RU2014324C1 - Method of synthesis or polyamines or their pharmaceutically acceptable salts - Google Patents

Method of synthesis or polyamines or their pharmaceutically acceptable salts

Info

Publication number
RU2014324C1
RU2014324C1 SU4894114A RU2014324C1 RU 2014324 C1 RU2014324 C1 RU 2014324C1 SU 4894114 A SU4894114 A SU 4894114A RU 2014324 C1 RU2014324 C1 RU 2014324C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
polyamines
column
fraction
eluted
agel
Prior art date
Application number
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Алекс Саккомано Николас
Альфред Волкманн Роберт
Original Assignee
Пфайзер Инк.
Нэтчурал Продакт Сайенсиз Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Пфайзер Инк., Нэтчурал Продакт Сайенсиз Инк. filed Critical Пфайзер Инк.
Application granted granted Critical
Publication of RU2014324C1 publication Critical patent/RU2014324C1/en

Links

Landscapes

  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

FIELD: organic chemistry. SUBSTANCE: polyamines from venum of spider, Agilenopsis aperta, are separated by elution from the column C-18
Figure 00000003
(22 mm · 250 mm, pore size is 300

Description

Изобретение относится к определенным полиаминам, которые присутствуют в яде паука Agelenopsis aperta. Полиамины и их фармацевтически приемлемые соли являются антагонистами возбудительных аминокислотных нейротрансмиттеров, которые воздействуют на клетки, включая нейронные клетки, целого ряда организмов включая беспозвоночных и позвоночных. Данное изобретение также относится в использованию таких полиаминов и их солей в проявлении антагонизма относительно возбуди- тельных аминокислотных нейротрансмиттеров, которые оказывают воздействие на клетки, например, клетки в нервной системе организма, при лечении заболеваний и состояний млекопитающих, обусловленных возбудительными аминокислотными нейротрансмиттерами, и при уничтожении беспозвоночных вредителей, а также относится к композициям, содержащим указанные полиамины и их соли. The invention relates to certain polyamines that are present in Agelenopsis aperta spider venom. Polyamines and their pharmaceutically acceptable salts are antagonists of excitatory amino acid neurotransmitters that act on cells, including neuron cells, in a variety of organisms including invertebrates and vertebrates. The present invention also relates to the use of such polyamines and their salts in the manifestation of antagonism with respect to excitatory amino acid neurotransmitters that affect cells, for example, cells in the nervous system of the body, in the treatment of diseases and conditions of mammals caused by excitatory amino acid neurotransmitters, and in the destruction invertebrate pests, and also relates to compositions containing these polyamines and their salts.

Сообщается, что яд паука Agelenopsis aperta содержит по меньшей мере два токсина, которые оказывают воздействие на кальциевые потоки. Jackson H. , et al. , Soc. Neu. Sci.Adstr, 12:1078 (1987). Данные авторы раскрывают токсин, упоминаемый как AG2, который имеет молекулярную массу менее, чем 1000 дальтон, и, по-видимому, подавляет кальциевые потоки в широком круге тканей. Кроме того, Vackson.H., et al., Soc.Neu.Sci.Abstr. 12:730 (1986), указывают на другой токсин из Agelenopsis aperta, содержащий компонент с мол. м. около 6000. Указывается, что данный токсин воздействует на пресинаптическую блокаду трансмиссии и предполагается, что токсин блокирует кальциевые каналы, ассоциированные с высвобождением нейротрансмиттера. Agelenopsis aperta spider venom has been reported to contain at least two toxins that affect calcium fluxes. Jackson H., et al. Soc. Neu. Sci.Adstr, 12: 1078 (1987). These authors disclose a toxin referred to as AG2, which has a molecular weight of less than 1000 daltons, and appears to inhibit calcium fluxes in a wide range of tissues. In addition, Vackson.H., Et al., Soc.Neu.Sci.Abstr. 12: 730 (1986), point to another toxin from Agelenopsis aperta containing a component with mol. m. about 6000. It is indicated that this toxin affects the presynaptic blockade of transmission and it is assumed that the toxin blocks the calcium channels associated with the release of the neurotransmitter.

Некоторые полиамины, присутствующие в яде паука Agelenopsis aperta, раскрываются в заявке на патент США N 07/-346181, 28.IV.89. Эти полиамины и их фармацевтически приемлемые соли раскрываются в данной заявке в качестве блокирующих агентов возбудительных аминокислотных рецепторов в клетках, и один такой полиамин В1 также раскрывается в качестве блокирующего агента кальциевых каналов в клетках. Описываемые в данной заявке полиамины представляют собой:
AGEL 452:

Figure 00000005
Figure 00000006
Figure 00000007
Figure 00000008
Figure 00000009
Figure 00000010
Figure 00000011
Figure 00000012
Figure 00000013
Figure 00000014
Figure 00000015
Figure 00000016

AGEL 468:
Figure 00000017
Figure 00000018
Figure 00000019
Figure 00000020
Figure 00000021
Figure 00000022
Figure 00000023
Figure 00000024
Figure 00000025
Figure 00000026
Figure 00000027
Figure 00000028

AGEL 448:
Figure 00000029
Figure 00000030
Figure 00000031
Figure 00000032
Figure 00000033
Figure 00000034
Figure 00000035
Figure 00000036
Figure 00000037
Figure 00000038
Figure 00000039

AGEL 505:
Figure 00000040
Figure 00000041
Figure 00000042
Figure 00000043
Figure 00000044
Figure 00000045
Figure 00000046
Figure 00000047
Figure 00000049
Figure 00000050
NH2
AGEL 489:
Figure 00000051
Figure 00000052
Figure 00000053
Figure 00000054
Figure 00000055
Figure 00000056
Figure 00000057
Figure 00000058
Figure 00000059
Figure 00000060
Figure 00000061
Figure 00000062
NH2 ;
и AGEL 504: соединение, имеющее следующие отличительные характеристики: (а) присутствует во фракции из неочищенного яда паука Agelenopsis aperta, которую элюируют колонкой С-13 Vydaс Vydac®, 22 мм х 250 мм, размер пор 300
Figure 00000063
, размер частиц 10 мкм, с использованием скорости перемещения фронта растворителя, равной 15 мл/мин, и системы растворителей, применяя программу линейного градиента 5% ->>20% В, 95%->> 80% А/0 ->>30 мин/, затем 20% - >>70% В, 80% ->>30% А/30 ->>55 мин/, где А обозначает 0,1% водный ТФА и В обозначает ацетонитрил, около 22,75 мин; (b) присутствует во фракции, которая описана в (а) выше, которую элюируют колонкой С-18 Vydaс Vudac®, 22 мм х 250 мм, размер пор 300
Figure 00000064
, размер частиц 10 мкм, с использованием скорости перемещения фронта растворителя, равной 15 мл/мин, и системы растворителей, применяя программу нелинейного градиента 0% ->>0% В, 100%->> ->>100% В/0 ->>5 мин/, затем 0% ->>10% В, 100% ->>90% А/5 ->>20 мин/ (кривая Waters 1), затем 10% ->>20% В ->>90% ->>80% А/20->> 30 мин/ (кривая Waters 6), затем 20% ->>50% В, 80% ->>50% А/30 ->>40 мин/ (кривая 11), где А обозначает 0,1% водный ТФА и В обозначает ацетонитрил, около 21,5 мин; и (с) масс-спектр: высокая разрешающая способность: 505, 3861 в пересчете на С27Н48N6O3.Some polyamines present in Agelenopsis aperta spider venom are disclosed in U.S. Patent Application No. 07 / -346181, 28.IV.89. These polyamines and their pharmaceutically acceptable salts are disclosed herein as blocking agents of excitatory amino acid receptors in cells, and one such polyamine B 1 is also disclosed as a blocking agent of calcium channels in cells. The polyamines described in this application are:
AGEL 452:
Figure 00000005
Figure 00000006
Figure 00000007
Figure 00000008
Figure 00000009
Figure 00000010
Figure 00000011
Figure 00000012
Figure 00000013
Figure 00000014
Figure 00000015
Figure 00000016

