RU2016901C1 - Immobilized catalase - Google Patents

Immobilized catalase Download PDF

Info

Publication number
RU2016901C1
RU2016901C1 SU4953337A RU2016901C1 RU 2016901 C1 RU2016901 C1 RU 2016901C1 SU 4953337 A SU4953337 A SU 4953337A RU 2016901 C1 RU2016901 C1 RU 2016901C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
catalase
immunoglobulin
sorbent
immobilized
kigs
Prior art date
Application number
Other languages
Russian (ru)
Inventor
С.Г. Благородов
Л.Д. Мартыненко
Л.В. Свечникова
А.П. Шепелев
Original Assignee
Научно-производственное объединение "Биопрепарат"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Научно-производственное объединение "Биопрепарат" filed Critical Научно-производственное объединение "Биопрепарат"
Priority to SU4953337 priority Critical patent/RU2016901C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2016901C1 publication Critical patent/RU2016901C1/en

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: method involves immobilization of catalase with immunoglobulin and polystyrene. Immobilized enzyme shows stability and can be used repeatedly. EFFECT: increased activity of catalase. 5 tbl

Description

Изобретение относится к энзимологии и может быть использовано для научно-исследовательских целей и в производстве препаратов крови для улучшения их качества. The invention relates to enzymology and can be used for research purposes and in the production of blood products to improve their quality.

Известна иммобилизованная композиция на основе каталазы, альбумина, связанных с грибным мицелием с помощью глутарового альдегида и комплексирующего буфера, применяемая для аналитических целей и в пищевой промышленности[1]. Known immobilized composition based on catalase, albumin associated with mushroom mycelium using glutaraldehyde and complexing buffer, used for analytical purposes and in the food industry [1].

При стабилизации каталазой препаратов крови (иммуноглобулина и альбумина) происходит улучшение качества препарата (физико-химические свойства). Снижается уровень фрагментации, малонового диальдегида. Однако степень опалесценции не отличается от контроля. Кроме того, введение каталазы в препараты крови ставит задачу освобождения от фермента, так как препараты, применяемые в медицине, не должны содержать в себе посторонних примесей. When catalase stabilizes blood products (immunoglobulin and albumin), the quality of the drug (physico-chemical properties) improves. The level of fragmentation, malondialdehyde is reduced. However, the degree of opalescence does not differ from the control. In addition, the introduction of catalase into blood preparations sets the task of liberation from the enzyme, since the drugs used in medicine should not contain any impurities.

Цель изобретения - создание сорбента КИГС-1 на основе иммобилизованной каталазы для улучшения физико-химических свойств препаратов крови. The purpose of the invention is the creation of a sorbent KIGS-1 based on immobilized catalase to improve the physico-chemical properties of blood products.

Это достигается композицией соединений на основе каталазы и иммуноглобулина (химическим путем), связанных с полистиролом (физико-химическим путем), применяемой в соответствие сорбента для очистки препаратов крови от активированных форм кислорода. This is achieved by a composition of compounds based on catalase and immunoglobulin (chemically) associated with polystyrene (physicochemical), used in accordance with the sorbent for purification of blood products from activated oxygen species.

Существенными отличиями нового биологически активного вещества (БАВ) являются
устойчивость фермента каталазы в иммобилизованном состоянии;
повышение активности каталазы.
Significant differences of the new biologically active substance (BAS) are
stability of the catalase enzyme in an immobilized state;
increased catalase activity.

Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.

