RU2010526C1

RU2010526C1 - Strain of micromycet trichoderma harzianum rifai for making preparation against causative agents of grape vine gray rot

Info

Publication number: RU2010526C1
Application number: SU915014491A
Authority: RU
Inventors: Я.И. Хитрон; Н.А. Люблинская; Е.Н. Биланенко; Л.А. Завьялова
Original assignee: Государственный аграрный университет Молдовы
Priority date: 1991-07-11
Filing date: 1991-07-11
Publication date: 1994-04-15

Abstract

FIELD: agriculture. SUBSTANCE: strain of micromycet Trichoderma Harzianum Rifai 86 is obtained from surface of grape berries and deposited in VKM, No. F-3272D. Preparation is produced by cultivating strain on agar must at room temperature for 12-14 days followed by washing off spores. Suspension is prepared with titer 10⁸ and used for treating grapes in blossoming stage. EFFECT: strain is antagonistic to Borytis cinerea, Penicillium expansum. 3 tbl

Description

Изобретение относится к сельскому хозяйству и представляет собой новый штамм, который может быть использован при хранении винограда в качестве источника биологической защиты. The invention relates to agriculture and is a new strain that can be used during storage of grapes as a source of biological protection.

Для биологической защиты успешнее всего применяются представители рода Trichoderma. Эффективность использования грибов данного рода подтверждена многолетней практикой в борьбе с почвенными грибами (см. С. Dennis and J. Webster, 1971, trans. Br. mycol. Soc. 57 (3), 363-369; Elad et al, 1982, Can. J. Microbiol. , 28, 719-725; M. N. Schroth and J. G. Hancock, 1981, Ann. Rev. Microbiology, 35, 459-463; Elad J. , Barek R. , Chet I. , 1984, Soil Biol. and Biochem, 16, 4, 381-386);
В качестве грибов-антагонистов чаще других используются виды Trichoderma harzianum и виды Т. viride. Естественное местообитание этих грибов - почва, где они чаще всего встречаются в подстилке. Это активные целлюлозоразрушители, участвующие в процессах деструкции растительного опада.Representatives of the genus Trichoderma are most successfully used for biological protection. The effectiveness of the use of fungi of this genus has been confirmed by many years of practice in combating soil fungi (see C. Dennis and J. Webster, 1971, trans. Br. Mycol. Soc. 57 (3), 363-369; Elad et al, 1982, Can . J. Microbiol., 28, 719-725; MN Schroth and JG Hancock, 1981, Ann. Rev. Microbiology, 35, 459-463; Elad J., Barek R., Chet I., 1984, Soil Biol. And Biochem, 16, 4, 381-386);
As antagonistic mushrooms, Trichoderma harzianum species and T. viride species are most often used. The natural habitat of these fungi is the soil, where they are most often found in the litter. These are active cellulose destructors involved in the destruction of plant litter.

Известна антагонистическая активность видов Trichoderma против несовершенных грибов рода Aspergillus - A. candidus, A. luchuensis, A. niger, A. fumigatus, A. terreus (Rai B. , Singh V. N. , Singh D. - Plant and Soil, 1980, 57, N 1, p. 131-135); рода Fusarium: F. oxysporum, F. solani, F. graminearum, F. culmorum, Alternaria spp. , Botrytis cinerea, Collectotrichum Lindemuthianum, аксомицетов (Chaetomium spp. , Coniochaeta); базидиальных (Lentinus edodes) (Бадяй С. Б. , Защита растений, Вып. 9, - С. 75. . . 78; Beratlief Z. , Morched S. - Bull. Acad. Sci. agr. et forest, 1983, N 12; Champion L. , J. E. Mitchel SCi. , Soc. , 1978, 94, N 2, p. 70; Knetmal M. B. , Hasannis S. N. , Sardesphpande T. S. , Diwakar M. P. - Curr. Sci. (India), 1984, 53, N 16, p. 862-868; Lacicova B. , Pieta D. - Ochr. rosl. , 1985, 29, N 5, p. 3-5, Tikimoto K. , Repts Tottori Mycol. Inst. , 1984, N 22, p. 63-64; Venkatasubbaiun P. , Safuula K. M. - Pros. Indian Nat. Sci. Acfd. , 1984, B 50, N 5, p. 525-529). The antagonistic activity of Trichoderma species against imperfect fungi of the genus Aspergillus - A. candidus, A. luchuensis, A. niger, A. fumigatus, A. terreus (Rai B., Singh VN, Singh D. - Plant and Soil, 1980, 57, N 1, p. 131-135); of the genus Fusarium: F. oxysporum, F. solani, F. graminearum, F. culmorum, Alternaria spp. , Botrytis cinerea, Collectotrichum Lindemuthianum, axomycetes (Chaetomium spp., Coniochaeta); basidial (Lentinus edodes) (Badiai S. B., Plant Protection, Vol. 9, P. 75.. 78; Beratlief Z., Morched S. - Bull. Acad. Sci. agr. et forest, 1983, N 12; Champion L., JE Mitchel SCi., Soc., 1978, 94, N 2, p. 70; Knetmal MB, Hasannis SN, Sardesphpande TS, Diwakar MP - Curr. Sci. (India), 1984, 53, N 16, p. 862-868; Lacicova B., Pieta D. - Ochr. Rosl., 1985, 29, N 5, p. 3-5, Tikimoto K., Repts Tottori Mycol. Inst., 1984, N 22, p. 63-64; Venkatasubbaiun P., Safuula KM - Pros. Indian Nat. Sci. Acfd., 1984, B 50, No. 5, p. 525-529).

