of the sialylated saccharide according to claim 12 for the preparation of a food composition.
14. Пищевая композиция, содержащая по меньшей мере один сиалилированный сахарид, предпочтительно по меньшей мере один сиалилированный олигосахарид, который получен способом по любому из пп. 1-9 или с использованием генетически модифицированной микробной клетки по любому из пп. 2-7.14. Food composition containing at least one sialylated saccharide, preferably at least one sialylated oligosaccharide, which is obtained by the method according to any one of paragraphs. 1-9 or using a genetically modified microbial cell according to any one of paragraphs. 2-7.
15. Пищевая композиция по п. 14, где пищевая композиция выбрана из группы, состоящей из лекарственных, фармацевтических композиций, смеси для грудных детей и пищевых добавок.15. A food composition according to claim 14, wherein the food composition is selected from the group consisting of medicinal, pharmaceutical compositions, infant formula and nutritional supplements.