К 5-6 мл раствора иммуноглобулина донорского, разведенного 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0-7,4 до концентрации 5-6 мг белка в 1 мл, прибавляют эквивалентный объем раствора каталазы, содержащей 2,8-3,2 мг белка в 1 мл, перемешивают в течение 5-7 мин и по каплям приливают 0,5 мл 1%-ного водного раствора глутарового альдегида; в течение 2,5-3 ч перемешивают при комнатной температуре, центрифугируют при 15000 об/мин в течение 25-30 мин, надосадочная жидкость представляет собой комплекс иммуноглобулин-катализа. Иммобилизацию комплекса проводят путем адсорбции на гранулы полистирола размером 3х5 мм. С этой целью объем полученной надосадочной жидкости доводят 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0-7,2 до 50-60 мл, заливают полистироловые пластины (30-32 г) и оставляют на 18 ч при 4оС; несвязавшийся белок удаляют промыванием 100-120 мл физиологического раствора, рН 7,0-7,2. Полученным сорбентом КИГС-1 заполняют колонку и пропускают через нее препараты крови при скорости протока жидкости 120-150 мл/ч при температуре 25оС.An equivalent volume of catalase solution containing 2.8-3.2 mg is added to 5-6 ml of a donor immunoglobulin solution diluted with 0.01 M phosphate buffer pH 7.0-7.4 to a concentration of 5-6 mg protein in 1 ml protein in 1 ml, stirred for 5-7 minutes and 0.5 ml of a 1% aqueous solution of glutaraldehyde are poured dropwise; stirred for 2.5-3 hours at room temperature, centrifuged at 15,000 rpm for 25-30 minutes, the supernatant is an immunoglobulin-catalysis complex. The immobilization of the complex is carried out by adsorption on polystyrene granules with a size of 3x5 mm. To this end, the volume of the resulting supernatant was adjusted with 0.01 M phosphate buffer, pH 7.0-7.2 to 50-60 mL, poured polystyrene plates (30-32 g) and left for 18 hours at 4 ° C; unbound protein is removed by washing with 100-120 ml of physiological saline, pH 7.0-7.2. The resulting KIGS sorbent-filled column 1 and passed therethrough at a liquid blood product flow rate of 120-150 ml / h at 25 ° C.

П р и м е р 1. Выбор оптимальной величины рН буфера при получении сорбента КИГС-1. PRI me R 1. The choice of the optimal pH of the buffer upon receipt of the sorbent KIGS-1.

При получении сорбента КИГС-1 были использованы следующие величины рН комплексирующего буфера: 5,0; 7,0; 7,2; 7,4; 8,6; 9,6. Upon receipt of the KIGS-1 sorbent, the following pH values of the complexing buffer were used: 5.0; 7.0; 7.2; 7.4; 8.6; 9.6

Как видно из данных табл.1, оптимальной величиной рН комплексирующего буфера является 7,0-7,4. As can be seen from the data in table 1, the optimal pH of the complexing buffer is 7.0-7.4.

Кроме того, в результате иммобилизации каталазы и иммоглобулина значительно увеличивается удельная активность фермента. Если до иммобилизации она составила 35000 усл.ед.ак., то после наблюдали активность в 42000 ед. активности. In addition, as a result of the immobilization of catalase and immunoglobulin, the specific activity of the enzyme increases significantly. If before immobilization it amounted to 35,000 conventional units, then after an activity of 42,000 units was observed. activity.

Применение иммобилизованной каталазы в составе сорбента КИГС-1 для стабилизации препаратов крови. The use of immobilized catalase as part of the KIGS-1 sorbent for stabilizing blood products.

Полученным сорбентом КИГС-1 (на основе иммобилизованной каталазы) заполняют колонку и пропускают через нее препараты крови при скорости протока жидкости 120-150 мл/ч при температуре 20-25оС. Данные об эффективности применения сорбента приведены в табл.2, 3, 4, 5.The resulting sorbent KIGS-1 (based on immobilized catalase) fill the column and passed therethrough at a liquid blood product flow rate of 120-150 ml / h at temperature of 20-25 C. The efficacy of the sorbent are shown in Table 2, 3, 4, 5.

