RU2010853C1

RU2010853C1 - Method of identification of bacteria of genus brucella using bacteriophage

Info

Publication number: RU2010853C1
Authority: RU
Inventors: Лариса Вениаминовна Ляпустина; Сергей Львович Проценко
Original assignee: Лариса Вениаминовна Ляпустина; Сергей Львович Проценко
Priority date: 1991-07-16
Filing date: 1991-07-16
Publication date: 1994-04-15

Abstract

FIELD: medicinal microbiology. SUBSTANCE: method involves preparing of culture suspension, its application on the solid nutrient medium together with bacteriophage, incubation of sowing following by recording of results on the basis of culture lysis with bacteriophage. Culture suspension is prepared in phosphate buffer pH 7.2-7.4 containing calcium and magnesium sulfate (concentration of each solution is 10^-2-10^-3M M). Before application on the solid nutrient medium culture suspension is mixed with bacteriophage at ratio (1: 3)-(1: 4) and incubated at 36-38 C for 20-30 min. Application on the nutrient medium is carried out by a single manner using replicating tool. EFFECT: improved method of identification. 2 tbl

Description

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к методам идентификации и дифференциации культур с использованием бактериофагов. The invention relates to medical microbiology, in particular to methods for the identification and differentiation of cultures using bacteriophages.

Известны различные способы идентификации микроорганизмов с использованием бактериофагов, исключающие:
- приготовление взвеси культуры соответствующей концентрации в физиологическом бульоне (растворе), посев ее газоном на агаровую пластинку с последующим подсушиванием и нанесением бактериофага каплями или "дорожкой" на газон культуры [1] (Руководство по микробиологии чумы. : Саратов, 1972. - с. 132). Данный способ позволяет идентифицировать на одной чашке 1-2 культуры;
- приготовление взвеси культуры соответствующей концентрации в физрастворе (бульоне), посев ее "дорожкой" на агаровую пластинку с последующим подсушиванием и нанесением каплями бактериофага на "дорожку" культуры. Данный способ позволяет идентифицировать на одной чашке 3-5 культур одновременно.There are various ways of identifying microorganisms using bacteriophages, excluding:
- preparation of a suspension of a culture of the appropriate concentration in a physiological broth (solution), sowing it with a lawn on an agar plate, followed by drying and applying a bacteriophage with drops or a “path” to a culture lawn [1] (Guide to Plague Microbiology.: Saratov, 1972. - p. 132). This method allows you to identify 1-2 cultures on one cup;
- preparation of a suspension of culture of the corresponding concentration in saline solution (broth), sowing it with a "path" on an agar plate, followed by drying and applying drops of the bacteriophage to the "path" of the culture. This method allows to identify 3-5 cultures at a time on one cup.

Недостатками данного способа являются трудоемкость при одновременной идентификации значительного количества штаммов и связанный с ней материальный расход большого объема питательных сред, относительно невысокая чувствительность при исследовании культур с различной степенью фаголизабельности. The disadvantages of this method are the complexity of the simultaneous identification of a significant number of strains and the associated material consumption of a large volume of culture media, relatively low sensitivity in the study of cultures with varying degrees of phagolisability.

Наиболее близко к предполагаемому изобретению относится способ идентификации культур с использованием бактериофага, который включает приготовление взвеси соответствующей концентрации, после культуры "дорожкой" на плотную питательную среду, подсушивание и нанесение бактериофага каплями на "дорожку" культуры: инкубацию и идентификацию культуры по наличию или отсутствию лизиса ее бактериофагом [2] . Closest to the alleged invention relates to a method for identifying cultures using a bacteriophage, which involves preparing a suspension of the appropriate concentration, after culture with a “lane” on a dense nutrient medium, drying and applying the bacteriophage with drops onto a “lane” of culture: incubation and identification of the culture by the presence or absence of lysis its bacteriophage [2].

Недостатком этого способа является трудоемкость при одновременной идентификации значительного количества штаммов и связанный с ней материальный расход большого объема питательных сред, относительно невысокая чувствительность при исследовании культур с различной степенью фаголизабельности. The disadvantage of this method is the complexity of the simultaneous identification of a significant number of strains and the associated material consumption of a large volume of nutrient media, relatively low sensitivity in the study of cultures with various degrees of phagolizability.

Целью предполагаемого изобретения является расширение объема исследования при сокращении материальных затрат с одновременным повышением чувствительности метода. The aim of the proposed invention is to expand the scope of the study while reducing material costs while increasing the sensitivity of the method.