AGEL 468:
Figure 00000017
Figure 00000018
Figure 00000019
Figure 00000020
Figure 00000021
Figure 00000022
Figure 00000023
Figure 00000024
Figure 00000025
Figure 00000026
Figure 00000027
Figure 00000028

AGEL 448:
Figure 00000029
Figure 00000030
Figure 00000031
Figure 00000032
Figure 00000033
Figure 00000034
Figure 00000035
Figure 00000036
Figure 00000037
Figure 00000038
Figure 00000039

AGEL 505:
Figure 00000040
Figure 00000041
Figure 00000042
Figure 00000043
Figure 00000044
Figure 00000045
Figure 00000046
Figure 00000047
Figure 00000049
Figure 00000050
NH 2
AGEL 489:
Figure 00000051
Figure 00000052
Figure 00000053
Figure 00000054
Figure 00000055
Figure 00000056
Figure 00000057
Figure 00000058
Figure 00000059
Figure 00000060
Figure 00000061
Figure 00000062
NH 2;
and AGEL 504: a compound having the following characteristics: (a) present in a fraction from crude venom spider Agelenopsis aperta, eluting the column Vydas C-13 Vydac ®, 22 mm x 250 mm, 300 Å pore size
Figure 00000063
, particle size 10 μm, using a solvent front displacement rate of 15 ml / min and a solvent system using a linear gradient program of 5% - >> 20% B, 95% - >> 80% A / 0 - >> 30 min /, then 20% - >> 70% B, 80% - >> 30% A / 30 - >> 55 min /, where A is 0.1% aqueous TFA and B is acetonitrile, about 22.75 minutes; (b) is present in the fraction described in (a) above, which is eluted with a Vydac Vudac ® C-18 column, 22 mm x 250 mm, pore size 300
Figure 00000064
, particle size 10 μm, using a solvent front displacement rate of 15 ml / min and a solvent system using a non-linear gradient program 0% - >> 0% V, 100% - >> - >> 100% V / 0 - >> 5 min /, then 0% - >> 10% B, 100% - >> 90% A / 5 - >> 20 min / (Waters 1 curve), then 10% - >> 20% B - >> 90% - >> 80% A / 20 - >> 30 min / (Waters 6 curve), then 20% - >> 50% B, 80% - >> 50% A / 30 - >> 40 min / (curve 11), where A is 0.1% aqueous TFA and B is acetonitrile, about 21.5 minutes; and (c) mass spectrum: high resolution: 505, 3861 in terms of C 27 H 48 N 6 O 3 .

Соединения, являющиеся антагонистами возбудительных аминокислотных нейротрансмиттеров, имеют множество применений. Антагонисты возбудительных аминокислотных нейротрансмиттеров могут найти клиническое применение при лечении таких состояний, как удар, церебральная ишемия, нейронные дегенеративные нарушения, как например, болезнь Альцгеймера и эпилепсия, а также в качестве психотерапевтических средств. (См. Возбудительные Аминокислоты в Здравоохранении, Д. Лодж, Ред. , Джон Уили энд Санз Лтд., Нью-Йорк, штат Нью-Йорк). Кроме того, предлагаемые соединения пригодны в изучении физиологии клеток, таких как нейронные клетки, и в борьбе с беспозвоночными вредителями. Compounds that are antagonists of excitatory amino acid neurotransmitters have many uses. Antagonists of excitatory amino acid neurotransmitters may find clinical use in the treatment of conditions such as stroke, cerebral ischemia, neural degenerative disorders, such as Alzheimer's disease and epilepsy, and also as psychotherapeutic agents. (See Excitational Amino Acids in Health, D. Lodge, Ed., John Wiley & Sons Ltd., New York, NY). In addition, the proposed compounds are useful in studying the physiology of cells, such as neural cells, and in the control of invertebrate pests.

Изобетение касается определенных полиаминов, которые присутствуют в яде паука Agelenopsis aperta. Полиаминами настоящего изобретения являются следующие: AGEL 416:

Figure 00000065
Figure 00000066
Figure 00000067
Figure 00000068
Figure 00000069
Figure 00000070
Figure 00000071
Figure 00000072
Figure 00000073
Figure 00000074
NH2 AGEL 464:
Figure 00000075
Figure 00000076
Figure 00000077
Figure 00000078
Figure 00000079
Figure 00000080
Figure 00000081
Figure 00000082
Figure 00000083
Figure 00000084
NH2 AGEL 521:
Figure 00000085
Figure 00000086
Figure 00000087
Figure 00000088
Figure 00000089
Figure 00000090
Figure 00000091
Figure 00000092
Figure 00000093
Figure 00000094
Figure 00000095
Figure 00000096
NH2
Полиамины настоящего изобретения и их фармацевтически приемлемые соли являются антагонистами возбудительных аминокислотных нейротрансмиттеров, которые оказывают воздействие на клетки. Таким образом, указанные полиамины пригодны в проявлении антагонистического действия против таких возбудителей аминокислотных нейротрансмиттеров. Полиамины настоящего изобретения также пригодны в борьбе с беспозвоночными вредителями и в лечении заболеваний и состояний у млекопитающих, которые обусловлены возбудительными аминокислотными нейротранс- миттерами. Такие полиамины также пригодны в качестве психотерапевтических средств в отношении млекопитающих.The invention relates to certain polyamines that are present in the venom of the spider Agelenopsis aperta. The polyamines of the present invention are as follows: AGEL 416:
Figure 00000065
Figure 00000066
Figure 00000067
Figure 00000068
Figure 00000069
Figure 00000070
Figure 00000071
Figure 00000072
Figure 00000073
Figure 00000074
NH 2 AGEL 464:
Figure 00000075
Figure 00000076
Figure 00000077
Figure 00000078
Figure 00000079
Figure 00000080
Figure 00000081
Figure 00000082
Figure 00000083
Figure 00000084
NH 2 AGEL 521:
Figure 00000085
Figure 00000086
Figure 00000087
Figure 00000088
Figure 00000089
Figure 00000090
Figure 00000091
Figure 00000092
Figure 00000093
Figure 00000094
Figure 00000095
Figure 00000096
NH 2
The polyamines of the present invention and their pharmaceutically acceptable salts are antagonists of excitatory amino acid neurotransmitters that affect cells. Thus, these polyamines are useful in exhibiting antagonistic effects against such pathogens of amino acid neurotransmitters. The polyamines of the present invention are also useful in the control of invertebrate pests and in the treatment of diseases and conditions in mammals that are caused by excitatory amino acid neurotransmitters. Such polyamines are also suitable as psychotherapeutic agents for mammals.

Настоящее изобретение также касается фармацевтических композиций, включающих указанные полиамины, и способов введения указанных полиаминов. The present invention also relates to pharmaceutical compositions comprising said polyamines and methods for administering said polyamines.

Яд получают из паука Agelenopsis aperta при помощи способа доения путем электрической стимуляции в соответствии со стандартными методами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Предпочтительно, чтобы используемый метод предохранял от загрязнения яда абдоминальной отрыжкой или гемолимфой. Такие методы хорошо известны специалистам. Полученный таким образом яд хранят в замороженном состоянии при температуре около -78оС до его использования для очистки как описано ниже.The venom is obtained from the spider Agelenopsis aperta using the method of milking by electrical stimulation in accordance with standard methods well known to specialists in this field of technology. Preferably, the method used prevents poisoning by poisoning with abdominal belching or hemolymph. Such methods are well known in the art. Thus obtained poison is stored in a frozen state at a temperature of about -78 about C until it is used for cleaning as described below.