Как свидетельствуют данные таблиц, эффективность очистки препаратов крови - иммуноглобулина и альбумина сорбентом КИГС-1 превосходит эффективность взятой в качестве прототипа каталазы. Кроме того, использование в качестве стабилизатора сорбента позволяет его многократно использовать для данных целей, причем в аппараты крови не попадают посторонние вещества. As the data in the tables indicate, the efficiency of purification of blood products - immunoglobulin and albumin with the KIGS-1 sorbent exceeds the efficiency of catalase taken as a prototype. In addition, the use of a sorbent as a stabilizer allows it to be used repeatedly for these purposes, and foreign substances do not enter the blood devices.

Как свидетельствуют данные табл.3, физико-химические свойства альбумина, пропущенного через сорбент КИГС-1, значительно улучшаются по всем параметрам, в то время, как стабилизированные по способу-прототипу отличаются высокой степенью опалесценции. Пpиведены данные при ускоренном старении препарата (1 месяц при 37оС).According to the data in Table 3, the physicochemical properties of albumin passed through the KIGS-1 sorbent are significantly improved in all respects, while those stabilized by the prototype method are characterized by a high degree of opalescence. The paper presents data in preparation accelerated aging (1 month at 37 ° C).

Пропускание через сорбент КИГС-1 альбумина также способствует увеличению % мономера и препятствует полимеризации альбумина (табл.4). Passing albumin through the KIGS-1 sorbent also contributes to an increase in the% of monomer and prevents the polymerization of albumin (Table 4).

Как свидетельствуют данные табл.5, пропускание иммуноглобулина через сорбент КИГС-1 на основе иммобилизованной каталазы значительно улучшает физико-химические свойства иммуноглобулина по сравнению с иммуноглобулином, стабилизированным каталазой. As the data in Table 5 show, the transmission of immunoglobulin through the KIGS-1 sorbent based on immobilized catalase significantly improves the physicochemical properties of immunoglobulin compared to catalase-stabilized immunoglobulin.

Таким образом, пропускание через сорбент КИГС-1 на основе иммобилизованной каталазы значительно улучшает физико-химические свойства альбумина и иммуноглобулина. Thus, passing through the KIGS-1 sorbent based on immobilized catalase significantly improves the physicochemical properties of albumin and immunoglobulin.

Доказательство свободы активных центров - иммуноглобулина и фермента каталаза в иммобилизованном комплексе иммуноглобулин + каталаза. Proof of freedom of active centers - immunoglobulin and catalase enzyme in the immobilized immunoglobulin + catalase complex.

Проверку иммунологической активности иммуноглобулина и ферментативной активности каталазы проводили следующим образом. The immunological activity of immunoglobulin and the enzymatic activity of catalase were tested as follows.

В лунки полистиролового планшета (фирма Flow) раститровывают антисыворотку кролика к иммуноглобулину человека класса G 0,01 М карбонат-бикарбонатным буфером рН 9,6 до титров 20480, инкубируют. Происходит связывание антисыворотки с полистиролом, несвязавшаяся сыворотка удаляется трехкратным промыванием водопроводной водой и трехкратным промыванием физраствором с детергентом Твин-20 в концентрации 0,05%. In the wells of a polystyrene tablet (Flow company), rabbit antiserum was titrated to human immunoglobulin class G 0.01 M carbonate-bicarbonate buffer pH 9.6 to titers 20480, incubated. Antiserum is bound to polystyrene, unbound serum is removed by washing three times with tap water and washing three times with saline with Tween-20 detergent at a concentration of 0.05%.