Сущность изобретения заключается в том, что культуру с фагом наносят на плотную питательную среду и по наличию или отсутствию лизиса проводят идентификацию культуры. Причем культуру, приготовленную в фосфатном буфере с pH 7,2-7,4, содержащем дополнительно сернокислый калий и сернокислый магний в концентрации 10^-2-10^-3 М каждой, предварительно в матрице смешивают с бактериофагом в соотношении 1: 3-1: 4. Полученную смесь инкубируют в течение 20-30 мин при 36-38^оС, после чего наносят одномоментно репликатором на плотную питательную среду.The essence of the invention lies in the fact that the culture with phage is applied to a dense nutrient medium, and the culture is identified by the presence or absence of lysis. Moreover, the culture prepared in phosphate buffer with a pH of 7.2-7.4, containing additional potassium sulfate and magnesium sulfate at a concentration of 10 ^-2 -10 ^-3 M each, is preliminarily mixed in the matrix with a bacteriophage in a ratio of 1: 3-1: 4. The resulting mixture was incubated for 20-30 minutes at 36-38 ^{° C,} after which the replicator is applied simultaneously on solid growth medium.

Отличительные признаки заявляемого объекта состоят в том, что культура перед нанесением на плотную питательную среду предварительно смешивается с бактериофагом в соотношении 1: 3-1: 4. Взвесь культуры готовят в фосфатном буфере (pH 7,2-7,4), содержащем дополнительно сернокислый кальций и сернокислый магний в концентрации 10^-2-10^-3 М каждой. Смесь инкубируют в течение 20-30 мин при 36-38^оС, нанесение смеси на плотную питательную среду осуществляют одномоментно репликатором.Distinctive features of the claimed object are that the culture before application to a solid nutrient medium is pre-mixed with a bacteriophage in a ratio of 1: 3-1: 4. A suspension of the culture is prepared in phosphate buffer (pH 7.2-7.4), containing additional sulfate calcium and magnesium sulfate in a concentration of 10 ^-2 -10 ^-3 M each. The mixture was incubated for 20-30 minutes at 36-38 ^{° C,} applying the mixture on a solid growth medium is performed simultaneously replicator.

Предварительное смешение бактериофага со взвесью культуры, приготовленной в соответствующем буфере с последующей инкубацией, осуществляют для обеспечения достаточной адсорбции бактериофага на поверхности микробной клетки, при этом жидкая среда, в которой происходит смешение, способствует большей возможности контакта бактериофага с клеточными рецепторами; инкубацию смеси фаг-культура в течение 20-30 мин при температуре 36-38^оС обеспечивает необратимость абсорбции: при высокой концентрации бактерий большая часть фаговых корпускул прикрепляется к клеточным рецепторам обратимо, при увеличении же количества фаговых частиц, приходящихся на одну микробную клетку до соотношения 3: 1-4: 1, степень необратимости абсорбции возрастает.Pre-mixing the bacteriophage with a suspension of culture prepared in the appropriate buffer, followed by incubation, is carried out to ensure sufficient adsorption of the bacteriophage on the surface of the microbial cell, while the liquid medium in which the mixing takes place makes the bacteriophage more likely to contact the cell receptors; incubating the mixture of phage-culture for 20-30 minutes at 36-38 ^{° C} provides irreversible absorption: at high concentration, most of the bacteria phage corpuscles attached to cellular receptors is reversible, by increasing the number of phage particles per one microbial cell to a ratio 3: 1-4: 1, the degree of irreversibility of absorption increases.

Значительно влияние на процесс адсорбции оказывает также присутствие катионов в среде взаимодействия фаг-бактерия, поскольку начальной ступенью адсорбции фага является образование электростатических связей между соответствующими конфигурациями ионных зарядов на поверхности бактериофага, так и микробной клетки. Катионы, присутствующие в среде, в частности, кальция и магния, определяют формирование электростатических зарядов на обоих телах, что обеспечивает эффективность столкновения между фаговыми частицами и бактериальными клетками. The presence of cations in the environment of phage-bacterium interaction also has a significant effect on the adsorption process, since the initial stage of phage adsorption is the formation of electrostatic bonds between the corresponding configurations of ionic charges on the surface of the bacteriophage and the microbial cell. The cations present in the medium, in particular calcium and magnesium, determine the formation of electrostatic charges on both bodies, which ensures the efficiency of the collision between phage particles and bacterial cells.