Очистку компонентов из целого яда осуществляют жидкостной хроматографией высокого разрешения с обращенной фазой (ЖХВР) на различных препаративных или полупрепаративных колонках, таких как колонки С-4 и С-18 Vydaс Vudac®. (Раинин Инструмент Ко., Инк., Мак Роуд, Уобурн, Массачусетс, 01801), колонки С-10 Baker (Дж. Т.Бэйкер Инк., 22 Рэд Скул Лэйн, Филирсбург, Нью Джерси 08865) и колонки Dynamax Phenyl (Раинин Инструмент Ко., Инк., Мак Роуд, Уобурн, Массачусетс, 01801). Обнаружение пиков осуществляют монохроматически при 220-230 нм. Дополнительный анализ фракций можно осуществить, например, с использованием полихромных УФ-данных, собранных детектором на диодной матрице Waters 990 (Миллипор Корпорейшн, Уотерс Хроматогрфии Дивижн, 34 Мэйпл Стрит, Милфорд, Массачусетс 01757). Фракции из колонок собирают известными методами, такими как использование коллектора фракций ISCO/"FOXY" и пикового детектора ISCO 2159(ISOGO, 4700 Супериор, Линкольн, Небраска 68504). Фракции собирают в сосудах соответствующих размеров, таких как стерильная полиэтиленовая лаборатория посуда. Концентрирование фракций затем осуществляют лиофилизацией из элюанта с последующей лиофилизацией из воды. Чистоту полученных фракций затем можно определить хроматографическим анализом с использованием аналитической колонки с градиентной системой, которая является более изократической, нежели система, используемая в конечной очистке фракций.Purification of components from the whole venom is carried out by high-resolution liquid chromatography with reverse phase (HPLC) on various preparative or semi-preparative columns, such as columns C-4 and C-18 Vydac Vudac ® . (Rainin Tool Co., Inc., Mac Road, Woburn, Mass., 01801), C-10 Baker columns (J.T. Baker Inc., 22 Red School Lane, Phillipsburg, New Jersey 08865) and Dynamax Phenyl columns (Rainin Tool Co., Inc., Mac Road, Woburn, Mass., 01801). Peak detection is carried out monochromatically at 220-230 nm. Additional fraction analysis can be performed, for example, using polychromatic UV data collected by a Waters 990 diode array detector (Millipore Corporation, Waters Chromatography Division, 34 Maple Street, Milford, Mass. 01757). Column fractions were collected by known methods, such as using the ISCO / "FOXY" fraction collector and ISCO 2159 peak detector (ISOGO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 68504). Fractions are collected in vessels of appropriate sizes, such as sterile polyethylene laboratory glassware. The concentration of the fractions is then carried out by lyophilization from eluant, followed by lyophilization from water. The purity of the obtained fractions can then be determined by chromatographic analysis using an analytical column with a gradient system, which is more isocratic than the system used in the final purification of the fractions.

Структуры, составленные соответствующими фракциями, определяют в соответствии с аналитическими методами, такими, как масс-спектрометрия и ядерный магнитный резонанс. Structures composed by the appropriate fractions are determined in accordance with analytical methods, such as mass spectrometry and nuclear magnetic resonance.

При осуществлении настоящего изобретения и использовании основных методик, приведенных выше, обнаружено, что пригодной колонкой для начального фракционирования яда является колонка С-18 Vydaс Vudac® размером 22 мм х 250 мм, размер пор 300

Figure 00000097
, размер частиц 10 мкм. Данную колонку элюируют со скоростью перемещения фронта растворителя, равной 15 мл/мин, с использованием программы линейного градиента 100% ->>80% А, 0% ->>20% В/0->> 30 мин/, где А обозначается 0,1% водную трифторуксусную кислоту (ТФА) и В обозначает ацетонитрил. Фракции собирают так, как описано выше. Полученные таким образом шесть фракций, обозначенные 1, 2, 3, 4, 5 и 6, отбирают для дальнейшего анализа и/или очистки. Другой метод фракционирования целого яда заключается в использовании колонки С-18 Baker (4,6х250 мм, размер пор 100
Figure 00000098
, размер частиц 5 мкм), которую элюируют с использованием скорости перемещения фронта растворителя, равной 1 мл/мин, и изократических условий 8% В, 92% А, где А и В имеют вышеприведенные значения. Однако для целей настоящего изобретения использование колонки С-13 Vydaс Vudac® и методики, описанной выше, предпочитают для начального фракционирования целого яда.When implementing the present invention and using the basic techniques described above, it was found that a suitable column for the initial fractionation of poison is a C-18 Vydac Vudac ® column with a size of 22 mm x 250 mm, pore size 300
Figure 00000097
, particle size 10 microns. This column is eluted with a solvent front displacement rate of 15 ml / min using a linear gradient program of 100% - >> 80% A, 0% - >> 20% B / 0 - >> 30 min /, where A is 0 , 1% aqueous trifluoroacetic acid (TFA) and B is acetonitrile. Fractions are collected as described above. The six fractions thus obtained, designated 1, 2, 3, 4, 5 and 6, are selected for further analysis and / or purification. Another method for fractionating the whole poison is to use a C-18 Baker column (4.6 x 250 mm, pore size 100
Figure 00000098
, particle size 5 μm), which is eluted using a solvent front displacement rate of 1 ml / min and isocratic conditions of 8% B, 92% A, where A and B have the above values. However, for purposes of this invention, the use of a C-13 column Vydas Vudac ® and methods described above, preferred for initial fractionation of whole venom.

Фракции 1,2 и 3 содержат полиамины (США N 07/346181), составляют часть настоящего изобретения. Фракции 4, 5 и 6 подвергают дальнейшей очистке с использованием различных колонок и условий очистки. Специфика каждого субфрак- ционирования и их результаты приведены в примерах 2, 3 и 4 ниже. Fractions 1,2 and 3 contain polyamines (US N 07/346181), form part of the present invention. Fractions 4, 5, and 6 were further purified using various columns and purification conditions. The specifics of each sub-fractionation and their results are shown in examples 2, 3 and 4 below.

Как показано в следующих примерах соединениями полиаминов, которые содержатся во фракциях AGEL 416, AGEL 464 и AGEL 521, являются следующие:

Figure 00000099
Figure 00000100
Figure 00000101
Figure 00000102
Figure 00000103
Figure 00000104
Figure 00000105
Figure 00000106
Figure 00000107
Figure 00000108
Figure 00000109
AGEL 464:
Figure 00000110
Figure 00000111
Figure 00000112
Figure 00000113
Figure 00000114
Figure 00000115
Figure 00000116
Figure 00000117
Figure 00000118
Figure 00000119
Figure 00000120
AGEL 521:
Figure 00000121
Figure 00000122
Figure 00000123
Figure 00000124
Figure 00000125
Figure 00000126
Figure 00000127
Figure 00000128
Figure 00000129
Figure 00000130
Figure 00000131
Figure 00000132
NH2
Теперь можно получить указанные соединения методами иными, нежели с использованием выделения/очистки из цельного яда пауков Agelenopsis aperta. Все методы находятся в пределах объема настоящего изобретения. Например, полиамин-соединения могут быть получены непосредственно синтетическими способами.As shown in the following examples, the polyamine compounds contained in the fractions AGEL 416, AGEL 464 and AGEL 521 are as follows:
Figure 00000099
Figure 00000100
Figure 00000101
Figure 00000102
Figure 00000103
Figure 00000104
Figure 00000105
Figure 00000106
Figure 00000107
Figure 00000108
Figure 00000109
AGEL 464:
Figure 00000110
Figure 00000111
Figure 00000112
Figure 00000113
Figure 00000114
Figure 00000115
Figure 00000116
Figure 00000117
Figure 00000118
Figure 00000119
Figure 00000120
AGEL 521:
Figure 00000121
Figure 00000122
Figure 00000123
Figure 00000124
Figure 00000125
Figure 00000126
Figure 00000127
Figure 00000128
Figure 00000129
Figure 00000130
Figure 00000131
Figure 00000132
NH 2
Now you can get these compounds by methods other than using isolation / purification from the whole venom of spiders Agelenopsis aperta. All methods are within the scope of the present invention. For example, polyamine compounds can be prepared directly by synthetic methods.

