Claims (150)
1. Способ ex-vivo генетической модификации иммунной клетки, включающий доставку в иммунную клетку:1. An ex-vivo method for genetic modification of an immune cell, comprising delivering to an immune cell:
(а) последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, содержащей последовательность, кодирующую фермент транспозазу, и(a) a nucleic acid sequence or amino acid sequence comprising a transposase enzyme coding sequence, and
(b) рекомбинантной и неприродной последовательности ДНК, включающей последовательность ДНК, кодирующую транспозон.(b) a recombinant and non-natural DNA sequence comprising a DNA sequence encoding a transposon.
2. Способ по п.1, где последовательностью, кодирующей фермент транспозазу, является последовательность мРНК.2. The method according to claim 1, where the sequence encoding the transposase enzyme is an mRNA sequence.
3. Способ по п. 1, где последовательностью, кодирующей фермент транспозазу, является последовательность ДНК.3. The method according to p. 1, where the sequence encoding the transposase enzyme is a DNA sequence.
4. Способ по п. 1, где последовательностью, кодирующей фермент транспозазу, является аминокислотная последовательность.4. The method of claim 1, wherein the sequence encoding the transposase enzyme is an amino acid sequence.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где стадия доставки включает электропорацию или нуклеофекцию иммунной клетки.5. The method according to any one of paragraphs. 1-4, where the stage of delivery includes electroporation or nucleofection of an immune cell.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где способ также включает стадию стимуляции иммунной клетки одним или более цитокинами.6. The method according to any one of paragraphs. 1-5, where the method also includes the step of stimulating the immune cell with one or more cytokines.
7. Способ по п. 6, где стадию стимуляции иммунной клетки одним или более цитокинами осуществляют после стадии доставки.7. The method of claim 6, wherein the step of stimulating the immune cell with one or more cytokines is performed after the delivery step.
8. Способ по п. 6, где стадию стимуляции иммунной клетки одним или более цитокинами осуществляют до стадии доставки.8. The method of claim 6, wherein the step of stimulating the immune cell with one or more cytokines is carried out prior to the delivery step.
9. Способ по любому из пп. 6-8, где один или более цитокинов включают IL-2, IL-21, IL-7 и/или IL-15.9. The method according to any one of paragraphs. 6-8, where one or more cytokines include IL-2, IL-21, IL-7 and / or IL-15.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где иммунной клеткой является аутологичная иммунная клетка.10. The method according to any one of the preceding paragraphs, where the immune cell is an autologous immune cell.
11. Способ по любому из пп. 1-10, где иммунной клеткой является Т-лимфоцит.11. The method according to any one of paragraphs. 1-10, where the immune cell is a T-lymphocyte.
12. Способ по любому из пп. 1-10, где иммунной клеткой является природная клетка-киллер (NK).12. The method according to any one of paragraphs. 1-10, where the immune cell is a natural killer cell (NK).
13. Способ по любому из пп. 1-10, где иммунной клеткой является клетка-киллер, индуцированная цитокином (CIK).13. The method according to any one of paragraphs. 1-10, where the immune cell is a cytokine-induced killer cell (CIK).
14. Способ по любому из пп. 1-10, где иммунной клеткой является природная Т-клетка-киллер (NКТ).14. The method according to any one of paragraphs. 1-10, where the immune cell is a natural killer T cell (NKT).
15. Способ по любому из пп. 2 и 5-14, где последовательность мРНК, кодирующую фермент транспозазу, продуцируют in vitro.15. The method according to any one of paragraphs. 2 and 5-14, where the mRNA sequence encoding the transposase enzyme is produced in vitro .
16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где фермент транспозаза представляет собой фермент транспозазу Super piggyBac™ (sPBo).16. The method according to any one of the preceding paragraphs, where the transposase enzyme is a Super piggyBac ™ transposase enzyme (sPBo).
