Claims (86)
1. Способ серийной модификации целевого локуса в клетке, включающий:1. The method of serial modification of the target locus in the cell, including:
(а) обеспечение клетки, содержащей целевой локус, причем целевой локус содержит первую кассету селекции, содержащую: (1) нуклеиновую кислоту, кодирующую первый селективный маркер, функционально связанный с первым промотором; и (2) первый сайт распознавания нуклеазы для первого нуклеазного агента, причем первый сайт распознавания нуклеазы расположен в кодирующей области первого селективного маркера или в любой не кодирующей белок области первого селективного маркера;(a) providing a cell containing a target locus, wherein the target locus comprises a first selection cassette comprising: (1) a nucleic acid encoding a first selectable marker operably linked to the first promoter; and (2) a first nuclease recognition site for the first nuclease agent, wherein the first nuclease recognition site is located in the coding region of the first selective marker or in any non-protein coding region of the first selective marker;
(b) введение в клетку:(b) introduction into the cell:
(i) первого нуклеазного агента или полинуклеотида, кодирующего первый нуклеазный агент, причем первый нуклеазный агент индуцирует одно- или двухцепочечный разрыв в первом сайте распознавания нуклеазы; и(i) a first nuclease agent or polynucleotide encoding a first nuclease agent, wherein the first nuclease agent induces a single or double stranded break at the first nuclease recognition site; and
(ii) первого нацеливающего вектора, содержащего первую полинуклеотидную вставку, фланкированную первым гомологичным плечом, соответствующим первому целевому сайту, расположенному в целевом локусе, и вторым гомологичным плечом, соответствующим второму целевому сайту, расположенному в целевом локусе, причем первая полинуклеотидная вставка содержит вторую кассету селекции, содержащую: (1) нуклеиновую кислоту, кодирующую второй селективный маркер, функционально связанный со вторым промотором; и (2) второй сайт распознавания нуклеазы для второго нуклеазного агента,(ii) a first targeting vector containing a first polynucleotide insert flanked by a first homologous shoulder corresponding to a first target site located at a target locus and a second homologous shoulder corresponding to a second target site located at a target locus, the first polynucleotide insert containing a second selection cassette comprising: (1) a nucleic acid encoding a second selectable marker operably linked to a second promoter; and (2) a second nuclease recognition site for a second nuclease agent,
при этом первый селективный маркер и второй селективный маркер отличаются друг от друга,wherein the first selective marker and the second selective marker are different from each other,
при этом первый нуклеазный агент отличается от второго нуклеазного агента, иwherein the first nuclease agent is different from the second nuclease agent, and
при этом второй сайт распознавания нуклеазы расположен в кодирующей области второго селективного маркера или в любой не кодирующей белок области второго селективного маркера; иwherein the second nuclease recognition site is located in the coding region of the second selective marker or in any non-protein coding region of the second selective marker; and
(c) идентификацию модифицированной клетки, содержащей первую полинуклеотидную вставку в целевом локусе, при этом модифицированная клетка обладает активностью второго селективного маркера, но не обладает активностью первого селективного маркера.(c) identification of the modified cell containing the first polynucleotide insertion at the target locus, wherein the modified cell has the activity of a second selective marker, but does not have the activity of the first selective marker.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий один или несколько дополнительных раундов интеграции полинуклеотидных вставок, причем используемые в способе нацеливающие векторы чередуют использование первого селективного маркера, содержащего первый сайт распознавания нуклеазы для первого нуклеазного агента, и второго селективного маркера, содержащего второй сайт распознавания нуклеазы для второго нуклеазного агента.2. The method of claim 1, further comprising one or more additional rounds of integration of the polynucleotide inserts, wherein the targeting vectors used in the method alternate the use of a first selective marker containing a first nuclease recognition site for a first nuclease agent and a second selective marker containing a second recognition site nucleases for a second nuclease agent.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором этап идентификации (с) включает:3. The method of claim 1 or 2, wherein the identification step (c) comprises:
(i) культивирование клетки в условиях, позволяющих идентифицировать клетки, не обладающие активностью первого селективного маркера; или(i) culturing the cell under conditions allowing the identification of cells lacking the activity of the first selective marker; or
(ii) идентификацию по меньшей мере одной клетки, содержащей первую полинуклеотидную вставку, интегрированную в первый и второй целевые сайты.(ii) the identification of at least one cell containing the first polynucleotide insert integrated into the first and second target sites.
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором этап идентификации (с) выполняют посредством анализа определения модификации аллеля (MOA).4. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which the identification step (c) is performed by analyzing the determination of allele modification (MOA).