Затем в лунки вносят комплекс каталаза + иммуноглобулин по 0,2 мл. Планшеты инкубируют в течение 1 ч при 37оС, несвязавшийся с антисывороткой комплекс каталаза + иммуноглобулин отмывают вышеуказанным способом. В лунки планшетов вносят в качестве индикаторной системы на ферментативную активность каталазы по 0,2 мл 0,025% Н2О2 (перекиси водорода) с инкубацией в течение 10 мин при 37оС, затем 0,2 мл 4%-ного раствора молибдата аммония с инкубацией при комнатной температуре в течение 30 мин. В лунках, где каталаза прореагировала с перекисью Н2О2, желтого окрашивания не наблюдается.Then, a catalase + immunoglobulin complex of 0.2 ml is added to the wells. Plates were incubated for 1 hour at 37 ° C, unbound complex with antiserum catalase + immunoglobulin washed as above. The wells of the plates is made as indicator systems for catalase enzyme activity, 0.2 ml of 0.025% H 2 O 2 (hydrogen peroxide), with incubation for 10 minutes at 37 ° C, then 0.2 ml of a 4% solution of ammonium molybdate with incubation at room temperature for 30 minutes In the wells where catalase reacted with H 2 O 2 peroxide, no yellow staining was observed.

Титр препарата в опытах составил 10240. Чем больше иммуноглобулина, тем больше каталазы, тем меньше выражено желтое окрашивание. В контрольных рядах наблюдалось стойкое желтое окрашивание. Следовательно, доказательством действия активного центра иммуноглобулина является его взаимодействие с антисывороткой: сохранность каталазного центра - взаимодействие с перекисью водорода. The titer of the drug in the experiments was 10,240. The more immunoglobulin, the more catalase, the less pronounced yellow staining. Persistent yellow staining was observed in the control rows. Therefore, the evidence of the action of the active center of an immunoglobulin is its interaction with antiserum: the safety of the catalase center is interaction with hydrogen peroxide.

Таким образом, данный эксперимент доказывает, что в этом иммобилизованном комплексе остаются свободными активные центры иммуноглобулина и каталазы. Thus, this experiment proves that the active centers of immunoglobulin and catalase remain free in this immobilized complex.

Таким образом, структурная формула иммобилизованного комплекса представляется в следующем виде
K-N=

Figure 00000001
-R-
Figure 00000002
=N-Jg,, где К - остаток каталазы;
Ig - остаток иммуноглобулина;
R - остаток глутарового альдегида.Thus, the structural formula of the immobilized complex is as follows
KN =
Figure 00000001
-R-
Figure 00000002
= N-Jg ,, where K is the rest of the catalase;
I g is the remainder of the immunoglobulin;
R is the remainder of glutaraldehyde.

Каталаза и иммуноглобулин соединяются глутаровым альдегидом, содержащим две альдегидные группы на обоих концах цепи. Эти группы реагируют при нейтральных значениях рН со свободными аминогруппами. Один конец глутарового альдегида присоединяется к лизину каталазы, другой - в лизину иммуноглобулина. С полистиролом связывание происходит физико-химическим путем за счет гидрофобного присоединения. Активные центры каталазы и иммуноглобулина остаются свободными, что проявляется в их специфическом действии - связывании антигенов (антисыворотки) и разложении перекиси водорода (отсутствие окрашивания с молибдатом аммония). Catalase and immunoglobulin are linked by glutaraldehyde containing two aldehyde groups at both ends of the chain. These groups react at neutral pH with free amino groups. One end of glutaraldehyde is attached to catalase lysine, the other to immunoglobulin lysine. With polystyrene, binding occurs physically and chemically through hydrophobic addition. The active centers of catalase and immunoglobulin remain free, which is manifested in their specific action - binding of antigens (antiserum) and decomposition of hydrogen peroxide (lack of staining with ammonium molybdate).

Положительный эффект достигается за счет увеличения активности фермента каталазы вследствие иммобилизации ее (с иммуноглобулином и полистиролом), а также устойчивости фермента и вследствие этого возможности использования ее для многократного употребления. A positive effect is achieved by increasing the activity of the enzyme catalase due to its immobilization (with immunoglobulin and polystyrene), as well as the stability of the enzyme and, as a result, the possibility of using it for repeated use.