17. Способ по п. 16, где фермент транспозаза Super piggyBac™ (PB) содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности:17. The method according to p. 16, where the Super piggyBac ™ transposase enzyme (PB) contains an amino acid sequence that is at least 75% identical to the sequence:
MGSSLDDEHILSALLQSD DELVGEDSDSEVSDHVSE DDVQSDTEEAFIDEVHEV QPTSSGSEILDEQNVIEQ PGSSLASNRILTLPQRTI RGKNKHCWSTSKSTRRSR VSALNIVRSQRGPTRMCR NIYDPLLCFKLFFTDEII SEIVKWTNAEISLKRRES MTSATFRDTNEDEIYAFF GILVMTAVRKDNHMSTDD LFDRSLSMVYVSVMSRDR FDFLIRCLRMDDKSIRPT LRENDVFTPVRKIWDLFI HQCIQNYTPGAHLTIDEQ LLGFRGRCPFRVYIPNKP SKYGIKILMMCDSGTKYM INGMPYLGRGTQTNGVPL GEYYVKELSKPVHGSCRN ITCDNWFTSIPLAKNLLQ EPYKLTIVGTVRSNKREI PEVLKNSRSRPVGTSMFC FDGPLTLVSYKPKPAKMV YLLSSCDEDASINESTGK PQMVMYYNQTKGGVDTLD QMCSVMTCSRKTNRWPMA LLYGMINIACINSFIIYS HNVSSKGEKVQSRKKFMR NLYMSLTSSFMRKRLEAP TLKRYLRDNISNILPKEV PGTSDDSTEEPVMKKRTY CTYCPSKIRRKANASCKK CKKVICREHNIDMCQSCF (SEQ ID NO: 1).MGSSLDDEHILSALLQSD DELVGEDSDSEVSDHVSE DDVQSDTEEAFIDEVHEV QPTSSGSEILDEQNVIEQ PGSSLASNRILTLPQRTI RGKNKHCWSTSKSTRRSR VSALNIVRSQRGPTRMCR NIYDPLLCFKLFFTDEII SEIVKWTNAEISLKRRES MTSATFRDTNEDEIYAFF GILVMTAVRKDNHMSTDD LFDRSLSMVYVSVMSRDR FDFLIRCLRMDDKSIRPT LRENDVFTPVRKIWDLFI HQCIQNYTPGAHLTIDEQ LLGFRGRCPFRVYIPNKP SKYGIKILMMCDSGTKYM INGMPYLGRGTQTNGVPL GEYYVKELSKPVHGSCRN ITCDNWFTSIPLAKNLLQ EPYKLTIVGTVRSNKREI PEVLKNSRSRPVGTSMFC FDGPLTLVSYKPKPAKMV YLLSSCDEDASINESTGK PQMVMYYNQTKGGVDTLD QMCSVMTCSRKTNRWPMA LLYGMINIACINSFIIYS HNVSSKGEKVQSRKKFMR NLYMSLTSSFMRKRLEAP TLKRYLRDNISNILPKEV PGTSDDSTEEPVMKKRTY CTYCPSKIRRKANASCKK CKKVICREHNIDMCQSCF (SEQ ID NO: 1).
18. Способ по любому из пп. 1-15, где фермент транспозаза представляет собой фермент транспозазу Sleeping Beauty.18. The method according to any one of paragraphs. 1-15, where the transposase enzyme is a Sleeping Beauty transposase enzyme.
19. Способ по п. 18, где транспозаза Sleeping Beauty представляет собой гиперактивную транспозазу Sleeping Beauty SB100X.19. The method of claim 18, wherein the Sleeping Beauty transposase is a Sleeping Beauty SB100X hyperactive transposase.
20. Способ по п. 18 или 19, где фермент транспозаза Sleeping Beauty содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности: MGKSKEISQDLRKKIV DLHKSGSSLGAISKRL KVPRSSVQTIVRKYKH HGTTQPSYRSGRRRYL SPRDERTLVRKVQINP RTTAKDLVKMLEETGT KVSISTVKRVLYRHNL KGRSARKKPLLQNRHK KARLRFATAHGDKDRT FWRNVLWSDETKIELF GHNDHRYVWRKKGEAC KPKNTIPTVKHGGGSI MLWGCFAAGGTGALHK IDGIMRKENYVDILKQ HLKTSVRKLKLGRKWV FQMDNDPKHTSKVVAK WLKDNKVKVLEWPSQS PDLNPIENLWAELKKR VRARRPTNLTQLHQLC QEEWAKIHPTYCGKL VEGYPKRLTQVKQFKGNATKY (SEQ ID NO: 2).. 20. The method of claim 18 or 19, wherein the enzyme Sleeping Beauty transposase comprises an amino acid sequence that is at least 75% identical to the sequence: MGKSKEISQDLRKKIV DLHKSGSSLGAISKRL KVPRSSVQTIVRKYKH HGTTQPSYRSGRRRYL SPRDERTLVRKVQINP RTTAKDLVKMLEETGT KVSISTVKRVLYRHNL KGRSARKKPLLQNRHK KARLRFATAHGDKDRT FWRNVLWSDETKIELF GHNDHRYVWRKKGEAC KPKNTIPTVKHGGGSI MLWGCFAAGGTGALHK IDGIMRKENYVDILKQ HLKTSVRKLKLGRKWV FQMDNDPKHTSKVVAK WLKDNKVKVLEWPSQS PDLNPIENLWAELKKR VRARRPTNLTQLHQLC QEEWAKIHPTYCGKL VEGYPKRLTQVKQFKGNATKY (SEQ ID NO: 2).
