RU2017820C1 - Фрагмент комплементарной днк вируса желтухи сахарной свеклы, кодирующий ген капсидного белка - Google Patents

Фрагмент комплементарной днк вируса желтухи сахарной свеклы, кодирующий ген капсидного белка Download PDF

Info

Publication number
RU2017820C1
RU2017820C1 SU4950054A RU2017820C1 RU 2017820 C1 RU2017820 C1 RU 2017820C1 SU 4950054 A SU4950054 A SU 4950054A RU 2017820 C1 RU2017820 C1 RU 2017820C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
virus
capsid protein
sugar beet
fragment
protein gene
Prior art date
Application number
Other languages
English (en)
Inventor
А.А. Аграновский
В.П. Бойко
А.В. Карасев
В.В. Доля
И.Г. Атабеков
Original Assignee
Акционерное общество закрытого типа "Институт биотехнологии"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Акционерное общество закрытого типа "Институт биотехнологии" filed Critical Акционерное общество закрытого типа "Институт биотехнологии"
Priority to SU4950054 priority Critical patent/RU2017820C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2017820C1 publication Critical patent/RU2017820C1/ru

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Сущность изобретения: получен ген капсидного белка вируса желтухи сахарной свеклы, который может быть использован для конструирования трансгенных растений, устойчивых к вирусу. Определена нуклеотидная последовательность из 688 нуклеотидных остатков, она содержит 5′ - некодирующую область с точкой старта мРНК для капсидного белка и открытую рамку трансляции, кодирующую капсидный белок из 203 аминокислотных остатков, не считая N-концевого метионина, удаляемого посттрансляционно.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, представляет собой фрагмент комплементарной ДНК вируса желтухи сахарной свеклы (ВЖС), кодирующий ген капсидного белка, и может быть использовано для защиты растений.
Вирусные желтухи сахарной свеклы наносят существенный урон урожаю. В зависимости от вируса и срока заражения потери урожая корнеплодов колеблются от 40 до 60%, а выхода сахара - от 50 до 80%. Вирус желтухи сахарной свеклы (ВЖС) - наиболее вредоносный из комплекса вирусов, вызывающих желтухи (Watson et al., 1953; Smith & Hinckes, 1987).
Из-за особенностей биологии ВЖС агротехнические мероприятия дают эффект при защите сахарной свеклы от ВЖС лишь ценой значительных затрат на постоянный мониторинг и обработки инсектицидами (Smith & Hinckes, 1987). По экологическим соображениям внесение пестицидов желательно ограничить до минимума, что вступает в противоречие с требованиями защиты растений. Наиболее экологически перспективными являются биологические методы защиты растений.
Несмотря на отмеченную корреляцию между содержанием вируса в растении и потерей урожая, считается, что целью защиты растений является не снижение концентрации вируса или его полное исчезновение, а борьба с симптомами вирусного заболевания (Beachy et al., 1990).
В настоящее время перспективны три направления биологической защиты растений (Beachy et al., 1990).
1. Безвирусное растениеводство, основанное на культуре меристемной ткани, свободной от вируса.
2 Поиск природного гена устойчивости и перенос его в геном культурных растений.
3. Введение в геном растения генов или фрагментов генома фитовирусов.
Безвирусное растениеводство, несмотря на ряд достоинств, неприменимо к культуре сахарной свеклы.
Второе направление не получило применения в защите сахарной свеклы, поскольку поиск и выделение природных генов устойчивости пока не увенчался успехом.
В настоящее время применение получило третье направление - введение в геном растения генов или фрагментов генома фитовирусов. Наиболее перспективным, в том числе и для сахарной свеклы, считается введение в геном растения ДНК, включающей ген капсидного белка соответствующего вируса в конструкциях, обеспечивающих синтез белка оболочки в трансгенных растениях (Beachy et. al., 1990; Powell et al., 1990). Чтобы создать такую конструкцию, необходимо определить первичную структуру гена белка оболочки. Особенностью этого типа защиты является строгая специфичность против данного вируса, а часто даже против конкретного штамма вируса.
Прототипом данного изобретения можно рассматривать ген капсидного белка вируса слабого пожелтения сахарной свеклы (ВСПС) (Veidt et al., 1988), одного из комплекса вирусов, вызывающих желтухи.
Недостатком прототипа можно считать то, что это ген капсидного белка лишь одного (ВСПС) из нескольких вирусов, вызывающих желтухи и не может обеспечить устойчивость растений к ВЖС. Первичная структура гена капсидного белка ВЖС ранее была неизвестна.
Целью изобретения является получение гена капсидного белка вируса желтухи сахарной свеклы для конструирования в дальнейшем трансгенных растений, устойчивых к вирусу.