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором первая кассета селекции на этапе (а) фланкирована первым целевым сайтом и вторым целевым сайтом.5. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which the first selection cassette in step (a) is flanked by the first target site and the second target site.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором первый селективный маркер или второй селективный маркер придает устойчивость к антибиотику,6. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which the first selective marker or second selective marker confers antibiotic resistance,
необязательно причем антибиотик представляет собой G418, гигромицин, бластицидин, неомицин или пуромицин, иoptionally wherein the antibiotic is G418, hygromycin, blasticidin, neomycin or puromycin, and
необязательно причем первый селективный маркер придает устойчивость к неомицину, а второй селективный маркер придает устойчивость к гигромицину, или первый селективный маркер придает устойчивость к гигромицину, а второй селективный маркер придает устойчивость к неомицину.optionally, the first selective marker confers resistance to neomycin, and the second selective marker confers resistance to hygromycin, or the first selective marker confers resistance to hyromycin, and the second selective marker confers resistance to neomycin.
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором первый селективный маркер или второй селективный маркер функционально связан с индуцируемым промотором, и экспрессия селективного маркера является токсичной для клетки,7. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which the first selective marker or second selective marker is operably linked to an inducible promoter, and the expression of the selective marker is toxic to the cell,
необязательно причем первый селективный маркер или второй селективный маркер содержит гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазу (HGPRT) или тимидинкиназу вируса простого герпеса (HSV-TK).optionally, the first selective marker or second selective marker contains hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) or herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK).
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором совместное использование первого нацеливающего вектора с первым нуклеазным агентом приводит к повышению эффективности нацеливания по сравнению с использованием только первого нацеливающего вектора,8. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which the combined use of the first targeting vector with the first nuclease agent leads to an increase in targeting efficiency compared to using only the first targeting vector,
необязательно причем эффективность нацеливания первого нацеливающего вектора увеличивается по меньшей мере в два раза по сравнению с использованием только первого нацеливающего вектора.optionally, the targeting efficiency of the first targeting vector is at least doubled compared to using only the first targeting vector.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором первый сайт распознавания нуклеазы расположен в интроне, экзоне, промоторе, регуляторной области промотора или энхансерной области первого селективного маркера, а второй сайт распознавания нуклеазы расположен в интроне, экзоне, промоторе, регуляторной области промотора или энхансерной области второго селективного маркера.9. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which the first nuclease recognition site is located in the intron, exon, promoter, regulatory region of the promoter or enhancer region of the first selective marker, and the second nuclease recognition site is located in the intron, exon, promoter, regulatory region of the promoter or enhancer region of the second selective marker.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором этап (b) включает введение в клетку полинуклеотида, кодирующего первый нуклеазный агент, и при этом:10. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which step (b) comprises introducing into the cell a polynucleotide encoding a first nuclease agent, and wherein:
(I) полинуклеотид, кодирующий первый нуклеазный агент, содержит экспрессионную конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую первый нуклеазный агент, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая данный нуклеазный агент, функционально связана с активным в клетке промотором; или(I) a polynucleotide encoding a first nuclease agent comprises an expression construct comprising a nucleotide sequence encoding a first nuclease agent, the nucleotide sequence encoding this nuclease agent being operably linked to a promoter active in the cell; or
(II) полинуклеотид, кодирующий первую нуклеазу, содержит мРНК, кодирующую данный нуклеазный агент.(II) a polynucleotide encoding a first nuclease contains mRNA encoding a given nuclease agent.
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором первый нуклеазный агент или второй нуклеазный агент представляет собой:11. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which the first nuclease agent or second nuclease agent is:
(I) нуклеазу с «цинковыми пальцами» (ZFN);(I) zinc finger nuclease (ZFN);
(II) эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN);(Ii) transcriptional activator-like effector nuclease (TALEN);
(III) мегануклеазу; или(Iii) meganuclease; or
(IV) белок (Cas), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), и гидовую РНК (гРНК).(IV) a protein (Cas) associated with short palindromic repeats, regularly spaced groups (CRISPR), and guiding RNA (gRNA).
12. Способ по п. 11, в котором первый нуклеазный агент или второй нуклеазный агент представляет собой нуклеазу с «цинковыми пальцами» (ZFN), а первый сайт распознавания нуклеазы или второй сайт распознавания нуклеазы содержит любую из SEQ ID NO: 9-12.12. The method of claim 11, wherein the first nuclease agent or second nuclease agent is zinc finger nuclease (ZFN), and the first nuclease recognition site or second nuclease recognition site contains any of SEQ ID NO: 9-12.