Синтетическая схема получения полиамина настоящего изобретения формулы

Figure 00000133
Figure 00000134
Figure 00000135
Figure 00000136
Figure 00000137
Figure 00000138
Figure 00000139
Figure 00000140
Figure 00000141
Figure 00000142
Figure 00000143
приведены в реакционнных схемах А - С ниже.The synthetic scheme for obtaining the polyamine of the present invention of the formula
Figure 00000133
Figure 00000134
Figure 00000135
Figure 00000136
Figure 00000137
Figure 00000138
Figure 00000139
Figure 00000140
Figure 00000141
Figure 00000142
Figure 00000143
shown in reaction schemes A to C below.

Полиамиды настоящего изобретения обратимо антагонизируют возбудительные аминокислотные нейротрансмиттеры/ которые оказывают воздействие на клетки/ такие как клетки в нервной системе целого ряда организмов/ включая безпозвоночные и позвоночные. Используемый здесь термин "позвоночные" предполагает млекопитающих. Термин "безпозвоночные" обозначает/ например/ насекомых/ экопаразитов и эндопаразитов. The polyamides of the present invention reversibly antagonize excitatory amino acid neurotransmitters / that affect cells / such as cells in the nervous system of a number of organisms / including invertebrates and vertebrates. As used herein, the term “vertebrates” refers to mammals. The term "invertebrate" means / for example / insects / ecoparasites and endoparasites.

Способность полиаминов настоящего изобретения вызывать антагонизм относительно возбудительных аминокислотных нейротрансмиттеров продемонстрирована их способностью блокировать повышение уровней циклического гуанозин-3' , 5' -монофосфата (сGMP), индуцированное N-метил-D-аспарагиновой кислоты (NMDA), в мозжечках неонатальных крыс в соответствии со следующей методикой. Мозжечки от десяти крыс Wistar в возрасте 8-14 дней быстро извлекают и помещают при температуре 4оС в смеси раствор Кребса/бикарбонатный буфер, рН 7,4, и затем разрезают на участки размером 0,5х0,5 мм с использованием тканевого ножа Mclwain (Дзе Никл Лаборатори Инжиниринг Ко., Гомшелл, Суррей, Англия). Полученные кусочки мозжечка переносят в 100 мл смеси раствор Кребса/бикарбонатный буфер при температуре 37оС, которые постоянно уравновешивают смесью 95: 5 O2/CO2. Кусочки мозжечка инкубируют таким образом в течение 90 мин при трех заменах буферного раствора. Затем буферный раствор декантируют, ткань центрифугируют (1 мин, 3200 об/мин) и ткань ресуспендируют в 20 мл раствора Кребса/бикарбонатного буфера. Затем извлекают 250 мкл аликвоты (приблизительно 2 мг) и помещают в 1,5 мо микроцентрифужную пробирку. В пробирки прибавляют 10 мкл соединения из основного раствора с последующим прибавлением 10 мкл 2,5 мм раствора NMDA с тем, чтобы начать реакцию. Конечная концентрация NМDA составляет 100 мкМ. Контрольные пробирки не имеют NMDA. Пробирки инкубируют в течение 1 мин при 37оС во встряхиваемой водяной бане, после чего прибавляют 750 мкл 50 мМ Трис-НСl, 5 мМ ЭДТК для того, чтобы остановить реакцию. Пробирки помещают немедленно в ванну с кипящей водой на 5 мин. Содержимое каждой пробирки затем обрабатывают ультразвуком в течение 15 сек с использованием зондовой ультразвуковой установки, установленном на уровне мощности, равной трем. 10 мкл извлекают и белок определяют методом Lowry, Anal.Bio- chem. 100:201 (1979). Затем пробирки центрифугируют (5 мин, 10000 х г), извлекают 100 мкл надосадочной жидкости и уровень циклического GMP (сGMP) анализируют с использованием радиоиммунного анализа сGMP Нью Инглэнд. Ньюклиа (Бостон, Массачусетс) в соответствии с методом поставщика. Данные приведены в виде ммоль сGMP, выработанного на мг белка.The ability of the polyamines of the present invention to antagonize relatively excitatory amino acid neurotransmitters is demonstrated by their ability to block the increase in the levels of cyclic guanosine-3 ', 5' -monophosphate (cGMP) induced by N-methyl-D-aspartic acid (NMDA) in the cerebellum of neonatal rats in accordance with following technique. Cerebellums from ten Wistar rats aged 8-14 days quickly removed and placed at 4 ° C in a mixture of Krebs / bicarbonate buffer solution, pH 7.4, and then cut into portions the size 0,5h0,5 mm using a tissue blade Mclwain (Dze Nickle Laboratory Engineering Co., Gomshell, Surrey, England). The obtained pieces of cerebellum are transferred into 100 ml of a mixture of Krebs solution / bicarbonate buffer at a temperature of 37 about C, which are constantly balanced with a mixture of 95: 5 O 2 / CO 2 . Pieces of cerebellum are incubated in this way for 90 minutes with three changes of buffer solution. Then, the buffer solution is decanted, the tissue is centrifuged (1 min, 3200 rpm) and the tissue is resuspended in 20 ml of Krebs / bicarbonate buffer. Then, 250 μl aliquots (approximately 2 mg) were recovered and placed in a 1.5 mo microcentrifuge tube. 10 μl of the compound from the stock solution was added to the tubes, followed by 10 μl of a 2.5 mm NMDA solution in order to start the reaction. The final concentration of NMDA is 100 μM. Control tubes do not have NMDA. The tubes were incubated for 1 min at 37 ° C in a shaking water bath and then added 750 .mu.l of 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA to stop the reaction. The tubes are immediately placed in a boiling water bath for 5 minutes. The contents of each tube are then sonicated for 15 seconds using a sonic probe installed at a power level of three. 10 μl was recovered and the protein was determined by Lowry, Anal. Biochem. 100: 201 (1979). The tubes are then centrifuged (5 min, 10,000 x g), 100 μl of the supernatant are recovered, and the cyclic GMP level (cGMP) is analyzed using New England Imaginative Radioactive Assay. Newclia (Boston, Mass.) According to supplier method. Data are given as mmol cGMP generated per mg protein.