Способ осуществляется следующим образом: готовят взвесь исследуемых штаммов в концентрации 1^.10⁹ микробных клеток (м. к. )/мл в фосфатном буфере (pH 7,2-7,4), содержащем дополнительно сернокислый кальций и сернокислый магний в концентрации 10^-2-10^-3 М каждой. В лунки стерильной матрицы вносят 1 ч. (10 мкл) взвеси культуры исследуемых штаммов, сюда же добавляют 3-4 ч. (30-40 мкл) бактериофага. Параллельно в лунки также вносят в том же объеме (1 ч. - 10 мкл) взвесь культуры, куда бактериофаг не добавляют (контроль культуры). Матрицу накрывают чашкой Петри и помещают в термостат при 36-38^оС на 20-30 мин, после чего штампом-репликатором делают отпечатки на агаровые пластинки. На одной чашке, таким образом, можно исследовать до 25 штаммов. Чашки с посевами инкубируют в течение 24-36 ч при 36-38^оС. Идентификацию культур осуществляют по степени лизиса бактериофагом. При этом возможны следующие уровни колебаний чувствительности:
"СL" - полный лизис культуры бактериофагом
"SCL" - единичные колонии на фоне сплошного лизиса
"OCL" - вторичный рост культуры на фоне сплошного лизиса
"+++, ++, +" - единичные негативные бляшки на фоне сплошного роста культуры
"-" - отсутствие лизиса
Описанные отличительные признаки позволяют обеспечить более высокую степень лизиса соответствующих культур бактериофагом.The method is as follows: prepare a suspension of the studied strains at a concentration of 1 ^. 10 ⁹ microbial cells (mk) / ml in phosphate buffer (pH 7.2-7.4), containing additional calcium sulfate and magnesium sulfate at a concentration of 10 ^-2 -10 ^-3 M each. 1 hour (10 μl) of the suspension of culture of the studied strains was added to the wells of the sterile matrix, 3-4 hours (30-40 μl) of the bacteriophage were added thereto. In parallel, a suspension of culture is added to the wells in the same volume (1 hour - 10 μl), where bacteriophage is not added (culture control). The matrix is covered Petri dish and placed in a thermostat at 36-38 ^{° C} for 20-30 min, after which the stamp-replicator make imprints on agar plates. Thus, up to 25 strains can be examined on one cup. Cups with crops incubated for 24-36 hours at 36-38 ^C. The cultures Identification carried by the degree of bacteriophage lysis. The following levels of sensitivity fluctuations are possible:
"CL" - complete lysis of the culture with a bacteriophage
"SCL" - single colonies on the background of continuous lysis
"OCL" - secondary growth of culture against a background of continuous lysis
"+++, ++, +" - single negative plaques against the background of continuous growth of culture
"-" - lack of lysis
The described distinguishing features allow for a higher degree of lysis of the respective cultures by the bacteriophage.

П р и м е р 1. В качестве системы микроорганизм - бактериофаг были использованы:
1. B. abortus 1552 + бруцеллезный бактериофаг Тб
2. B. suis 1330 + бруцеллезный бактериофаг Wb
3. B. abortus 19 + бруцеллезный бактериофаг Fi
4. B. melitеusis 565 + бруцеллезный бактериофаг Вк
Готовят взвесь указанных культур до конечной концентрации 1^.10⁹ м. к. /мл в фосфатном буфере pH 7,2, содержащем дополнительно сернокислый кальций и сернокислый магний в концентрации 10^-3 М каждой. В лунки матрицы вносят 10 мкл взвеси культур исследуемых штаммов, сюда же добавляют 30 мкл (1: 3) соответствующих бактериофагов. Параллельно в лунки вносят взвесь культур в том же объеме (10 мкл) - контроль культуры. Матрицу помещают в термостат на 20 мин при 36^оС, после чего штампом-репликатором наносят данную взвесь на агаровую пластинку. Чашку с посевом инкубируют в течение 24-36 ч при 36-38^оС.PRI me R 1. As a system of microorganism - bacteriophage were used:
1. B. abortus 1552 + brucellosis bacteriophage Tb
2. B. suis 1330 + brucellosis bacteriophage Wb
3. B. abortus 19 + brucellosis bacteriophage Fi
4. B. meliteusis 565 + brucellosis bacteriophage Bk
A suspension of these cultures is prepared to a final concentration of 1 ^. 10 ⁹ m.k./ml in phosphate buffer pH 7.2, additionally containing calcium sulfate and magnesium sulfate in a concentration of 10 ^-3 M each. 10 μl of suspension of cultures of the studied strains are added to the wells of the matrix, 30 μl (1: 3) of the corresponding bacteriophages are added. At the same time, suspension of cultures in the same volume (10 μl) is added to the wells — control the culture. The matrix is placed in a thermostat for 20 min at 36 ^{° C,} whereupon the stamp-replicator this slurry was applied onto an agar plate. Cup sowing incubated for 24-36 hours at 36-38 ° ^C.

При просмотре чашки на фоне роста культуры в контроле наблюдается ее лизис в опыте - рост культуры отсутствует. When viewing the cup against the background of the growth of the culture in the control, its lysis in the experiment is observed - there is no culture growth.

П р и м е р 2. Использованы те же системы микроорганизм-бактериофаг, что и в примере 1. PRI me R 2. Used the same system microorganism-bacteriophage, as in example 1.