21. Способ по п. 18 или 19, где фермент транспозаза Sleeping Beauty содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности:21. The method according to p. 18 or 19, where the Sleeping Beauty transposase enzyme contains an amino acid sequence that is at least 75% identical to the sequence:
MGKSKEISQDLRKRIVD LHKSGSSLGAISKRLAV PRSSVQTIVRKYKHHG TTQPSYRSGRRRYLSP RDERTLVRKVQINPRT TAKDLVKMLEETGTKV SISTVKRVLYRHNLKG HSARKKPLLQNRHKKA RLRFATAHGDKDRTFW RNVLWSDETKIELFGH NDHRYVWRKKGEACKP KNTIPTVKHGGGSIML WGCFAAGGTGALHKID GIMDAVQYVDILKQHL KTSVRKLKLGRKWVFQ HDNDPKHTSKVVAKWL KDNKVKVLEWPSQSPD LNPIENLWAELKKRVR ARRPTNLTQLHQLCQE EWAKIHPNYCGKLVE GYPKRLTQVKQFKGNATKY (SEQ ID NO: 3).MGKSKEISQDLRKRIVD LHKSGSSLGAISKRLAV PRSSVQTIVRKYKHHG TTQPSYRSGRRRYLSP RDERTLVRKVQINPRT TAKDLVKMLEETGTKV SISTVKRVLYRHNLKG HSARKKPLLQNRHKKA RLRFATAHGDKDRTFW RNVLWSDETKIELFGH NDHRYVWRKKGEACKP KNTIPTVKHGGGSIML WGCFAAGGTGALHKID GIMDAVQYVDILKQHL KTSVRKLKLGRKWVFQ HDNDPKHTSKVVAKWL KDNKVKVLEWPSQSPD LNPIENLWAELKKRVR ARRPTNLTQLHQLCQE EWAKIHPNYCGKLVE GYPKRLTQVKQFKGNATKY (SEQ ID NO: 3).
22. Способ по любому из предшествующих пунктов, где рекомбинантная и неприродная последовательность ДНК, содержащие последовательность ДНК, кодирующую транспозон, являются кольцевыми.22. The method according to any one of the preceding paragraphs, where the recombinant and non-natural DNA sequence containing the DNA sequence encoding the transposon are circular.
23. Способ по п. 22, где рекомбинантная и неприродная последовательность ДНК, кодирующая транспозон, содержится в плазмидном векторе.23. The method according to p. 22, where the recombinant and non-natural DNA sequence encoding a transposon is contained in a plasmid vector.
24. Способ по п. 22, где рекомбинантная и неприродная последовательность ДНК, кодирующая транспозон, содержится в миникольцевом ДНК-векторе.24. The method according to p. 22, where the recombinant and unnatural DNA sequence encoding a transposon is contained in a minicircular DNA vector.
25. Способ по любому из пп. 1-21, где рекомбинантная и неприродная последовательность ДНК, кодирующая транспозон, является линейной.25. The method according to any one of paragraphs. 1-21, where the recombinant and non-natural DNA sequence encoding a transposon is linear.
26. Способ по любому из предшествующих пунктов, где рекомбинантную и неприродную последовательность ДНК, кодирующую транспозон, продуцируют in vitro.26. The method according to any one of the preceding paragraphs, where the recombinant and unnatural DNA sequence encoding a transposon is produced in vitro.
27. Способ по п. 25 или 26, где рекомбинантная и неприродная последовательность ДНК, кодирующая транспозон, представляет собой продукт расщепления кольцевой ДНК рестриктирующими ферментами.27. The method according to p. 25 or 26, where the recombinant and non-natural DNA sequence encoding the transposon is a product of the cleavage of circular DNA by restriction enzymes.
28. Способ по п. 27, где кольцевой ДНК является плазмидный вектор или миникольцевой ДНК-вектор.28. The method according to p. 27, where the circular DNA is a plasmid vector or minicircular DNA vector.
29. Способ по п. 25 или 26, где рекомбинантная и неприродная последовательность ДНК, кодирующая транспозон, представляет собой продукт полимеразной цепной реакции (ПЦР).29. The method according to p. 25 or 26, where the recombinant and non-natural DNA sequence encoding a transposon is a product of a polymerase chain reaction (PCR).
30. Способ по п. 25 или 26, где рекомбинантная и неприродная последовательность ДНК, кодирующая транспозон, представляет собой двухцепочечную последовательность ДНК doggybone™.30. The method of claim 25 or 26, wherein the recombinant and non-natural DNA sequence encoding the transposon is a double-stranded doggybone ™ DNA sequence.
31. Способ по п. 30, где последовательность ДНК doggybone™ получают ферментативным способом так, чтобы они по отдельности кодировали антигенный экспрессионный кластер, содержащий антиген, промотор, поли-A хвост и теломерные концы.31. The method of claim 30, wherein the doggybone ™ DNA sequence is obtained enzymatically so that they individually encode an antigen expression cluster containing an antigen, promoter, poly-A tail and telomeric ends.
32. Способ по любому из предшествующих пунктов, где иммунную клетку выделяют или получают от человека.32. The method according to any one of the preceding paragraphs, where the immune cell is isolated or obtained from a person.
33. Способ по любому из пп. 1-31, где иммунную клетку выделяют или получают от млекопитающего, не являющегося человеком.33. The method according to any one of paragraphs. 1-31, where the immune cell is isolated or obtained from a non-human mammal.
34. Способ по п. 33, где млекопитающим, не являющимся человеком, являются грызуны, кролики, кошки, собаки, свиньи, лошади, коровы, верблюды или приматы.34. The method of claim 33, wherein the non-human mammal is rodents, rabbits, cats, dogs, pigs, horses, cows, camels, or primates.