Кроме того, способность полиаминов настоящего изобретения вызывать антагонизм относительно возбудительных аминокислотных нейротрансмиттеров демонстрируется их способностью блокировать NMDA/глицин-индуцированные повышения уровней цитозольный свободных (Са+2) в диссоциированных клетках мозжечковых гранул в соответствии со следующей методикой. Клетки мозжечковых гранул получают из мозжечка 8-дневных крыс (Wilkin, G.P. et al., Brain Res. 115, 181-199, 1976). Квадраты (1 см2) Aclar (Протопластикс Инк., 5033 Индастриал Авенью, Уолл, Нью-Йорк 07719) покрывают поли-L-лизином и помещают в 12-ячейковые чашки, которые содержат 1 мл основной питательной среды Игла. Клетки диссоциируют и аликвоты, содержащие 6,25х106 клеток, прибавляют в каждую ячейку, содержащую квадраты Aclar. После пассирования культуры клеток на чашках (через 24 ч) прибавляют цитозинбета-D-арабинофуранозид (конечная концентрация 10 мкМ). Клетки используют для фура2-анализа на 6, 7 и 8-е дни культивирования. Клетки (присоединенные к квадратам Aclar) переносят к 12-ячейковым чашкам, содержащим 1 мл 1 мкМ фура2/АМ (Молекьюлар Проубс Инк., Юджин, Орегон) в буферном растворе НЕРЕS (содержащем 0,1% бычий сывороточный альбумин, 0,1% дестрозу, рН 7,4, свободный от магния). Клетки инкубируют в течение 40 мин при 37оС фура2/АМ-содержащий буферный раствор удаляют в замещают 1 мл того же буферного раствора без фура2/АМ. В кварцевую кювету прибавляют 2,0 мл предварительно нагретого (37оС) буферного раствора. Клетки на Aclar помещают в кювету, которую вставляют в термостатируемый (37оС) держатель, снабженный магнитной мешалкой, и флуоресценцию измеряют флуоресцентным спектрофотометром (Биомедикал Инструмент Групп, Университет штата Пенсильвания). Флуоресцентный сигнал стабилизируют в течение приблизительно 2 мин.In addition, the ability of the polyamines of the present invention to antagonize relatively excitatory amino acid neurotransmitters is demonstrated by their ability to block NMDA / glycine-induced increases in cytosolic free (Ca + 2 ) levels in dissociated cells of cerebellum granules in accordance with the following procedure. Cerebellar granule cells were obtained from the cerebellum of 8-day-old rats (Wilkin, GP et al., Brain Res. 115, 181-199, 1976). Squares (1 cm 2 ) of Aclar (Protoplastics Inc., 5033 Industrial Avenues, Wall, NY 07719) are coated with poly-L-lysine and placed in 12-well plates that contain 1 ml of Eagle's basic nutrient medium. Cells dissociate and aliquots containing 6.25x10 6 cells are added to each cell containing Aclar squares. After passaging the cell culture on plates (after 24 hours), cytosinbeta-D-arabinofuranoside (final concentration 10 μM) was added. Cells are used for fura2 analysis on the 6th, 7th and 8th days of cultivation. Cells (attached to Aclar squares) are transferred to 12-well plates containing 1 ml of 1 μM fura2 / AM (Molecular Probs Inc., Eugene, Oregon) in HEPES buffer solution (containing 0.1% bovine serum albumin, 0.1% destrosa, pH 7.4, free of magnesium). Cells were incubated for 40 min at 37 ° C fura2 / AM-containing buffer is removed to replace 1 ml of the same buffer without fura2 / AM. 2.0 ml of a pre-heated (37 ° C) buffer solution are added to a quartz cuvette. The cells on the Aclar are placed in the cuvette, which is inserted in a thermostated (37 ° C.) holder equipped with a magnetic stirrer and the fluorescence is measured with a fluorescence spectrophotometer (Biomedical Instrument Group, University of Pennsylvania). The fluorescent signal is stabilized for approximately 2 minutes.

Повышение уровня цитозольного свободного кальция, представленное возрастанием флуоресценции, продуцируют путем прибавления 50 мкл NMDA и 1 мкМ глицина. Затем в кювету прибавляют 5-20 мкл основного раствора соединения в фосфатно-буферном солевом растворе (ФБС, рН 7,4) при соответствующих концентрациях. Калибровку флуоресцентных сигналов и коррекцию утечки фура2/АМ осуществляют с использованием установленных методик Grynkiewicz, G. et al., J. Biol. Chem. 260:3440 (1985). После завершения каждого испытания значение максимальной флуоресценции (Fmax) определяют путем прибавления йономицина (35 мкМ), а значение минимальной флуоресценции (Fmin) определяют последующим прибавлением ЕGТA (12 мМ) к хелатному кальцию. Используя вышеприведенную методику, можно показать способность искомого соединения антагонизи- ровать возбудительные аминокислотные нейротрансмиттеры вследствие понижения флуоресценции после прибавления искомого соединения.An increase in cytosolic free calcium, represented by an increase in fluorescence, is produced by the addition of 50 μl NMDA and 1 μM glycine. Then, 5-20 μl of a basic solution of the compound in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) at appropriate concentrations is added to the cuvette. Calibration of fluorescent signals and correction of leakage of fura2 / AM is carried out using established methods of Grynkiewicz, G. et al., J. Biol. Chem. 260: 3440 (1985). After the completion of each test, the maximum fluorescence value (F max ) is determined by adding yonomycin (35 μM), and the minimum fluorescence value (F min ) is determined by the subsequent addition of EGTA (12 mM) to calcium chelate. Using the above procedure, it is possible to show the ability of the desired compound to antagonize excitatory amino acid neurotransmitters due to lower fluorescence after the addition of the desired compound.

Полиамины настоящего изобретения пригодны в оказании антагонистического действия против возбудительных аминокислотных нейротрансмиттеров. Как таковые, полиамины также пригодны в борьбе с беспозвоночными вредителями и в лечении заболеваний и состояний, опосредованных возбудительными аминокислотными нейротрансмиттерами, у млекопитающих, причем такими заболеваниями являются удар, церебральная ишемия, нейронные дегенеративные растройства, такие как болезнь Алцгеймера и эпилепсия. Указанные полиамины также пригодны в качестве психотерапевтических средств у млекопитающих. Кроме того, полиамины пригодны при исследовании физиологии клеток, включая, но не ограничиваясь, клетки нервной системы. The polyamines of the present invention are useful in antagonizing excitatory amino acid neurotransmitters. As such, polyamines are also useful in controlling invertebrate pests and in treating diseases and conditions mediated by excitatory amino acid neurotransmitters in mammals, such diseases as stroke, cerebral ischemia, neural degenerative disorders such as Alzheimer's disease and epilepsy. These polyamines are also suitable as psychotherapeutic agents in mammals. In addition, polyamines are useful in studying the physiology of cells, including, but not limited to, cells of the nervous system.

В пределах объема настоящего изобретения находятся и фармацевтически приемлемые соли полиаминов настоящего изобретения. Такие соли образованы хорошо известными способами. Например, кислые аддитивные соли полиаминов могут быть получены в соответствии с традиционными методами. Кислые аддитивные соли полиаминов, такие как хлористоводородные и трифторуксусные кислые аддитивные соли являются предпочтительными. Особенно предпочтительны хлористоводородные кислые аддитивные соли полиаминов. Also within the scope of the present invention are pharmaceutically acceptable salts of the polyamines of the present invention. Such salts are formed by well-known methods. For example, acid addition salts of polyamines can be prepared according to conventional methods. Polyamine acid addition salts such as hydrochloric and trifluoroacetic acid addition salts are preferred. Particularly preferred are hydrochloric acid addition salts of polyamines.

Полиамин или его фармацевтически приемлемую соль можно ввести млекопитающему или в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями в фармацевтической композиции в соответствии со стандартной фармацевтической практикой. Полиамины или их фармацевтически приемлемые соли могут быть введены перрорально или парентерально. Парентеральное введение включает внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное, подкожное и локальное введение. The polyamine or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be administered to a mammal or in combination with pharmaceutically acceptable carriers or diluents in a pharmaceutical composition in accordance with standard pharmaceutical practice. Polyamines or their pharmaceutically acceptable salts may be administered orally or parenterally. Parenteral administration includes intravenous, intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous and local administration.