Изобретение представляет собой ген капсидного белка ВЖС, нуклеотидная последовательность которого определена методом Сэнгера с помощью дидезоксинуклеотидных терминирующих аналогов по комплементарной ДНК, синтезированной на вирусспецифической РНК с использованием обратной транскриптазы. Последовательность состоит из 688 нуклеотидных остатков; она содержит 5'-некодирующую область с точкой старта мРНК для капсидного белка и область, кодирующую капсидный белок из 203 аминокислотных остатков, не считая N-концевого метионина, удаляемого посттрансляционно. Идентичность капсидного белка и кодируемого данной последовательностью белкового продукта установлена иммунопреципитацией продукта трансляции данного гена антисывороткой к ВЖС.
П р и м е р. В качестве исходного материала для получения кДНК-клонов используется РНК ВЖС, выделенная из очищенного препарата вируса и фракционированная в градиенте концентрации сахарозы как описано ранее (Karasev et al. , 1989). 20 мкг очищенной РНК ВЖС отжигается с 0,2 о.е. синтетического праймера IV, 5' d(CAAGGCTCGAGAAGTTTCACC)3', в 20 мМ Трис-HCl буфере pH 7,5 с 0,1 М NaCl, 1 мМ ЭДТА при 56оС в течение 1,5 ч. Синтез первой цепи проводится обратной транскриптазой вируса птичьего миелобластоза (Омутнинск); синтез второй цепи - ДНК-полимеразой 1 и РНКазой н по методу (Gubler, 1988). Двуцепочечные кДНК разделяют электрофорезом в 0,8% легкоплавкой агарозе, вырезают фракцию размером более 1,5 т.п.н., элюируют ее из геля и лигируют в плазмиду pTZ19, разрезанную рестриктазой Smal. После трансформации компетентных клеток E.coli XL-1 рекомбинантные клоны, содержащие вирусспецифическую вставку отбирают гибридизацией in situ. В качестве зонда при этом используют кДНК, синтезированную на матрице РНК ВЖС обратной транскриптазой вируса птичьего миелобластоза с использованием праймера IV, меченного полинуклеотидкиназой фага Т4 в реакции с γ -[32P]АТФ. Из 200 клонов был отобран 1 (клон х19), содержавший вставку размером 1,8 т.п.н., имевший вблизи 1 из концов сайт узнавания рестриктазы Хhol и дававший сильный гибридизационный сигнал. Данный вирусспецифический фрагмент имел 1 внутренний BamHI, 1 внутренний Xho1 и 3 внутренних EcoRI-сайта. Были получены 3 субклона: х19(Bam-Xho1) и х19(Есо2-Xho1) фрагменты, лигированные в pTZ19, и х19(Хho1-Bam), лигированный в pTZ18. После трансформации и отбора клонов были синтезированы соответствующие им одноцепочные ДНК-матрицы, которые были использованы в секвенирующих реакциях с использованием набора SequenaseTM (Pharmacia) и α -[32P]АТФ. Продукты реакции разделяли в 6% полиакриламидном геле в присутствии 7 М мочевины при 55оС и авторадиографировали в течение ночи. Чтение последовательности проводили визуально. Последовательность из 688 нуклеотидов содержала 1 открытую рамку трансляции, способную кодировать белок с мол. массой 22,2 кДа. Размер этого белка и его аминокислотный состав полностью совпали с размером и аминокислотным составом капсидного белка ВЖС, установленными ранее (Carpenter et al., 1977). Для окончательной идентификации капсидного белка ВЖС двуцепочечная ДНК субклона pTZ18-x19(Xho1-Bam) линеаризовалась рестриктазой Pstl и использовалась для транскрипции in vitro РНК-полимеразой фага Т7, и полученный транскрипт транслировали в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика. Продукты трансляции синтетического транскрипта анализировали до и после иммунопреципитации сывороткой к ВЖС в полиакриламидном геле ка описано ранее (Rarasev et al. , 1989) Транскрипт клона pTZ18-x19(Xhо1-Bam) направляет синтез одного продукта, не содержащего метионина, который положительно реагирует с сывороткой к ВЖС.
Таким образом, получен ген капсидного белка ВЖС, включая кодирующую область (615 нуклеотидов) и примыкающую к ней 5' некодирующую область (73 нуклеотида), который может быть использован для получения трансгенных растений, устойчивых к ВЖС. Ниже приведена нуклеотидная последовательность гена капсидного белка ВЖС и аминокислотная последовательность самого капсидного белка (СР) ею кодируемого.
TAACACAGTTACTAAGGTTCCATTTTAT
10 20
-> (CP)
M G S A E TACAGTATTGTTTTTGTTTTAGCGTAATCGTACTTGAGTTTCGTTATGGGATCAGCTGAA 30 40 50 60 70 80 P I S A I A T F E N V S L A D Q T C L H CCTATTAGTGCAATCGCGACTTTTGAAAACGTAAGTCTCGCAGACCAAACCTGTTTGCAC 90 100 110 120 130 140 G E D C D K L R K N F E E C L K L K G V GGAGAAGACTGCGATAAACTTAGGAAGAACTTCGAAGAGTGTTTGAAATTAAAAGGGGTT 150 160 170 180 190 200 P E D N L G I A L G L C L Y S C A T I G CCGGAAGATAACCTCGGAATCGCGTTAGGACTTTGTTTGTATTCCTGTGCTACGATAGGC 210 220 230 240 250 260 T S N K V N V Q P T S T F I K A S F G G ACTTCCAACAAAGTTAACGTCCAACCGACGTCTACCTTCATCAAAGCTTCGTTTGGTGGT 270 280 290 300 310 320 G K E L Y L T H G E L N S F L G S Q K L GGGAAGGAACTGTACCTCACTCACGGTGAATTGAATTCCTTTCTGGGGTCTCAAAAACTT 330 340 350 360 370 380 L E G K P N K L R C F C R T F Q K D Y I TTGGAGGGAAAACCTAACAAATTGCGGTGTTTCTGCCGTACTTTTCAGAAGGACTACATA 390 400 410 420 430 440 S L R K E Y R G K L P P I A R A N R H G TCCTTGCGCAAGGAATACCGAGGGAAATTACCTCCGATTGCCAGAGCTAACCGTCACGGT 450 460 470 480 490 500 L P A E D H Y L A A D F I S T S T E L T CTACCCGCTGAAGATCACTACTTAGCCGCTGACTTCATATCGACGTCGACGGAACTCACT 510 520 530 540 550 560 D L Q Q S R L L L A R E N A T H T E F S GACCTACAACAAAGTCGTCTGCTGTTAGCGCGCGAAAACGCCACTCACACGGAATTCTCG 570 580 590 600 610 620 S E S P V T S L K Q L G R G L G T G R * TCTGAATCACCGGTAACCAGTTTGAAACAACTAGGTCGTGGTCTAGGCACCGGGAGATGA 630 640 650 660 670 680