35. Способ по любому из предшествующих пунктов, где рекомбинантная и неприродная последовательность ДНК, кодирующая транспозон, также содержит последовательность, кодирующую химерный антигенный рецептор или его часть.35. The method according to any one of the preceding paragraphs, where the recombinant and non-natural DNA sequence encoding a transposon also contains a sequence encoding a chimeric antigenic receptor or part thereof.
36. Способ по п. 35, где часть последовательности, кодирующей химерный антигенный рецептор, кодирует антиген-распознающую область.36. The method according to p. 35, where part of the sequence encoding a chimeric antigenic receptor encodes an antigen-recognizing region.
37. Способ по п. 35 или 36, где антиген-распознающая область содержит одну или более гипервариабельных областей.37. The method of claim 35 or 36, wherein the antigen-recognizing region comprises one or more hypervariable regions.
38. Способ по п. 35 или 36, где антиген-распознающая область содержит антитело, антитело-миметик, каркасный белок или их фрагмент.38. The method of claim 35 or 36, wherein the antigen-recognizing region comprises an antibody, a mimetic antibody, a frame protein, or a fragment thereof.
39. Способ по п. 38, где антителом является химерное антитело, рекомбинантное антитело, гуманизованное антитело или человеческое антитело.39. The method of claim 38, wherein the antibody is a chimeric antibody, a recombinant antibody, a humanized antibody, or a human antibody.
40. Способ по п. 39, где антителом является антитело со скорректированной аффинностью.40. The method according to p. 39, where the antibody is an antibody with adjusted affinity.
41. Способ по п. 38, где антитело содержит или состоит из них, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), VHH, однодоменное антитело (sdAB), небольшую модульную иммунофармацевтическую (SMIP) молекулу или наноантитело.41. The method of claim 38, wherein the antibody comprises or consists of them, a single chain variable fragment (scFv), VHH, a single domain antibody (sdAB), a small modular immunopharmaceutical (SMIP) molecule, or a nanoantibody.
42. Способ по п. 41, где VHH является верблюжьим.42. The method of claim 41, wherein the VHH is camel.
43. Способ по п. 41 или 42, где VHH является гуманизованным.43. The method of claim 41 or 42, wherein the VHH is humanized.
44. Способ по п. 38, где фрагмент антитела включает или состоит из них, гипервариабельную область, вариабельную область, тяжелую цепь, легкую цепь или любые их комбинации.44. The method of claim 38, wherein the antibody fragment comprises or consists of them, a hypervariable region, a variable region, a heavy chain, a light chain, or any combination thereof.
45. Способ по п. 38, где антитело-миметик включает или состоит из них, аффинное антитело, аффилин, аффимер, аффитин, альфа-антитело, антикалин, авимер, DARPin, финомер, пептидный домен Кунитца или моноантитело.45. The method of claim 38, wherein the mimetic antibody comprises or consists of, an affinity antibody, affilin, affimer, affitin, alpha antibody, anticalin, avimer, DARPin, finomer, Kunitz peptide domain or monoantibody.
46. Способ по п. 38, где каркасный белок включает Центирин или состоит из него.46. The method according to p. 38, where the frame protein comprises Centirin or consists of it.
47. Способ по любому из пп. 5-46, где:47. The method according to any one of paragraphs. 5-46, where:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность ДНК, и(a) the nucleic acid sequence encoding the transposase enzyme is a DNA sequence, and
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляют 10 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.(b) the amount of the DNA sequence encoding the transposase enzyme and the amount of the DNA sequence encoding the transposon are 10 μg or less per 100 μl of reagent for electroporation or nucleofection.
48. Способ по п. 47, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляют 100 мкг/мл или менее.48. The method of claim 47, wherein the concentration of the DNA sequence encoding the transposase enzyme and the amount of the DNA sequence encoding the transposon in the electroporation or nucleofection reaction are 100 μg / ml or less.
49. Способ по любому из пп. 5-46, где:49. The method according to any one of paragraphs. 5-46, where:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность ДНК, и(a) the nucleic acid sequence encoding the transposase enzyme is a DNA sequence, and
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляют 7,5 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.(b) the amount of the DNA sequence encoding the transposase enzyme and the amount of the DNA sequence encoding the transposon are 7.5 μg or less per 100 μl of reagent for electroporation or nucleofection.
50. Способ по п. 49, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляют 75 мкг/мл или менее.50. The method of claim 49, wherein the concentration of the DNA sequence encoding the transposase enzyme and the amount of the DNA sequence encoding the transposon in the electroporation or nucleofection reaction are 75 μg / ml or less.
51. Способ по любому из пп. 5-46, где:51. The method according to any one of paragraphs. 5-46, where:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность ДНК, и(a) the nucleic acid sequence encoding the transposase enzyme is a DNA sequence, and
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляют 6,0 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.(b) the amount of the DNA sequence encoding the transposase enzyme and the amount of the DNA sequence encoding the transposon are 6.0 μg or less per 100 μl of reagent for electroporation or nucleofection.