Для перорального использования полиамина или его фармацевтически приемлемой соли настоящего изобретения соединение можно вводить, например, в форме таблеток или капсул, или же в виде водного раствора или суспензии. В случае использования перорально вводимых таблеток обычно используемыми носителями являются лактоза и кукурузный крахмал, а также смазочные агенты, такие как стеорат магния. Для перорального введения в форме капсулы пригодными разбавителями являются лактоза и сушеный кукурузный крахмал. Когда для перорального использования назначают водные суспензии, активный компонент комбинируют с эмульгатором или суспендирующим агентом. При желании могут быть добавлены определенные подслаивающие и/или вкусовые вещества. For oral use of the polyamine or its pharmaceutically acceptable salt of the present invention, the compound can be administered, for example, in the form of tablets or capsules, or in the form of an aqueous solution or suspension. In the case of the use of orally administered tablets, the commonly used carriers are lactose and corn starch, as well as lubricating agents such as magnesium steorate. For oral administration in capsule form, suitable diluents are lactose and dried corn starch. When aqueous suspensions are prescribed for oral use, the active ingredient is combined with an emulsifier or suspending agent. If desired, certain sweetening and / or flavoring agents may be added.

Для внутримышечного, внутрибрюшинного, подкожного и внутривенного использования обычно получают стерильные растворы активного компонента, рН растворов должен быть надлежащим образом отрегулирован и отбуферован. Для внутривенного использования общая концентрация растворов должна регулироваться с тем, чтобы препарат стал изотоническим. For intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous and intravenous use, sterile solutions of the active ingredient are usually obtained, the pH of the solutions must be properly adjusted and buffered. For intravenous use, the total concentration of the solutions should be regulated so that the drug becomes isotonic.

При использовании полиамина или его соли в соответствии с изобретением для человека суточная доза обычно определяется врачом. Однако пригодные дозировки полиаминов настоящего изобретения составляют около 3-30 мг/кг/день. Кроме того, дозировка будет варьироваться в зависимости от возраста, веса и реакции отдельного пациента, а также от тяжести симптомов пациента и потенции вводимого соединения. Следовательно, возможны дозировки за пределами указанного диапазона и они находятся в пределах объема настоящего изобретения. When using the polyamine or its salt in accordance with the invention for humans, the daily dose is usually determined by a physician. However, suitable dosages of the polyamines of the present invention are about 3-30 mg / kg / day. In addition, the dosage will vary depending on the age, weight and response of the individual patient, as well as the severity of the patient's symptoms and the potency of the compound administered. Therefore, dosages outside the specified range are possible and are within the scope of the present invention.

При использовании полиамина или его соли в борьбе с беспозвоночными вредителями данное соединение вводят беспозвоночному непосредственно или в окружающую данное беспозвоночное среду. Например, соединение настоящего изобретения можно распылять в качестве раствора на указанное беспозвоночное. Количество соединения, необходимое для уничтожения данного вредителя, варьируется в зависимости от вида беспозвоночного и окружающих условий и определяется тем лицом, которое осуществляет применение соединения. When using polyamine or its salt in the control of invertebrate pests, this compound is administered directly to the invertebrate or to the surrounding invertebrate environment. For example, a compound of the present invention can be sprayed as a solution onto said invertebrate. The amount of compound required to kill this pest varies depending on the type of invertebrate and environmental conditions and is determined by the person who uses the compound.

При использовании полиамина или его фармацевтически приемлемой соли для физиологического исследования клеток указанное соединение вводят в клетки в соответствии с известными методами в данной области техники. Например, указанное соединение можно вводить в клетки в подходящем физиологическом буферном растворе. Подходящая концентрация соединений настоящего изобретения для использования при таких исследованиях составляет 100 мкМ. Однако концентрация указанных соединений в таких исследованиях может быть выше или намного ниже, чем 100 мкМ. Количество вводимого соединения определяет специалист в соответствии с хорошо известными методами. When using a polyamine or a pharmaceutically acceptable salt thereof for physiological examination of cells, the compound is introduced into cells in accordance with known methods in the art. For example, said compound can be introduced into cells in a suitable physiological buffer solution. A suitable concentration of the compounds of the present invention for use in such studies is 100 μM. However, the concentration of these compounds in such studies may be higher or much lower than 100 μM. The amount of compound administered is determined by one skilled in the art in accordance with well-known methods.

П р и м е р 1. Начальное фракционирование яда Agelenopsis aperta
Цельный яд паука Agelenopsis aperta, полученный из Нэйчурал Продукт Сайенсез, Инк. , Солт Лэйк Сити, Юта 84108, и хранимый в замороженном состоянии при температуре -78оС, оттаивают, и 10-60 мкл его разбавляют до 200 мкл и нагружают на колонку С-18 Vydaс Vudac® (22х150 мм, размер пор 300

Figure 00000144
, размер частиц 10 мкм) и элюируют с применением скорости перемещения фронта растворителя, равной 15 мл/мин, и системы растворителей, используя программу линейного градиента 0% ->>20% В, 100% ->>80% А/0 - 30 мин/, где А и В обозначают соответственно 0,1% водную трифторуксусную кислоту (ТФА) и ацетонитрил. Пиковое обнаружение осуществляют монохроматически при 220 км и фракции собирают фракционным коллектором ISCO/"FOXY" и пиковым детектором ISCO 2159. Фракции собирают в течение 0-30 мин. На основе пикового обнаружения собирают, кроме других, следующие фракции: Фракция Время
элюирова-
ния, мин 1 около 13,8 2 около 19,25 3 около 21,0 4 около 22,3 5 около 23,1 6 около 26,0 Фракцию 1 субфракционируют с использованием той же самой колонки и условий, описанных выше, однако с применением детектора на диодной матрице Waters 990, и обнаружено, что фракция 1 содержит полиамин AGEL 452. Данный полиамин описан в находящейся на рассмотрении заявке на патент США N 07/346181 и не составляет часть настоящего изобретения. Фракция 2 аналогична описанной для субфракционирования фракции 1, и обнаружено, что фракция 2 содержит полиамин AGEL 448 и полиамин AGEL 468, которые описаны в указанной заявке на патент США N 07/346181. Ни один из этих полиаминов не составляет часть настоящего изобретения. Кроме того, фракцию 3 субфракционируют с использованием колонки С-4 Vydaс Vudac® (22х250 мм, размер пор 300
Figure 00000145
, размер частиц 10 мкм), используя линейный градиент 5% ->>10% В, 95% ->>90% А/0 - 30 мин/, где А и В имеют вышеприведенные значения, а также детектор на диодной матрице Waters 990. Обнаружено, что фракция 3 содержит полиамины 504 и 505, которые также описаны в заявке на патент США N 07/346181 и которые не составляют часть настоящего изобретения.PRI me R 1. The initial fractionation of the poison Agelenopsis aperta
Whole Agelenopsis aperta Spider Venom Derived from the Natural Product Science, Inc. , Salt Lake City, Utah 84108, and stored frozen at -78 ° C, thawed, and 10-60 .mu.l diluted to 200 ul and loaded onto a C-18 column Vydas Vudac ® (22h150 mm, 300 pore size
Figure 00000144
, particle size 10 μm) and elute using a solvent front velocity of 15 ml / min and a solvent system using a linear gradient program of 0% - >> 20% B, 100% - >> 80% A / 0 - 30 min /, where A and B are respectively 0.1% aqueous trifluoroacetic acid (TFA) and acetonitrile. Peak detection is carried out monochromatically at 220 km and fractions are collected by the ISCO / "FOXY" fraction collector and ISCO 2159 peak detector. Fractions are collected for 0-30 minutes. Based on peak detection, the following fractions are collected, among others: Fraction Time
eluting
min, about 1 13.8 2 about 19.25 3 about 21.0 4 about 22.3 5 about 23.1 6 about 26.0 Fraction 1 is subfractionated using the same column and the conditions described above, however with using a Waters 990 diode array detector, and it was found that fraction 1 contains AGEL 452 polyamine. This polyamine is described in U.S. Patent Application Serial No. 07/346181 and is not part of the present invention. Fraction 2 is similar to that described for subfractionation of fraction 1, and it was found that fraction 2 contains polyamine AGEL 448 and polyamine AGEL 468, which are described in said patent application US No. 07/346181. None of these polyamines are part of the present invention. In addition, fraction 3 was subfractionated using a C-4 Vydac Vudac ® column (22x250 mm, pore size 300
Figure 00000145
, particle size 10 μm) using a linear gradient of 5% - >> 10% B, 95% - >> 90% A / 0 - 30 min /, where A and B have the above values, as well as a Waters 990 diode array detector Fraction 3 was found to contain polyamines 504 and 505, which are also described in US patent application N 07/346181 and which do not form part of the present invention.