Известно практическое использование гиперпаразитов и антагонистов против широкого круга грибов - возбудителей вегетатирующих растений, а также послеуборочных гнилей плодов, овощей и винограда при хранении. The practical use of hyperparasites and antagonists against a wide range of fungi - pathogens of vegetative plants, as well as post-harvest rot of fruits, vegetables and grapes during storage is known.

В частности, к снижению количества серой гнили на ягодах земляники после уборки урожая привело применение Trichoderma viride в поле (Tronsmo A. , Dennis C. - Neth. J. Plant Pathol. , 1977, v. 83, Suppl. 1, p. 449-455). In particular, the use of Trichoderma viride in the field (Tronsmo A., Dennis C. - Neth. J. Plant Pathol., 1977, v. 83, Suppl. 1, p. 449) led to a decrease in the amount of gray rot on strawberries after harvesting. -455).

Использование суспензий конидий Trichoderma harzianum для обработки яблоневых деревьев в период цветения привело к уменьшению количества гнили, вызванной В. cinerea на яблоках (Tronsmo A. , Ystaas J. , - Plant Dis. , 1980, v. 64, p. 1009). The use of Trichoderma harzianum conidia suspensions for treating apple trees during the flowering period reduced the amount of rot caused by B. cinerea on apples (Tronsmo A., Ystaas J., Plant Dis., 1980, v. 64, p. 1009).

Оценены антагонистические свойства 9 видов рода Trichoderma в отношении B. cinerea. Обнаружена высокая антагонистическая активность у группы штаммов Trichoderma, в которую входили виды T. viride, T. harzianum, T. koningii, T. longibrachiatum (Sailloux, Froidefond - Bull. OEPP, 1987, v. 17, N 4, p. 541-547). The antagonistic properties of 9 species of the genus Trichoderma against B. cinerea were evaluated. High antagonistic activity was found in the group of Trichoderma strains, which included the species T. viride, T. harzianum, T. koningii, T. longibrachiatum (Sailloux, Froidefond - Bull. OEPP, 1987, v. 17, No. 4, p. 541- 547).

Известна защита винограда от серой гнили с помощью Trichoderma viride T. haezianum с целью улучшения качества урожая (Dubos B. , Ulit J. , Bugaret Y. , Verdu D. - L'academie d'agriculture de France, 1978, 64, N 14, p. 1159-1167; Dubos B. - Proc. Int. Cont. Integr. Plant Prot. , Budapest, 1983. , p. 41-47; Dubos B. in. : Current perspectives in microbial ecology. Washington, 1984, p. 370-373; Dubos B. , Bulit J. - Microbial ecology of the phylloplane. London est, 1981, p. 353-367; Davet P. - Bull. OEPP, 1987, 17, N 14, p. 535-540; Nair N. G. , Parker F. E. - Plant Pathol. , 1985, 34, N 2, p. 302-305). Known to protect grapes from gray rot with Trichoderma viride T. haezianum in order to improve the quality of the crop (Dubos B., Ulit J., Bugaret Y., Verdu D. - L'academie d'agriculture de France, 1978, 64, N 14 , p. 1159-1167; Dubos B. - Proc. Int. Cont. Integr. Plant Prot., Budapest, 1983., p. 41-47; Dubos B. in.: Current perspectives in microbial ecology. Washington, 1984, p. 370-373; Dubos B., Bulit J. - Microbial ecology of the phylloplane. London est, 1981, p. 353-367; Davet P. - Bull. OEPP, 1987, 17, No. 14, p. 535- 540; Nair NG, Parker FE - Plant Pathol., 1985, 34, N 2, p. 302-305).