Готовят взвесь культуры до концентрации 1^.10⁹ м. к. /мл в фосфатном буфере pH 7,3, содержащем дополнительно сернокислый кальций и сернокислый магний в концентрации 5^.10^-3 М каждой. В лунки матрицы вносят 10 мкл взвеси культур, сюда же добавляют 35 мкл (1: 3,5) соответствующих бактериофагов. Параллельно в лунки вносят взвесь культур в том же объеме (10 мкл) - контроль культуры. Матрицу инкубируют в течение 25 мин при 37^оС, после чего штампом-репликатором наносят данную смесь на агаровую пластинку. Чашку с посевом инкубируют в течение 24-36 ч при температуре 36-38^оС. При просмотре чашки на фоне роста культуры в контроле наблюдается ее лизис в опыте - рост культуры отсутствует.Prepare a suspension of culture to a concentration of 1 ^. 10 ⁹ m.k./ml in phosphate buffer pH 7.3, containing additional calcium sulfate and magnesium sulfate at a concentration of 5 ^. 10 ^-3 M each. 10 μl of suspension of cultures are added to the wells of the matrix, 35 μl (1: 3.5) of the corresponding bacteriophages are added. At the same time, suspension of cultures in the same volume (10 μl) is added to the wells — control the culture. The matrix was incubated for 25 min at ³⁷ ° C, whereupon the stamp-replicator this mixture was applied on an agar plate. Cup seeding is incubated for 24-36 hours at a temperature of 36-38 ° ^C. When viewing the cup on the background to monitor crop growth observed her lysis experience - there is no culture growth.

П р и м е р 3. Использованы те же системы фаг-микроорганизм, что в примере 1 и 2. PRI me R 3. Used the same phage microorganism systems that in example 1 and 2.

Готовят взвесь агаровой культуры до конечной концентрации 1^.10⁹ м. к. /мл в фосфатном буфере, содержащем дополнительно сернокислый кальций и сернокислый магний в концентрации 10^-2 М каждой. В лунки матрицы вносят взвесь культур по 10 мкл, сюда же добавляют 40 мкл (1: 4) соответствующих бактериофагов. Параллельно в лунки вносят культуру в том же объеме (10 мкл) - контроль культуры. Матрицу инкубируют в течение 30 мин при 38^оС, после чего штампом-репликатором наносят данную смесь на агаровую пластинку. Чашку с посевами инкубируют в течение 24-36 ч при температуре 36-38^оС. При просмотре чашки на фоне роста культуры в контроле наблюдается ее лизис в опыте - рост культуры отсутствует.Prepare a suspension of agar culture to a final concentration of 1 ^. 10 ⁹ m. K. / ml in phosphate buffer, additionally containing calcium sulfate and magnesium sulfate in a concentration of 10 ^-2 M each. A suspension of cultures of 10 μl was added to the wells of the matrix, 40 μl (1: 4) of the corresponding bacteriophages were added. In parallel, culture is added to the wells in the same volume (10 μl) - control the culture. The matrix was incubated for 30 min at 38 ^{° C,} whereupon the stamp-replicator this mixture was applied on an agar plate. Cup of crops are incubated for 24-36 hours at a temperature of 36-38 ° ^C. When viewing the cup on the background to monitor crop growth observed her lysis experience - there is no culture growth.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет расширить объем исследования в 4-5 раз при сокращении расхода питательных сред в 4-5 раз, при этом повышается чувствительность метода в 1,2-1,5 раза. (56) 1. Методические рекомендации по профилактике и лабораторной диагностике бруцеллеза. М. , 1980, с. 33. Thus, the proposed method allows to expand the volume of research by 4-5 times while reducing the consumption of nutrient media by 4-5 times, while the sensitivity of the method is increased by 1.2-1.5 times. (56) 1. Guidelines for the prevention and laboratory diagnosis of brucellosis. M., 1980, p. 33.

2. Carbel M. I. , Thomas E. L. "The Brucella-phage: their propеrties, characterisation and application", Weybridge, 1980, p. 25. 2. Carbel M. I., Thomas E. L. "The Brucella-phage: their properties, characterization and application", Weybridge, 1980, p. 25.

Claims

METHOD FOR IDENTIFICATION OF BRUCELLA BACTERIA USING A BACTERIOPHAGE, including preparing a suspension of culture, applying it and a bacteriophage to a solid nutrient medium, incubating the crops, followed by the results of the degree of lysis of the culture with a bacteriophage, characterized in that the suspension is suspended in a pH of 7 with culture buffer 7.2 - 7.4, containing calcium sulfate and magnesium sulfate in a concentration of 10 ^-12 - 10 ^-3 M each, before application to a solid nutrient medium, a suspension of the culture is mixed with a bacteriophage in a ratio of 1: 3 - 4, incubated for 20 to 30 minutes at 36 - 38 ^o C, application to the nutrient medium is carried out simultaneously with a replicator.