П р и м е р 2. Субфракционирование фракции 4 и определение структуры. PRI me R 2. Subfractionation of fraction 4 and the definition of the structure.

Фракцию 4, полученную как описано в примере 1, загружают в колонку С-18 Baker (4,6х250 мм, размер пор 300

Figure 00000146
, размер частиц 5 мкм) и элюируют с использованием скорости растекания 1 мл/мин и изократических условий 8% В, 92% А, где А и В имеют определенные в примере 1 значения. Пиковое определение осуществляют с использованием детектора на диодной матрице Waters 990 (λ= 220 нм) и сбор фракций осуществляют в соответствии с описанием примера 1. Субфракцию, отмеченную в форме AGEL 521, элюируют из колонки в течение приблизительно 19,50 мин. Фракцию AGEL 521 получают для спектрального анализа лиофилизацией из элюента с последующей лиофилизацией из воды в соответствии со стандартными методами. Лиофилизированное соединение фракции AGEL 521 сохраняют при температуре около -80оС в атмосфере аргона до использования.Fraction 4, obtained as described in example 1, is loaded into a column C-18 Baker (4.6 x 250 mm, pore size 300
Figure 00000146
, particle size 5 μm) and elute using a spreading rate of 1 ml / min and isocratic conditions of 8% B, 92% A, where A and B are as defined in Example 1. Peak determination is carried out using a Waters 990 diode array detector (λ = 220 nm) and fractions are collected as described in Example 1. The subfraction marked in AGEL 521 is eluted from the column for approximately 19.50 minutes. The AGEL 521 fraction is obtained for spectral analysis by lyophilization from an eluent followed by lyophilization from water in accordance with standard methods. The lyophilized compound of fraction AGEL 521 was stored at a temperature of about -80 ° C under argon until use.

Затем с помощью масс-спектроскопии определяют структуру соединения, которое содержится во Фракции AGEL 521. Полученные таким образом данные и выведенная структура представляют собой следующее
AGEL 521:
Масс-спектроскопия: (высокое разрешение) наблюдаемое (М + Н)М/Z = = 522,3774 в пересчете на С26Н48N7O4 (Требуется 522, 3768).Then, using the mass spectroscopy, the structure of the compound contained in Fraction AGEL 521 is determined. The data thus obtained and the resulting structure are as follows
AGEL 521:
Mass spectroscopy: (high resolution) observed (M + H) M / Z = 522.3774 in terms of C 26 H 48 N 7 O 4 (Required 522, 3768).

Структура: 1Н-индол-3-ацетамид-N-(20-амино-4,8-дигидрокси-4,8,12,17-тетраазеикоз-1-ил). Structure: 1H-indol-3-acetamide-N- (20-amino-4,8-dihydroxy-4,8,12,17-tetraaseikoz-1-yl).

Figure 00000147
Figure 00000148
Figure 00000149
Figure 00000150
Figure 00000151
Figure 00000152
Figure 00000153
Figure 00000154
Figure 00000155
Figure 00000156
Figure 00000157
Figure 00000158
NH2
П р и м е р 3. Субфракционирование фракции 5 и определение структуры.
Figure 00000147
Figure 00000148
Figure 00000149
Figure 00000150
Figure 00000151
Figure 00000152
Figure 00000153
Figure 00000154
Figure 00000155
Figure 00000156
Figure 00000157
Figure 00000158
NH 2
PRI me R 3. Subfractionation of fraction 5 and the definition of structure.

Фракцию 5, полученную как описано в примере 1, загружают в колонку Dynamax Phenyl (4,6х250 мм, размер пор 60

Figure 00000159
, размер частиц 8 мкм) и элюируют с использованием скорости перемещения фронта 1 мл/мин и изократических условий 10% В, 90% А, где А и В имеют приведенные в примере 1 значения. Пиковое определение и сбор фракций осуществляют как описано в примере 2. Фракции, помеченные AGEL 416 и AGEL 464, получают следующим образом: Фракция Время элюирования, мин AGEK 416 около 26,47 AGEL 464 около 37,76
Фракции AGEL 416 и AGEL 464 получают для спектрального анализа и хранят в соответствии с методами, приведенными в примере 2.Fraction 5, obtained as described in example 1, was loaded into a Dynamax Phenyl column (4.6 x 250 mm, pore size 60
Figure 00000159
, particle size 8 μm) and elute using a front movement speed of 1 ml / min and isocratic conditions of 10% B, 90% A, where A and B have the values given in Example 1. Peak determination and collection of fractions is carried out as described in Example 2. Fractions labeled with AGEL 416 and AGEL 464 are prepared as follows: Fraction Elution time, min. AGEK 416 about 26.47 AGEL 464 about 37.76
Fractions AGEL 416 and AGEL 464 obtained for spectral analysis and stored in accordance with the methods described in example 2.

Структуру соединения, соединяющего во фракции AGEL 416, определяют с использованием масс-спектроскопии, и результаты приведены ниже:
Масс-спектр: (высокая разрешающая способность) наблюдаемое (М + Н)М/Z = = 417,3336 (в пересчете на С23Н41N6O4 (Требуется 417, 3342). Структура: 1Н-индол-3-ацетамид-N-(16-амино-4,8,13-триазагекса- дец -1-ил)

Figure 00000160
Figure 00000161
Figure 00000162
Figure 00000163
Figure 00000164
Figure 00000165
Figure 00000166
Figure 00000167
Figure 00000168
Figure 00000169
NH2 Структура соединения, соединяющего во фракции AGEL 464, определяется масс-спектроскопией и приводится ниже:
Масс-спектроскопия: (высокая разрешающая способность) обнаруживаемое (М + Н)М/Z = 465:3173 в пересчете на С23Н41N6O4 (требуется 465,3189).The structure of the compound connecting in the AGEL 416 fraction is determined using mass spectroscopy, and the results are shown below:
Mass spectrum: (high resolution) observed (M + H) M / Z = = 417.3336 (in terms of С 23 Н 41 N 6 O 4 (Required 417, 3342). Structure: 1Н-indole-3- acetamide-N- (16-amino-4,8,13-triazagex-dec -1-yl)
Figure 00000160
Figure 00000161
Figure 00000162
Figure 00000163
Figure 00000164
Figure 00000165
Figure 00000166
Figure 00000167
Figure 00000168
Figure 00000169
NH 2 The structure of the compound connecting in the AGEL 464 fraction is determined by mass spectroscopy and is given below:
Mass spectroscopy: (high resolution) detectable (M + H) M / Z = 465: 3173 in terms of C 23 H 41 N 6 O 4 (465.3189 required).