52. Способ по п. 51, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляют 60 мкг/мл или менее.52. The method of claim 51, wherein the concentration of the DNA sequence encoding the transposase enzyme and the amount of the DNA sequence encoding the transposon in the electroporation or nucleofection reaction are 60 μg / ml or less.
53. Способ по п. 50 или 51, где транспозазой является транспозаза Sleeping Beauty.53. The method of claim 50 or 51, wherein the transposase is Sleeping Beauty transposase.
54. Способ по п. 53, где транспозазой Sleeping Beauty является транспозаза Sleeping Beauty 100X (SB100X).54. The method of claim 53, wherein the Sleeping Beauty transposase is the Sleeping Beauty 100X transposase (SB100X).
55. Способ по любому из пп. 5-46, где:55. The method according to any one of paragraphs. 5-46, where:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность ДНК, и(a) the nucleic acid sequence encoding the transposase enzyme is a DNA sequence, and
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляют 5,0 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.(b) the amount of the DNA sequence encoding the transposase enzyme and the amount of the DNA sequence encoding the transposon are 5.0 μg or less per 100 μl of reagent for electroporation or nucleofection.
56. Способ по п. 55, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляют 50 мкг/мл или менее.56. The method of claim 55, wherein the concentration of the DNA sequence encoding the transposase enzyme and the amount of the DNA sequence encoding the transposon in the electroporation or nucleofection reaction are 50 μg / ml or less.
57. Способ по любому из пп. 5-46, где:57. The method according to any one of paragraphs. 5-46, where:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность ДНК, и(a) the nucleic acid sequence encoding the transposase enzyme is a DNA sequence, and
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляют 2,5 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.(b) the amount of the DNA sequence encoding the transposase enzyme and the amount of the DNA sequence encoding the transposon are 2.5 μg or less per 100 μl of reagent for electroporation or nucleofection.
58. Способ по п. 57, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляют 25 мкг/мл или менее.58. The method of claim 57, wherein the concentration of the DNA sequence encoding the transposase enzyme and the amount of the DNA sequence encoding the transposon in the electroporation or nucleofection reaction are 25 μg / ml or less.
59. Способ по любому из пп. 5-46, где:59. The method according to any one of paragraphs. 5-46, where:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность ДНК, и(a) the nucleic acid sequence encoding the transposase enzyme is a DNA sequence, and
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляют 1,67 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.(b) the amount of the DNA sequence encoding the transposase enzyme and the amount of the DNA sequence encoding the transposon are 1.67 μg or less per 100 μl of reagent for electroporation or nucleofection.
60. Способ по п. 59, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляют 16,7 мкг/мл или менее.60. The method of claim 59, wherein the concentration of the DNA sequence encoding the transposase enzyme and the amount of the DNA sequence encoding the transposon in the electroporation or nucleofection reaction are 16.7 μg / ml or less.
61. Способ по п. 59 или 60, где транспозазой является транспозаза Super piggyBac (PB).61. The method according to p. 59 or 60, where the transposase is transposase Super piggyBac (PB).
62. Способ по любому из пп. 5-46, где:62. The method according to any one of paragraphs. 5-46, where:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность ДНК, и(a) the nucleic acid sequence encoding the transposase enzyme is a DNA sequence, and
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляют 0,55 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.(b) the amount of the DNA sequence encoding the transposase enzyme and the amount of the DNA sequence encoding the transposon are 0.55 μg or less per 100 μl of reagent for electroporation or nucleofection.
63. Способ по п. 62, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляют 5,5 мкг/мл или менее.63. The method of claim 62, wherein the concentration of the DNA sequence encoding the transposase enzyme and the amount of the DNA sequence encoding the transposon in the electroporation or nucleofection reaction are 5.5 μg / ml or less.
64. Способ по любому из пп. 5-46, где:64. The method according to any one of paragraphs. 5-46, where:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность ДНК, и(a) the nucleic acid sequence encoding the transposase enzyme is a DNA sequence, and
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляют 0,19 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.(b) the amount of the DNA sequence encoding the transposase enzyme and the amount of the DNA sequence encoding the transposon are 0.19 μg or less per 100 μl of reagent for electroporation or nucleofection.
65. Способ по п. 64, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляют 1,9 мкг/мл или менее.65. The method of claim 64, wherein the concentration of the DNA sequence encoding the transposase enzyme and the amount of the DNA sequence encoding the transposon in the electroporation or nucleofection reaction are 1.9 μg / ml or less.
66. Способ по любому из пп. 5-46, где:66. The method according to any one of paragraphs. 5-46, where:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность ДНК, и(a) the nucleic acid sequence encoding the transposase enzyme is a DNA sequence, and
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляют 0,1 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.(b) the amount of the DNA sequence encoding the transposase enzyme and the amount of the DNA sequence encoding the transposon are 0.1 μg or less per 100 μl of reagent for electroporation or nucleofection.