13. Способ по п. 11, в котором первый нуклеазный агент или второй нуклеазный агент представляет собой белок Cas и гРНК, причем белок Cas представляет собой Cas9, и причем гРНК содержит:13. The method according to p. 11, in which the first nuclease agent or the second nuclease agent is a Cas protein and gRNA, wherein the Cas protein is Cas9, and wherein the gRNA contains:
(a) РНК коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR), (крРНК), нацеленную на первый сайт распознавания нуклеазы или второй сайт распознавания нуклеазы, причем первый сайт распознавания нуклеазы или второй сайт распознавания нуклеазы непосредственно фланкирован последовательностью мотива, прилежащего к протоспейсеру (PAM); и(a) RNAs of short palindromic repeats regularly arranged in groups (CRISPR), (cRRNA) targeting a first nuclease recognition site or a second nuclease recognition site, wherein the first nuclease recognition site or the second nuclease recognition site is directly flanked by a sequence of motif adjacent to the protospacer ( PAM); and
(b) трансактивирующую РНК CRISPR (тракрРНК),(b) CRISPR transactivating RNA (trarRNA),
необязательно причем целевой локус содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1.optionally, the target locus contains the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
14. Способ по п. 13, в котором гРНК содержит любую из SEQ ID NO: 13-20.14. The method according to p. 13, in which the gRNA contains any of SEQ ID NO: 13-20.
15. Способ по п. 13 или 14, в котором гРНК содержит SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8,15. The method according to p. 13 or 14, in which the gRNA contains SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8,
необязательно причем гидовая РНК содержит SEQ ID NO: 3 или 7.optionally, the guiding RNA contains SEQ ID NO: 3 or 7.
16. Способ по любому из пп. 13-15, в котором первый нуклеазный агент содержит белок Cas и первую гРНК, второй нуклеазный агент содержит белок Cas и вторую гРНК, и первая гРНК и вторая гРНК отличаются друг от друга.16. The method according to any one of paragraphs. 13-15, in which the first nuclease agent contains the Cas protein and the first gRNA, the second nuclease agent contains the Cas protein and the second gRNA, and the first gRNA and the second gRNA are different from each other.
17. Способ по п. 12, в котором первый селективный маркер придает устойчивость к неомицину, первый нуклеазный агент представляет собой нуклеазу с «цинковыми пальцами», и первый сайт распознавания нуклеазы содержит SEQ ID NO: 9 или 10, и при этом второй селективный маркер придает устойчивость к гигромицину, второй нуклеазный агент представляет собой нуклеазу с «цинковыми пальцами», и второй сайт распознавания нуклеазы содержит SEQ ID NO: 11 или 12.17. The method of claim 12, wherein the first selective marker confers resistance to neomycin, the first nuclease agent is zinc finger nuclease, and the first nuclease recognition site contains SEQ ID NO: 9 or 10, and the second selective marker confers resistance to hygromycin, the second nuclease agent is zinc finger nuclease, and the second nuclease recognition site contains SEQ ID NO: 11 or 12.
18. Способ по любому из пп. 13-16, в котором первый селективный маркер придает устойчивость к неомицину, и первый нуклеазный агент представляет собой белок Cas9 и гидовую РНК, содержащую любую из SEQ ID NO: 13-16, и при этом второй селективный маркер придает устойчивость к гигромицину, и второй нуклеазный агент представляет собой белок Cas9 и гидовую РНК, содержащую любую из SEQ ID NO: 17-20,18. The method according to any one of paragraphs. 13-16, in which the first selective marker confers resistance to neomycin, and the first nuclease agent is a Cas9 protein and a guiding RNA containing any of SEQ ID NO: 13-16, and the second selective marker confers resistance to hygromycin, and the second the nuclease agent is a Cas9 protein and a guiding RNA containing any of SEQ ID NO: 17-20,
необязательно причем первый селективный маркер придает устойчивость к неомицину, и первый нуклеазный агент представляет собой белок Cas9 и гидовую РНК, содержащую SEQ ID NO: 13, и при этом второй селективный маркер придает устойчивость к гигромицину, и второй нуклеазный агент представляет собой белок Cas9 и гидовую РНК, содержащую SEQ ID NO: 17.optionally, the first selective marker confers resistance to neomycin, and the first nuclease agent is Cas9 protein and a guiding RNA containing SEQ ID NO: 13, and the second selective marker confers hygromycin resistance, and the second nuclease agent is Cas9 protein and hyd RNA containing SEQ ID NO: 17.
19. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором:19. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which:
(I) первый целевой сайт и второй целевой сайт непосредственно смежны с первым сайтом распознавания нуклеазы; или(I) the first target site and the second target site are directly adjacent to the first nuclease recognition site; or
(II) первый целевой сайт и второй целевой сайт расположены на расстоянии от около 10 нуклеотидов до около 14 т. п. н. от первого сайта распознавания нуклеазы.(II) the first target site and the second target site are located at a distance of from about 10 nucleotides to about 14 bp from the first nuclease recognition site.
20. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором: 20. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which:
(I) суммарная длина первого гомологичного плеча и второго гомологичного плеча составляет по меньшей мере около 10 т. п. н.; и/или(I) the total length of the first homologous shoulder and the second homologous shoulder is at least about 10 bp; and / or
(II) каждое из первого гомологичного плеча и второго гомологичного плеча находится в диапазоне от около 5 т. п. н. до около т. п. н. 100; и/или(II) each of the first homologous shoulder and the second homologous shoulder is in the range of from about 5 bp up to about t.p. one hundred; and / or
(III) первый нацеливающий вектор составляет по меньшей мере около 10 т. п. н. или от около 20 т. п. н. до около 300 т. п. н.; и/или(III) the first targeting vector is at least about 10 bp or from about 20 tp up to about 300 bp; and / or
(IV) длина первой полинуклеотидной вставки находится в диапазоне от около 5 т. п. н. до около 300 т. п. н.(IV) the length of the first polynucleotide insert is in the range of about 5 bp up to about 300 bp
21. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором первая полинуклеотидная вставка дополнительно содержит первый интересующий полинуклеотид,21. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which the first polynucleotide insert further comprises a first polynucleotide of interest,
необязательно причем первый интересующий полинуклеотид включает человеческий полинуклеотид.optionally, the first polynucleotide of interest includes a human polynucleotide.
22. Способ по п. 21, в котором первый интересующий полинуклеотид включает полинуклеотид, кодирующий область Т-клеточного рецептора,22. The method of claim 21, wherein the first polynucleotide of interest comprises a polynucleotide encoding a region of a T cell receptor,
необязательно причем Т-клеточный рецептор представляет собой Т-клеточный альфа-рецептор, иoptionally, the T cell receptor is a T cell alpha receptor, and
необязательно причем первый интересующий полинуклеотид содержит по меньшей мере один генный сегмент вариабельной области и/или генный сегмент соединительной области локуса Т-клеточного альфа-рецептора.optionally, the first polynucleotide of interest contains at least one gene segment of the variable region and / or the gene segment of the connective region of the T cell alpha receptor locus.
23. Способ по п. 21, в котором первый интересующий полинуклеотид содержит геномную нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина,23. The method according to p. 21, in which the first polynucleotide of interest contains a genomic nucleotide sequence that encodes the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain of a human immunoglobulin,
необязательно причем первый интересующий полинуклеотид содержит нереаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи не относящегося к человеку иммуноглобулина.optionally, the first polynucleotide of interest contains the unresolved nucleotide sequence of the variable region of the heavy chain of a human immunoglobulin operably linked to the nucleotide sequence of the constant region of the heavy chain of a non-human immunoglobulin.
24. Способ по п. 21, в котором первый интересующий полинуклеотид содержит геномную нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого иммуноглобулина,24. The method according to p. 21, in which the first polynucleotide of interest contains a genomic nucleotide sequence that encodes the amino acid sequence of the variable region of the light chain of a human immunoglobulin,
необязательно причем геномная нуклеотидная последовательность содержит нереаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи λ и/или κ человека, или причем геномная нуклеотидная последовательность содержит реаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи λ и/или κ человека.optionally, the genomic nucleotide sequence contains the unresolved nucleotide sequence of the variable region of the light chain λ and / or κ person, or the genomic nucleotide sequence contains the rearranged nucleotide sequence of the variable region of the light chain λ and / or κ person.
25. Способ по п. 21, в котором первый интересующий полинуклеотид содержит по меньшей мере один аллель заболевания.25. The method according to p. 21, in which the first polynucleotide of interest contains at least one allele of the disease.
26. Способ по п. 21, в котором первый интересующий полинуклеотид содержит:26. The method according to p. 21, in which the first polynucleotide of interest contains:
(I) нуклеотидную последовательность, которая является гомологичной или ортологичной нуклеотидной последовательности в геноме клетки; или(I) a nucleotide sequence that is homologous or orthologous to the nucleotide sequence in the cell genome; or
(II) экзогенную нуклеотидную последовательность.(Ii) an exogenous nucleotide sequence.
27. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором первый нацеливающий вектор сконструирован для возможности удаления последовательности длиной от около 5 т. п. н. до около 3 млн п. н. из целевого локуса.27. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which the first targeting vector is designed to be able to remove sequences from a length of about 5 bp up to about 3 million bp from the target locus.
28. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором интеграция первой полинуклеотидной вставки в целевой локус приводит к нокауту, нокину, точечной мутации, перестановке доменов, перестановке экзонов, перестановке интронов, перестановке регуляторных последовательностей, перестановке генов или их комбинации.28. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which the integration of the first polynucleotide insertion into the target locus leads to knockout, nokin, point mutation, permutation of domains, permutation of exons, permutation of introns, permutation of regulatory sequences, gene permutation, or combinations thereof.
29. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором клетка, полученная данным способом, содержит генетическую модификацию, включающую замену в целевом локусе эндогенной нуклеотидной последовательности интересующим экзогенным полинуклеотидом.29. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which the cell obtained by this method contains a genetic modification comprising replacing the endogenous nucleotide sequence at the target locus with an exogenous polynucleotide of interest.
30. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором целевой локус находится в геноме клетки или расположен в векторе в клетке.30. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which the target locus is located in the genome of the cell or is located in a vector in the cell.
31. Способ по п. 30, в котором целевой локус включает локус иммуноглобулина.31. The method of claim 30, wherein the target locus comprises an immunoglobulin locus.
32. Способ по п. 30, в котором целевой геномный локус включает локус Т-клеточного рецептора, необязательно причем локус Т-клеточного рецептора представляет собой локус Т-клеточного альфа-рецептора.32. The method of claim 30, wherein the target genomic locus comprises a T cell receptor locus, optionally wherein the T cell receptor locus is a T cell alpha receptor locus.
33. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором одно- или двухцепочечный разрыв, индуцированный первым нуклеазным агентом, нарушает активность первого селективного маркера.33. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which a single or double chain rupture induced by the first nuclease agent disrupts the activity of the first selective marker.
34. Способ по п. 33, в котором инсерция первой полинуклеотидной вставки в целевой локус нарушает активность первого селективного маркера.34. The method according to p. 33, in which the insertion of the first polynucleotide insertion into the target locus disrupts the activity of the first selective marker.
35. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором клетка представляет собой эукариотическую клетку, необязательно причем клетка представляет собой клетку млекопитающего, необязательно причем клетка представляет собой:35. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which the cell is a eukaryotic cell, optionally wherein the cell is a mammalian cell, optionally wherein the cell is:
(I) клетку не относящегося к человеку млекопитающего;(I) a cell of a non-human mammal;
(II) плюрипотентную клетку;(Ii) a pluripotent cell;
(III) человеческую индуцированную плюрипотентную стволовую клетку;(Iii) a human induced pluripotent stem cell;
(IV) фибробласт человека;(Iv) human fibroblast;
(V) не относящуюся к человеку эмбриональную стволовую (ЭС) клетку;(V) a non-human embryonic stem (ES) cell;
(VI) эмбриональную стволовую (ЭС) клетку мыши или эмбриональную стволовую (ЭС) клетку крысы; (VI) mouse embryonic stem (ES) cell or rat embryonic stem (ES) cell;
(VII) гемопоэтическую стволовую клетку;(Vii) hematopoietic stem cell;
(VIII) нейрональную стволовую клетку; или(Viii) a neuronal stem cell; or
(IX) клетку грызуна.(Ix) a rodent cage.
36. Способ по п. 35, в котором клетка представляет собой ЭС-клетку мыши или ЭС-клетку крысы.36. The method of claim 35, wherein the cell is a mouse ES cell or rat ES cell.
37. Способ по п. 36, дополнительно включающий: 37. The method according to p. 36, further comprising:
(d) введение клетки, полученной на этапе (с), в эмбрион-хозяин на стадии до образования морулы для получения модифицированного эмбриона-хозяина; и(d) introducing the cell obtained in step (c) into the host embryo at the stage prior to the formation of morula to obtain a modified host embryo; and
(е) имплантацию модифицированного эмбриона-хозяина в организм суррогатной матери для получения поколения F0, происходящего от клетки, полученной на этапе (с).(e) implantation of the modified host embryo into the surrogate mother's organism to obtain the generation of F0 originating from the cell obtained in step (c).