Claims (1)

  1. ФРАГМЕНТ КОМПЛЕМЕНТАРНОЙ ДНК ВИРУСА ЖЕЛТУХИ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ, КОДИРУЮЩИЙ ГЕН КАПСИДНОГО БЕЛКА, полученный в реакции обратной транскрипции вирусспецифической РНК, содержащий 688 нуклеотидов, из них 73 нуклеотида в 51-некодирующей области и 615 нуклеотидов в открытой рамке трансляции, кодирующих капсидный белок вируса желтухи сахарной свеклы из 204 аминокислотных остатков, и имеющий следующую последовательность:
    TAACACAGTTACTAAGGTTCCATTT
    10 20
    MGSAE
    TATTACAGTATTGTTTTTGTTTTAG
    30 40 50
    PISAIAT
    CGTAATCGTACTTGAGTTTCGTTAT
    60 70
    FENVSLADQ
    GGGATCAGCTGAACCTATTAGTGCA
    80 90 100
    TCLHGEDC
    ATCGCGACTTTTGAAAACGTAAGTC
    110 120
    DKLRKNFE
    TCGCAGACCAAACCTGTTTGCACGG
    130 140 150
    ECLKLKGVP
    AGAAGACTGCGATAAACTTAGGAAG
    160 170
    EDNLGIAL
    AACTTCGAAGAGTGTTTGAAATTAA
    180 190 200
    GLCLYSCA
    AAGGGGTTCCGGAAGATAACCTCGG
    210 220
    TIGTSNKVN
    AATCGCGTTAGGACTTTGTTTGTAT
    230 240 250
    VQPTSTFI
    TCCTGTGCTACGATAGGCACTTCCA
    260 270
    KASFGGGK
    ACAAAGTTAACGTCCAACCGACGTC
    280 290 300
    ELYLTHGEL
    TACCTTCATCAAAGCTTCGTTTGGT
    310 320
    NSFLGSQK
    GGTGGGAAGGAACTGTACCTCACTC
    330 340 350
    LLEGKPNK
    ACGGTGAATTGAATTCCTTTCTGGG
    360 370
    LRCFCRTFQ
    GTCTCAAAAACTTTTGGAGGGAAAA
    380 390 400
    KDYISLRK
    CCTAACAAATTGCGGTGTTTCTGCC
    410 420
    EYRGKLPP
    GTACTTTTCAGAAGGACTACATATC
    430 440 450
    IARANRHGL
    CTTGCGCAAGGAATACCGAGGGAAA
    460 470
    PAEDHYLA
    TTACCTCCGATTGCCAGAGCTAACC
    480 490 500
    ADFISTST
    GTCACGGTCTACCCGCTGAAGATCA
    510 520
    ELTDLQQSR
    CTACTTAGCCGCTGACTTCATATCG
    530 540 550
    LLLARENA
    ACGTCGACGGAACTCACTGACCTAC
    560 570
    THTEFSSE
    AACAAAGTCGTCTGCTGTTAGCGCG
    580 590 600
    SPVTSLKQL
    CGAAAACGCCACTCACACGGAATTC
    610 620
    GRGLGTGR
    TCGTCTGAATCACCGGTAACCAGTT
    630 640 650
    *
    TGAAACAACTAGGTCGTGGTCTAGG
    660 670
    CACCGGGAGATGA
    680 .
SU4950054 1991-06-27 1991-06-27 Фрагмент комплементарной днк вируса желтухи сахарной свеклы, кодирующий ген капсидного белка RU2017820C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU4950054 RU2017820C1 (ru) 1991-06-27 1991-06-27 Фрагмент комплементарной днк вируса желтухи сахарной свеклы, кодирующий ген капсидного белка