Разработка биологического метода борьбы с патогенами винограда в условиях хранения имеет ряд трудностей. Антагонисты должны быть способны развиваться при низких температурах в хранилищах, сохраняться определенное время на поверхности ягод (Cook R. J. -"Phytopathology", 1985, 75, N 1, p. 25-29; Wilson C. L. , Pusey P. L. - Plant Diseases, 1985, 69, N 5, 375-378). The development of a biological method for controlling grape pathogens under storage conditions has a number of difficulties. Antagonists must be able to develop at low temperatures in storages, remain for some time on the surface of berries (Cook RJ - "Phytopathology", 1985, 75, N 1, p. 25-29; Wilson CL, Pusey PL - Plant Diseases, 1985, 69 N 5, 375-378).

Из известных штаммов грибов рода Trichoderma, используемых как средство биологической борьбы против патогенных грибов, являются штаммы Trichoderma harzianum Rifai T-315 (АТСС N 20671) Trichoderma harzianum Rifai T-35 (АТСС N 20681), описанные в европатенте N 01333878. Of the known strains of fungi of the genus Trichoderma used as a biological control agent against pathogenic fungi, there are Trichoderma harzianum Rifai T-315 (ATCC N 20671) Trichoderma harzianum Rifai T-35 (ATCC N 20681) strains described in Europatent N 01333878.

Данные штаммы используются против грибов рода Pythium, Rhizoctonia, Sclerotium, Fusarium для борьбы с такими заболеваниями, как черная ножка, корневая гниль, пелликуляриоз и шейковая гниль рассадных культур. These strains are used against fungi of the genus Pythium, Rhizoctonia, Sclerotium, Fusarium to combat diseases such as blackleg, root rot, peliculariosis, and neck rot of seedlings.

Однако виды или штаммы Trichoderma могут быть по-разному антагонистичны к разным видам грибов (H. D. Wells et al. , 1972, Phytopathology, 62, p. 442-447). However, Trichoderma species or strains may be differently antagonistic to different fungal species (H. D. Wells et al., 1972, Phytopathology, 62, p. 442-447).

В дополнение к таким различиям в антагонизме было обнаружено, что внешние условия, в которых происходит взаимодействие, также влияют на степень биологической борьбы. In addition to such differences in antagonism, it was found that the external conditions in which the interaction occurs also affect the degree of biological control.

Заявленный штамм Trichoderma harzianum Rifai 86 BKM F-3272 D предлагается как средство биологической борьбы с патогенами винограда в условиях хранения, в частности к Botrytis cinerea. The claimed strain of Trichoderma harzianum Rifai 86 BKM F-3272 D is proposed as a means of biological control of pathogens of grapes in storage conditions, in particular to Botrytis cinerea.

В качестве прототипа взят стандартный препарат Триходермин. Его эффективность проявляется при использовании на ягодных культурах в период цветения при борьбе с серой гнилью. As a prototype taken the standard drug Trichodermin. Its effectiveness is manifested when used on berry crops during flowering in the fight against gray rot.

Недостатком известного препарата является то, что он недостаточно эффективно воздействует на серую гниль винограда. A disadvantage of the known drug is that it does not effectively affect the gray rot of grapes.