Структура: 1Н-индол-3-ацетамид-N-(16-амино-4,8-дигидрокси-4,8,13-триазагекса- дец -1-ил)-4-гидрокси

Figure 00000170
Figure 00000171
Figure 00000172
Figure 00000173
Figure 00000174
Figure 00000175
Figure 00000176
Figure 00000177
Figure 00000178
Figure 00000179
NH2 Structure: 1H-indol-3-acetamide-N- (16-amino-4,8-dihydroxy-4,8,13-triazagex-dec-1-yl) -4-hydroxy
Figure 00000170
Figure 00000171
Figure 00000172
Figure 00000173
Figure 00000174
Figure 00000175
Figure 00000176
Figure 00000177
Figure 00000178
Figure 00000179
NH 2

Claims (1)

Способ получения полиаминов, выбранных из группы, состоящей из
Figure 00000180
Figure 00000181
Figure 00000182
Figure 00000183
Figure 00000184
Figure 00000185
Figure 00000186
Figure 00000187
Figure 00000188
Figure 00000189
Figure 00000190
Figure 00000191
;;
Figure 00000192
Figure 00000193
Figure 00000194
Figure 00000195
Figure 00000196
Figure 00000197
Figure 00000198
Figure 00000199
Figure 00000200
Figure 00000201
,,
где R - водород или окси,
или их фармацевтически приемлемых солей, отличающийся тем, что цельный яд паука Agelenopsis aperta элюируют на первой стадии из колонки С-18 VydacR (22 · 250 мм, размер пор 300
Figure 00000202
, размер частиц 10 мкм) с использованием скорости перемещения фронта растворителя 15 мл/мин системы растворителей с применением программы линейного градиента 0% → 20% ацетонитрила 100% → 80% 0,1% -ной водной трифторуксусной кислоты, а также монохроматического определения пиков при 220 нм, при этом элюируют фракции со временем выхода приблизительно 22,3 и 23,1 мин, собирают и элюируют первую фракцию из колонки С-18 Baker (4,6 · 250 мм, размер пор 300
Figure 00000203
, размер частиц 5 мм) с применением скорости перемещения фронта растворителя 1 мл/мин, изократических условий 8% ацетонитрила и 92% 0,1%-ной водной трифторуксусной кислоты и пикового определения при 220 нм с элюированием в течение 19,5 мин, собирают и необязательно лиофилизируют, ресуспендируют в воде и лиофилизируют из воды с получением соединения формулы
Figure 00000204
Figure 00000205
Figure 00000206
Figure 00000207
Figure 00000208
Figure 00000209
Figure 00000210
Figure 00000211
Figure 00000212
Figure 00000213
Figure 00000214
Figure 00000215
NH2
элюированную на первой стадии фракцию со временем выхода 23,1 мин элюируют из колонки Dynamax Phenye (4,6 · 250 мм, размер пор 60
Figure 00000216
, размер частиц 8 мкм) с применением скорости перемещения фронта растворителя 1 мл/мин, изократических условий 10% ацетонитрила и 90% 0,1%-ной водной трифторуксусной кислоты и пикового определения при 220 нм, при этом фракции, которые элюируют приблизительно при времени выхода 26,47 и 37,76 мин, собирают и необязательно лиофилизируют, ресуспендируют в воде и лиофилизируют из воды с получением соответственно соединений формулы
Figure 00000217
Figure 00000218
Figure 00000219
Figure 00000220
Figure 00000221
Figure 00000222
Figure 00000223
Figure 00000224
Figure 00000225
Figure 00000226
NH2;;
Figure 00000227
Figure 00000228
Figure 00000229
Figure 00000230
Figure 00000231
Figure 00000232
Figure 00000233
Figure 00000234
Figure 00000235
..A method of producing polyamines selected from the group consisting of
Figure 00000180
Figure 00000181
Figure 00000182
Figure 00000183
Figure 00000184
Figure 00000185
Figure 00000186
Figure 00000187
Figure 00000188
Figure 00000189
Figure 00000190
Figure 00000191
;;
Figure 00000192
Figure 00000193
Figure 00000194
Figure 00000195
Figure 00000196
Figure 00000197
Figure 00000198
Figure 00000199
Figure 00000200
Figure 00000201
,,
where R is hydrogen or hydroxy,
or their pharmaceutically acceptable salts, characterized in that the whole venom of the spider Agelenopsis aperta is eluted in the first stage from the C-18 Vydac R column (22 × 250 mm, pore size 300
Figure 00000202
, particle size 10 μm) using a solvent front displacement rate of 15 ml / min solvent system using a linear gradient program of 0% → 20% acetonitrile 100% → 80% 0.1% aqueous trifluoroacetic acid, as well as monochromatic determination of peaks at 220 nm, while the fractions elute with a yield time of approximately 22.3 and 23.1 minutes, the first fraction is collected and eluted from the C-18 Baker column (4.6 × 250 mm, pore size 300
Figure 00000203
, particle size 5 mm) using a solvent front displacement rate of 1 ml / min, isocratic conditions of 8% acetonitrile and 92% 0.1% aqueous trifluoroacetic acid and peak determination at 220 nm with elution for 19.5 minutes, collected and optionally lyophilized, resuspended in water and lyophilized from water to give a compound of the formula
Figure 00000204
Figure 00000205
Figure 00000206
Figure 00000207
Figure 00000208
Figure 00000209
Figure 00000210
Figure 00000211
Figure 00000212
Figure 00000213
Figure 00000214
Figure 00000215
NH 2
the fraction eluted in the first stage with a yield time of 23.1 min was eluted from a Dynamax Phenye column (4.6 × 250 mm, pore size 60
Figure 00000216
, particle size 8 μm) using a solvent front displacement rate of 1 ml / min, isocratic conditions of 10% acetonitrile and 90% 0.1% aqueous trifluoroacetic acid and peak determination at 220 nm, while fractions that elute at approximately time yields 26.47 and 37.76 min., are collected and optionally lyophilized, resuspended in water and lyophilized from water to give respectively compounds of the formula
Figure 00000217
Figure 00000218
Figure 00000219
Figure 00000220
Figure 00000221
Figure 00000222
Figure 00000223
Figure 00000224
Figure 00000225
Figure 00000226
NH 2 ;;
Figure 00000227
Figure 00000228
Figure 00000229
Figure 00000230
Figure 00000231
Figure 00000232
Figure 00000233
Figure 00000234
Figure 00000235
..
SU4894114 1990-01-02 1990-12-29 Method of synthesis or polyamines or their pharmaceutically acceptable salts RU2014324C1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US46020790A 1990-01-02 1990-01-02
US460207 1990-01-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2014324C1 true RU2014324C1 (en) 1994-06-15

Family

ID=23827774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU4894114 RU2014324C1 (en) 1990-01-02 1990-12-29 Method of synthesis or polyamines or their pharmaceutically acceptable salts

Country Status (3)

Country Link
MX (1) MX24014A (en)
RU (1) RU2014324C1 (en)
ZA (1) ZA917B (en)

Also Published As

Publication number Publication date
MX24014A (en) 1994-02-28
ZA917B (en) 1992-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0436332B1 (en) Polyamines useful as antagonists of excitatory amino acid neurotransmitters
JP2747279B2 (en) Polypeptides useful as antagonists of excitatory amino acid neurotransmitters and / or as blockers of calcium channels
RU2104286C1 (en) Polypeptide or its pharmaceutically acceptable salts
US5122596A (en) Polypeptides useful as blockers of calcium channels
RU2014324C1 (en) Method of synthesis or polyamines or their pharmaceutically acceptable salts
RU2106358C1 (en) Polypeptide or its pharmaceutically acceptable salt (variants); method to suppress the action of amino acid neuromediators