Claims (12)
1. Способ получения обкладочных клеток из обонятельной выстилки млекопитающих для лечения травм спинного мозга, включающий этапы, на которых:1. A method of obtaining parietal cells from the olfactory lining of mammals for the treatment of spinal cord injuries, comprising the steps of:
получают образцы ткани из обонятельной выстилки носа млекопитающего;receive tissue samples from the olfactory nose of the mammal;
промывают их;washed them;
ткань инкубируют с диспазой II в концентрации 2 мг/мл в течение 1 часа при 37°С;tissue is incubated with dispase II at a concentration of 2 mg / ml for 1 hour at 37 ° C;
ткань переносят в среду DMEM:F12(1:1) с антибиотиками и механически отделяют обонятельный эпителий от собственной пластинки;the tissue is transferred to DMEM: F12 (1: 1) with antibiotics and the olfactory epithelium is mechanically separated from its own plate;
собственную пластинку измельчают и культивируют в виде эксплантной культуры в течение 14 дней в среде DMEM:F12(1:1), содержащей 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ед/мл пенициллина и 60 мкг/мл гентамицина, смену среды производят каждые три дня;own plate is crushed and cultured as an explant culture for 14 days in DMEM: F12 (1: 1) medium containing 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 100 μg / ml streptomycin, 100 u / ml penicillin and 60 μg / ml of gentamicin, a change of medium is performed every three days;
после образования монослоя инкубируют клетки с 0,05%-ным раствором трипсина 2 минуты при 37°С, инактивируют фермент средой с сывороткой, ресуспендируют и центрифугируют 2 минуты при 900 g;after the formation of a monolayer, cells with a 0.05% trypsin solution are incubated for 2 minutes at 37 ° C, the enzyme is inactivated with serum medium, resuspended and centrifuged for 2 minutes at 900 g;
полученные клетки помещают на пластик, покрытый 0,01%-ным поли- L-лизином, и культивируют в среде DMEM:F12(1:1), содержащей 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1% ITS, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ед/мл пенициллина и 500 нг/мл гидрокортизона, в течение 3 дней;the obtained cells are placed on a plastic coated with 0.01% poly-L-lysine and cultured in DMEM: F12 (1: 1) medium containing 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1% ITS, 100 μg / ml of streptomycin, 100 units / ml of penicillin and 500 ng / ml of hydrocortisone, for 3 days;
полученные клетки охарактеризовывают по маркерам p75NTR и GFAP.the resulting cells are characterized by p75NTR and GFAP markers.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что при необходимости после получения образцов ткани и до момента начала эксперимента по получению первичной культуры образцы ткани обонятельной выстилки носа млекопитающего транспортируют в питательной среде DMEM:F12(1:1) и хранят при +4°С не более 2 часов.2. The method according to p. 1, characterized in that, if necessary, after obtaining tissue samples and before the start of the experiment to obtain the primary culture, tissue samples of the olfactory nose of the mammal are transported in a nutrient medium DMEM: F12 (1: 1) and stored at +4 ° C no more than 2 hours.
3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что образцы ткани обонятельной выстилки промывают в среде DMEM:F12(1:1) с антибиотиками 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина не менее 3 раз.3. The method according to p. 1, characterized in that the tissue samples of the olfactory lining are washed in DMEM: F12 (1: 1) with antibiotics 100 μg / ml streptomycin and 100 units / ml penicillin at least 3 times.
4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что механическое отделение обонятельного эпителия от собственной пластинки производят посредством микрошпателя в чашке Петри со средой DMEM:F12(1:1) с антибиотиками 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина.4. The method according to p. 1, characterized in that the mechanical separation of the olfactory epithelium from its own plate is performed by means of a micro spatula in a Petri dish with DMEM: F12 medium (1: 1) with antibiotics 100 μg / ml streptomycin and 100 units / ml penicillin.