Целью изобретения является выделение штамма триходермы, обладающего повышенной антагонистической активностью по отношению к возбудителю серой гнили винограда Botrytis cinerea и способностью сдерживать развитие патогена в период вегетации и хранения винограда, позволяющей уменьшить потери винограда от гниения путем уничтожения спор грибов на поверхности ягод перед их закладкой на хранение и подавления спороношения в процессе хранения. The aim of the invention is the isolation of a strain of trichoderma with increased antagonistic activity against the causative agent of gray rot of Botrytis cinerea grapes and the ability to inhibit the development of the pathogen during the growing season and storage of grapes, which can reduce the loss of grapes from rotting by destroying the spores of the mushrooms on the surface of the berries before they are stored and suppression of sporulation during storage.

Штамм микромицета Trihoderma harzianum Rifai 86 BKM F-3272 D выделен при посеве водной суспензии смыва с поверхности ягод винограда сорта Мускат гамбургский на агаризованную среду Чапека, подкисленную молочной кислотой до рН 4-4,5. Отбор штамма проводили при последовательных и многократных посевах на указанную среду. Зрелая культура на агаровых косяках хранится в холодильнике при -2. . . +3^оС с периодическими пересевами 2-3 раза в течение года. Штамм хорошо растет и спороносит на средах Чапека и сусло-агаре при 22-25^оС.The strain of micromycete Trihoderma harzianum Rifai 86 BKM F-3272 D was isolated by sowing an aqueous suspension of flushing from the surface of the berries of the Muscat Hamburg grapes on agarized Chapek's medium acidified with lactic acid to pH 4-4.5. The selection of the strain was carried out in sequential and multiple crops on the specified environment. Mature culture on agar jambs is stored in the refrigerator at -2. . . +3 ^о С with periodic reseeding 2-3 times during the year. The strain grows well on Czapek sporonosit environments and wort agar at 22-25 ^° C

Полученный штамм обладает следующими свойствами:
Макроморфология. Колонии на среде Чапека быстрорастущие, на 14-е сутки роста при 22^оС занимают всю поверхность чашки Петри, с белыми, желтыми, зелеными густыми дерновинками. Интенсивное темно-зеленое спороношение, обратная сторона колоний бесцветная. На сусло-агаре концентрические круги интенсивного зеленого спороношения.The resulting strain has the following properties:
Macromorphology. Colonies on Czapek fast-growing, on the 14th day of growth at 22 ^{° C} occupy the entire surface of a Petri dish, with white, yellow, green dense tufts. Intense dark green sporulation, the reverse side of the colonies is colorless. On wort agar, concentric circles of intense green sporulation.

Микроморфология. Конидии полушаровидные, часть конидий овальные, усеченным основанием, 4,5-5,0х4,2-4,4 мкм, с гладкими стенками. Micromorphology. The conidia are hemispherical, part of the conidia are oval, with a truncated base, 4.5-5.0x4.2-4.4 microns, with smooth walls.

Активность штамма. Штамм N 86 является активным антагонистом по отношению к возбудителю серой гнили винограда Botrytis cinerea. Обладает способностью удерживать развитие патогена в период вегетации и хранения винограда. Проявляет активность при 22-25^оС.Strain activity. Strain N 86 is an active antagonist against the causative agent of gray rot of Botrytis cinerea grapes. It has the ability to retain the development of the pathogen during the growing season and storage of grapes. Exhibits activity at 22-25 ° ^C.

Способ определения активности штамма. A method for determining the activity of a strain.

Лабораторные испытания проведены с использованием метода агаровых блоков (СЭГИ, 1983) при 2^оС и 22-25^оС.Laboratory tests conducted using the method of agar blocks (SEGI, 1983) at 2 ^{° C} and 22-25 ° ^C

Метод основан на способности растворимых метаболитов диффундировать в агаровую пластинку и в зависимости от интенсивности воздействия образовывать более или менее широкие зоны угнетения или стимулирования патогена. The method is based on the ability of soluble metabolites to diffuse into the agar plate and, depending on the intensity of exposure, form more or less wide zones of inhibition or stimulation of the pathogen.

В лабораторных условиях культуру Trichoderma harzianum Rifai BKM F-3272 D выращивают на косяках сусло-агара и среда Чапека в течение 12-14 сут при 22-25^оС, которую в дальнейшем используют в качестве посевного материала.In vitro culture of Trichoderma harzianum Rifai BKM F-3272 D grown on the doorposts wort agar and Czapek medium for 12-14 days at 22-25 ^{° C,} which is subsequently used as seed material.