Claims (1)

ИММОБИЛИЗОВАННАЯ КАТАЛАЗА общей формулы
K-N=
Figure 00000003
-R-
Figure 00000004
=N-Jg,,
где K - остаток каталазы;
Jg - остаток иммуноглобулина в качестве сорбента для улучшения физико-химических свойств препаратов крови от активированных форм кислорода;
R - остаток глутарового альдегида.
IMMOBILIZED CATALASE of the general formula
KN =
Figure 00000003
-R-
Figure 00000004
= N-Jg ,,
where K is the residue of catalase;
Jg - the remainder of the immunoglobulin as a sorbent to improve the physico-chemical properties of blood products from activated forms of oxygen;
R is the remainder of glutaraldehyde.
SU4953337 1991-06-03 1991-06-03 Immobilized catalase RU2016901C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU4953337 RU2016901C1 (en) 1991-06-03 1991-06-03 Immobilized catalase

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU4953337 RU2016901C1 (en) 1991-06-03 1991-06-03 Immobilized catalase

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2016901C1 true RU2016901C1 (en) 1994-07-30

Family

ID=21583424

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU4953337 RU2016901C1 (en) 1991-06-03 1991-06-03 Immobilized catalase

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2016901C1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013188470A1 (en) * 2012-06-11 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Method and system for in vivo hydrogen peroxide detection with ultrasound

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1. Патент ФРГ N 3301992, кл. C 12N 11/16, опублик.1984. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013188470A1 (en) * 2012-06-11 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Method and system for in vivo hydrogen peroxide detection with ultrasound
US9713459B2 (en) 2012-06-11 2017-07-25 The Regents Of The University Of California Method and system for in vivo hydrogen peroxide detection with ultrasound

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4168300A (en) Method of removal of hepatitis virus
US4650587A (en) Ammonia scavenger
Ankel et al. Antiviral effect of interferon covalently bound to sepharose
US3980772A (en) Methods of dissolving blood clots and the like with streptokinase chemically bonded to a carbohydrate matrix
Pavelić et al. Medical applications of zeolites
US3639213A (en) Streptokinase chemically bonded to a carbohydrate matrix
US5037649A (en) Method for treatment of HIV-infected patients
DE2523793A1 (en) THIOPOLYMERS AND DERIVATIVES AS WELL AS METHOD FOR MANUFACTURING AND APPLYING THE SAME
US10758890B2 (en) Substrate for the purification of biological liquids
Hasselberger et al. The preparation of insoluble, matrix-supported derivatives of asparaginase for use in cancer therapy
JPH01229965A (en) Carrier for affinity chromatography with immobilized antibodies
RU2016901C1 (en) Immobilized catalase
Roelcke et al. I-, MN-and Pr (1)/Pr (2)-Activity of Human Erythrocyte Glycoprotein Fractions Obtained by Ficin Treatment
Másson et al. Chemical activation of nitrocellulose membranes for peptide antigen‐antibody binding studies: direct substitution of the nitrate group with diaminoalkane
CA2072797C (en) Use of tri (n-butyl) phosphate at low ph in solutions of biologically active proteins for enhanced virucidal activity
Paddon et al. Diethylstilbestrol treatment increases the amount of choline kinase in rooster liver
EP0118548A1 (en) Ammonia scavenger
JPS5890518A (en) Passivated biologically active substance, affinity chromatography and drug for self immunological disease diagnosis and/or therapy
US4820416A (en) Removal of bilirubin by the pseudoperoxidase activity of immobilized hemoglobin
Sabin Purification of Poliomyelitis Virus by Adsorption and Elution.
JPH11152330A (en) Polylysine, production of polylysine, polylysine composition, and production of medicine which removes endotoxin
Katsu et al. Increases in permeability of Escherichia coli outer membrane induced by polycations
US5603963A (en) Method for the treatment of retroviral diseases such as acquired immune deficiency syndrome utilizing (pseudo)halogen complexes of gold(1)
Falke et al. Ion Channels within Ion Transport Proteins: Evidence in the Band 3 System
TW589375B (en) Purification process of thunngiensin