67. Способ по п. 66, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляют 1,0 мкг/мл или менее.67. The method of claim 66, wherein the concentration of the DNA sequence encoding the transposase enzyme and the amount of the DNA sequence encoding the transposon in the electroporation or nucleofection reaction are 1.0 μg / ml or less.
68. Способ по любому из пп. 5-46, где:68. The method according to any one of paragraphs. 5-46, where:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность РНК, и(a) the nucleic acid sequence encoding the transposase enzyme is an RNA sequence, and
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляет 10 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.(b) the amount of the DNA sequence encoding the transposon is 10 μg or less per 100 μl of reagent for electroporation or nucleofection.
69. Способ по п. 68, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляет 100 мкг/мл или менее.69. The method of claim 68, wherein the concentration of the DNA sequence encoding the transposon in the electroporation or nucleofection reaction is 100 μg / ml or less.
70. Способ по любому из пп. 5-46, где:70. The method according to any one of paragraphs. 5-46, where:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность РНК, и(a) the nucleic acid sequence encoding the transposase enzyme is an RNA sequence, and
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляет 7,5 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.(b) the amount of the DNA sequence encoding the transposon is 7.5 μg or less per 100 μl of reagent for electroporation or nucleofection.
71. Способ по п. 70, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляет 75 мкг/мл или менее.71. The method according to p. 70, where the concentration of the DNA sequence encoding the transposon in the electroporation or nucleofection reaction is 75 μg / ml or less.
72. Способ по любому из пп. 5-46, где:72. The method according to any one of paragraphs. 5-46, where:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность РНК, и(a) the nucleic acid sequence encoding the transposase enzyme is an RNA sequence, and
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляет 6,0 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.(b) the amount of the DNA sequence encoding the transposon is 6.0 μg or less per 100 μl of reagent for electroporation or nucleofection.
73. Способ по п. 72, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляет 60 мкг/мл или менее.73. The method of claim 72, wherein the concentration of the DNA sequence encoding the transposon in the electroporation or nucleofection reaction is 60 μg / ml or less.
74. Способ по п. 72 или 73, где транспозазой является транспозаза Sleeping Beauty.74. The method of claim 72 or 73, wherein the transposase is Sleeping Beauty transposase.
75. Способ по п. 74, где транспозазой Sleeping Beauty является транспозаза Sleeping Beauty 100X (SB100X).75. The method of claim 74, wherein the Sleeping Beauty transposase is the Sleeping Beauty 100X transposase (SB100X).
76. Способ по любому из пп. 5-46, где:76. The method according to any one of paragraphs. 5-46, where:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность РНК, и(a) the nucleic acid sequence encoding the transposase enzyme is an RNA sequence, and
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляет 5,0 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.(b) the amount of the DNA sequence encoding the transposon is 5.0 μg or less per 100 μl of reagent for electroporation or nucleofection.
77. Способ по п. 76, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляет 50 мкг/мл или менее.77. The method of claim 76, wherein the concentration of the DNA sequence encoding the transposon in the electroporation or nucleofection reaction is 50 μg / ml or less.
78. Способ по любому из пп. 5-46, где:78. The method according to any one of paragraphs. 5-46, where:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность РНК, и(a) the nucleic acid sequence encoding the transposase enzyme is an RNA sequence, and
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляет 2,5 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.(b) the amount of the DNA sequence encoding the transposon is 2.5 μg or less per 100 μl of reagent for electroporation or nucleofection.
79. Способ по п. 78, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляет 25 мкг/мл или менее.79. The method of claim 78, wherein the concentration of the DNA sequence encoding the transposon in the electroporation or nucleofection reaction is 25 μg / ml or less.
80. Способ по любому из пп. 5-46, где:80. The method according to any one of paragraphs. 5-46, where:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность РНК, и(a) the nucleic acid sequence encoding the transposase enzyme is an RNA sequence, and
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляет 1,67 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.(b) the amount of the DNA sequence encoding the transposon is 1.67 μg or less per 100 μl of reagent for electroporation or nucleofection.
81. Способ по п. 80, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляет 16,7 мкг/мл или менее.81. The method of claim 80, wherein the concentration of the DNA sequence encoding the transposon in the electroporation or nucleofection reaction is 16.7 μg / ml or less.
82. Способ по п. 80 или 81, где транспозазой является транспозаза Super piggyBac (PB).82. The method of claim 80 or 81, wherein the transposase is Super piggyBac (PB) transposase.
83. Способ по любому из пп. 5-46, где:83. The method according to any one of paragraphs. 5-46, where:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность РНК, и(a) the nucleic acid sequence encoding the transposase enzyme is an RNA sequence, and
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляет 0,55 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.(b) the amount of the DNA sequence encoding the transposon is 0.55 μg or less per 100 μl of reagent for electroporation or nucleofection.
84. Способ по п. 83, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляет 5,5 мкг/мл или менее.84. The method of claim 83, wherein the concentration of the DNA sequence encoding the transposon in the electroporation or nucleofection reaction is 5.5 μg / ml or less.