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU4950054 RU2017820C1 (ru) 1991-06-27 1991-06-27 Фрагмент комплементарной днк вируса желтухи сахарной свеклы, кодирующий ген капсидного белка

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2017820C1 true RU2017820C1 (ru) 1994-08-15

Family

ID=21581676

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU4950054 RU2017820C1 (ru) 1991-06-27 1991-06-27 Фрагмент комплементарной днк вируса желтухи сахарной свеклы, кодирующий ген капсидного белка

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2017820C1 (ru)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Veidt.I. et al, 1988, Nucleic Acids Research, 16, PP. 9917 - 9932. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Patterson et al. Expression and regulation by interferon of a double-stranded-RNA-specific adenosine deaminase from human cells: evidence for two forms of the deaminase
Rizzo et al. Construction of full-length cDNA clones of cucumber mosaic virus RNAs 1, 2 and 3: generation of infectious RNA transcripts
US5466788A (en) Subgenomic promoter
Owen et al. Nucleotide sequence and evolutionary relationships of cucumber mosaic virus (CMV) strains: CMV RNA 3
Wirblich et al. European brown hare syndrome virus: relationship to rabbit hemorrhagic disease virus and other caliciviruses
Guilley et al. Nucleotide sequence and genome organization of carnation mottle virus RNA
Crews et al. The Drosophila single-minded gene encodes a nuclear protein with sequence similarity to the per gene product
Hamilton et al. The complete nucleotide sequence of tobacco rattle virus RNA-1
German et al. Nucleotide sequence and genomic organization of apple chlorotic leaf spot closterovirus
Dorokhov et al. Complete nucleotide sequence and genome organization of a tobamovirus infecting cruciferae plants
US5633447A (en) Plant tissue comprising a subgenomic promoter
Bujarski et al. Modulation of replication, aminoacylation and adenylation in vitro and infectivity in vivo of BMV RNAs containing deletions within the multifunctional 3′ end.
WO1990012107A1 (en) Recombinant expression system based on satellite tobacco mosaic virus
Darlix et al. Analytical study of avian reticuloendotheliosis virus dimeric RNA generated in vivo and in vitro
Hagiwara et al. A single amino acid substitution in 126-kDa protein of Pepper mild mottle virus associates with symptom attenuation in pepper; the complete nucleotide sequence of an attenuated strain, C-1421
Yang et al. Involvement of a subgenomic mRNA in the generation of a variable population of defective citrus tristeza virus molecules
Blok et al. Sequences of 10 variants of the satellite-like RNA-3 of groundnut rosette virus
Gustafson et al. Nucleotide sequence of barley stripe mosaic virus RNAα: RNAα encodes a single polypeptide with homology to corresponding proteins from other viruses
Ryu et al. The complete nucleotide sequence and genome organization of odontoglossum ringspot tobamovirus RNA
Gurdon et al. Embryonic induction and muscle gene activation
Aloni et al. Attenuation May Regulate Gene Expression in Animal Viruses and Cell
RU2017820C1 (ru) Фрагмент комплементарной днк вируса желтухи сахарной свеклы, кодирующий ген капсидного белка
Reeder et al. Linker scanner mutagenesis of the Xenopus laevis ribosomal gene promoter
Gargouri-Bouzid et al. The 3′ promoter region involved in RNA synthesis directed by the turnip yellow mosaic virus genome in vitro
EP0178314A1 (en) An improved method of cloning double-stranded rna, and its use in the production of viral gene clones