85. Способ по любому из пп. 5-46, где:85. The method according to any one of paragraphs. 5-46, where:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность РНК, и(a) the nucleic acid sequence encoding the transposase enzyme is an RNA sequence, and
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляет 0,19 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.(b) the amount of the DNA sequence encoding the transposon is 0.19 μg or less per 100 μl of reagent for electroporation or nucleofection.
86. Способ по п. 85, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляет 1,9 мкг/мл или менее.86. The method of claim 85, wherein the concentration of the DNA sequence encoding the transposon in the electroporation or nucleofection reaction is 1.9 μg / ml or less.
87. Способ по любому из пп. 5-46, где:87. The method according to any one of paragraphs. 5-46, where:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность РНК, и(a) the nucleic acid sequence encoding the transposase enzyme is an RNA sequence, and
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляет 0,1 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.(b) the amount of the DNA sequence encoding the transposon is 0.1 μg or less per 100 μl of reagent for electroporation or nucleofection.
88. Способ по п. 87, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляет 1,0 мкг/мл или менее.88. The method of claim 87, wherein the concentration of the DNA sequence encoding the transposon in the electroporation or nucleofection reaction is 1.0 μg / ml or less.
89. Иммунная клетка, модифицированная способом по любому из пп. 1-88.89. An immune cell modified by the method according to any one of paragraphs. 1-88.
90. Иммунная клетка по п. 89, где иммунной клеткой являются T-лимфоцит, природная клетка-киллер (NK), клетка-киллер, индуцированная цитокином (CIK) или природная Т-клетка-киллер (NКТ).90. The immune cell of claim 89, wherein the immune cell is a T-lymphocyte, a natural killer cell (NK), a cytokine-induced killer cell (CIK), or a natural killer T cell (NKT).
91. Иммунная клетка по п. 89 или 90, дополнительно модифицированная посредством второго инструмента для редактирования генов.91. The immune cell of claim 89 or 90, further modified by a second gene editing tool.
92. Иммунная клетка по п. 91, где второй инструмент для редактирования генов включает эндонуклеазу, функционально присоединенную к последовательности Cas9 или TALE.92. The immune cell of claim 91, wherein the second gene editing tool comprises an endonuclease operably linked to a Cas9 or TALE sequence.
93. Иммунная клетка по п. 92, где эндонуклеаза функционально присоединена к последовательности Cas9 или TALE посредством ковалентной связи.93. The immune cell of claim 92, wherein the endonuclease is operably linked to a Cas9 or TALE sequence via a covalent bond.
94. Иммунная клетка по п. 92, где эндонуклеаза функционально присоединена к последовательности Cas9 или TALE посредством нековалентной связи.94. The immune cell of claim 92, wherein the endonuclease is operably linked to a Cas9 or TALE sequence via a non-covalent bond.
95. Иммунная клетка по любому из пп. 89-94, где Cas9 представляет собой инактивированную Cas9 (dCas9).95. The immune cell according to any one of paragraphs. 89-94, where Cas9 is inactivated Cas9 (dCas9).
96. Иммунная клетка по п. 95, где инактивированная Cas9 включает D10A и N580A в каталитическом сайте.96. The immune cell of claim 95, wherein the inactivated Cas9 comprises D10A and N580A at the catalytic site.
97. Иммунная клетка по п. 95 или 96, где Cas9 представляет собой небольшую и инактивированную Cas9 (dSaCas9).97. The immune cell according to claim 95 or 96, where Cas9 is a small and inactivated Cas9 (dSaCas9).
98. Иммунная клетка по п. 97, где dSaCas9 содержит аминокислотную последовательность:98. The immune cell according to p. 97, where dSaCas9 contains the amino acid sequence:
mkrnyilglaigitsvg ygiidyetrdvidagvr lfkeanvennegrrsk rgarrlkrrrrhriqrv kkllfdynlltdhsels ginpyearvkglsqkls eeefsaallhlakrrgv hnvneveedtgnelstk eqisrnskaleekyvae lqlerlkkdgevrgsin rfktsdyvkeakqllkv qkayhqldqsfidtyid lletrrtyyegpgegsp fgwkdikewyemlmghc tyfpeelrsvkyaynad lynalndlnnlvitrde nekleyyekfqiienvf kqkkkptlkqiakeilv needikgyrvtstgkpe ftnlkvyhdikditark eiienaelldqiakilt iyqssediqeeltnlns eltqeeieqisnlkgyt gthnlslkainlildel whtndnqiaifnrlklv pkkvdlsqqkeipttlv ddfilspvvkrsfiqsi kvinaiikkyglpndii ielareknskdaqkmin emqkrnrqtnerieeii rttgkenakyliekikl hdmqegkclysleaipl edllnnpfnyevdhiip rsvsfdnsfnnkvlvkq eeaskkgnrtpfqylss sdskisyetfkkhilnl akgkgrisktkkeylle erdinrfsvqkdfinrn lvdtryatrglmnllrs yfrvnnldvkvksingg ftsflrrkwkfkkernk gykhhaedaliianadf ifkewkkldkakkvmen qmfeekqaesmpeiete qeykeifitphqikhik dfkdykyshrvdkkpnr elindtlystrkddkgn tlivnnlnglydkdndk lkklinkspekllmyhh dpqtyqklklimeqygd eknplykyyeetgnylt kyskkdngpvikkikyy gnklnahlditddypns rnkvvklslkpyrfdvy ldngvykfvtvknldvi kkenyyevnskcyeeak klkkisnqaefiasfyn ndlikingelyrvigvn ndllnrievnmidityr eylenmndkrppriikt iasktqsikkystdilg nlyevkskkhpqiikkg (SEQ ID NO: 4).mkrnyilglaigitsvg ygiidyetrdvidagvr lfkeanvennegrrsk rgarrlkrrrrhriqrv kkllfdynlltdhsels ginpyearvkglsqkls eeefsaallhlakrrgv hnvneveedtgnelstk eqisrnskaleekyvae lqlerlkkdgevrgsin rfktsdyvkeakqllkv qkayhqldqsfidtyid lletrrtyyegpgegsp fgwkdikewyemlmghc tyfpeelrsvkyaynad lynalndlnnlvitrde nekleyyekfqiienvf kqkkkptlkqiakeilv needikgyrvtstgkpe ftnlkvyhdikditark eiienaelldqiakilt iyqssediqeeltnlns eltqeeieqisnlkgyt gthnlslkainlildel whtndnqiaifnrlklv pkkvdlsqqkeipttlv ddfilspvvkrsfiqsi kvinaiikkyglpndii ielareknskdaqkmin emqkrnrqtnerieeii rttgkenakyliekikl hdmqegkclysleaipl edllnnpfnyevdhiip rsvsfdnsfnnkvlvkq eeaskkgnrtpfqylss sdskisyetfkkhilnl akgkgrisktkkeylle erdinrfsvqkdfinrn lvdtryatrglmnllrs yfrvnnldvkvksingg ftsflrrkwkfkkernk gykhhaedaliianadf ifkewkkldkakkvmen qmfeekqaesmpeiete qeykeifitphqikhik dfkdykyshrvdkkpnr elindtlystrkddkgn tlivnnlnglydkdndk lkklinkspekllmyhh dpqtyqklklimeqygd eknplykyyeetgnylt kyskkdngpvikkikyy gnklnahlditddypns rnkvvklslkpyrfdvy ldngvykfvtvknldvi kkenyyevnsk cyeeak klkkisnqaefiasfyn ndlikingelyrvigvn ndllnrievnmidityr eylenmndkrppriikt iasktqsikkystdilg nlyevkskkhpqiikkg (SEQ ID NO: 4).
99. Композиция, содержащая иммунную клетку по любому из пп. 89-98.99. A composition comprising an immune cell according to any one of paragraphs. 89-98.
100. Применение композиции по п. 99 для лечения заболевания или расстройства у индивидуума, нуждающегося в этом.100. The use of the composition of claim 99 for treating a disease or disorder in an individual in need thereof.
101. Применение по п. 100, где заболеванием или расстройством является рак.101. The use of claim 100, wherein the disease or disorder is cancer.
102. Применение по п. 100, где заболеванием или расстройством является инфекционное заболевание.102. The use of claim 100, wherein the disease or disorder is an infectious disease.
103. Применение по любому из пп. 99-102, где иммунная клетка является аутологичной.103. The use according to any one of paragraphs. 99-102, where the immune cell is autologous.
104. Применение по любому из пп. 99-102, где иммунная клетка является аллогенной.104. The use according to any one of paragraphs. 99-102, where the immune cell is allogeneic.
105. Культуральная среда для повышения жизнеспособности модифицированной иммунной клетки, содержащей IL-2, IL-21, IL-7, IL-15 или любые их комбинации.105. Culture medium for increasing the viability of a modified immune cell containing IL-2, IL-21, IL-7, IL-15, or any combination thereof.
106. Культуральная среда по п. 105, где модифицированной иммунной клеткой являются T-лимфоцит, природная клетка-киллер (NK), клетка-киллер, индуцированная цитокином (CIK) или природная Т-клетка-киллер (NКТ).106. The culture medium of claim 105, wherein the modified immune cell is a T-lymphocyte, a natural killer cell (NK), a cytokine-induced killer cell (CIK), or a natural killer T cell (NKT).
107. Культуральная среда по п. 105 или 106, где модифицированная иммунная клетка содержит одну или более экзогенных последовательностей ДНК.107. The culture medium of claim 105 or 106, wherein the modified immune cell contains one or more exogenous DNA sequences.
108. Культуральная среда по п. 105 или 106, где модифицированная иммунная клетка содержит одну или более экзогенных последовательностей РНК.108. The culture medium of claim 105 or 106, wherein the modified immune cell contains one or more exogenous RNA sequences.
109. Культуральная среда по любому из пп. 105-108, где модифицированная иммунная клетка была подвергнута электропорации или нуклеофекции.109. The culture medium according to any one of paragraphs. 105-108, where the modified immune cell was subjected to electroporation or nucleofection.