Пример получения препарата с помощью штамма гриба Trichoderma harzianum Rifai 86 BKM F-3272 D. An example of obtaining the drug using a strain of the fungus Trichoderma harzianum Rifai 86 BKM F-3272 D.

Для приготовления водной суспензии препарата в пробирку с маточной культурой штамма N 86 наливают 10 мл стерильной дистиллированной воды, затем микробиологической иглой осуществляют смыв спороносящего слоя с поверхности питательной среды; пробирку тщательно встряхивают. Предварительно подготавливают пластиковые кюветы размером 0,31х0,25 м, залитые стерильной питательной средой - сусло-агар (из расчета 0,5 л среды на одну кювету), и накрывают их плотно прилегающими простерилизованным стеклом. Водную суспензию маточной культуры вносят в кюветы (из расчета 20 мл суспензии на кювету) и стерильным стеклянным шпателем растирают по всей поверхности питательной среды. To prepare an aqueous suspension of the drug, 10 ml of sterile distilled water is poured into a test tube with a uterine culture of strain N 86, then the spore-layer is washed off with a microbiological needle from the surface of the nutrient medium; shake the tube thoroughly. Plastic cuvettes 0.31 x 0.25 m in size, filled with sterile nutrient medium — wort agar (at the rate of 0.5 l of medium per cuvette) are preliminarily prepared, and covered with tightly fitting sterilized glass. An aqueous suspension of the uterine culture is introduced into the cuvettes (at the rate of 20 ml of suspension per cuvette) and rubbed with a sterile glass spatula over the entire surface of the nutrient medium.

Культуру штамма N 86 выращивают при комнатной температуре в течение 12-14 сут. По истечении этого срока проводят смыв; кюветы освобождают от стекол и заливают небольшим количеством стерильной дистиллированной воды; затем стерильным шпателем тщательно смывают выросшую культуру с поверхности питательной среды. Водную суспензию гриба фильтруют через двойной слой стерильной марли. В полученном маточном растворе препарата определяют титр спор. Подсчет проводят в камере Горяева. Готовый продукт представляет собой жидкость темно-зеленого цвета. The culture of strain N 86 was grown at room temperature for 12-14 days. After this period, flush; cuvettes are freed from glasses and filled with a small amount of sterile distilled water; then, with a sterile spatula, thoroughly wash the grown culture from the surface of the nutrient medium. The aqueous suspension of the fungus is filtered through a double layer of sterile gauze. In the resulting mother liquor of the drug, the spore titer is determined. The calculation is carried out in the camera Goryaeva. The finished product is a dark green liquid.

Полевые испытания проводили в Молдове на винограде сортов Молдова, Мускат гамбургский и Италия. Field trials were carried out in Moldova on grapes from Moldova, Muscat, Hamburg and Italy.

Пример конкретного выполнения. Столовые сорта винограда (Молдова, Мускат гамбургский, Италия) в период цветения и гриба Trichoderma harzianum Rifai 86 BKM F-3272 D в концентрации 10⁸ спор/мл при расходе раствора 1000 л/га.An example of a specific implementation. Table grape varieties (Moldova, Muscat of Hamburg, Italy) during flowering and the fungus Trichoderma harzianum Rifai 86 BKM F-3272 D at a concentration of 10 ⁸ spores / ml at a flow rate of 1000 l / ha.

Результаты испытания приведены в табл. 2 и 3. The test results are shown in table. 2 and 3.

Данные таблиц свидетельствуют о том, что обработка винограда водной суспензией штамма Trichoderma harzianum Rifai 86 BKM F-3272 D позволяет снизить потери от гниения во время хранения на 9-11% и повысить выход пригодного для хранения винограда на 9-12% в зависимости от сорта. The data of the tables indicate that the processing of grapes with an aqueous suspension of the strain Trichoderma harzianum Rifai 86 BKM F-3272 D can reduce rot losses during storage by 9-11% and increase the yield of grapes suitable for storage by 9-12%, depending on the variety .

Использование штамма микромицета (N 86) Trichoderma harzianum, Rifai ВКМ F-3272 D в качестве биологического препарата для борьбы с Botrytis cinerea снижает количество химических обработок винограда, а также уменьшает их вредное побочное действие. Достоинство применения данного штамма в том, что он оказывает также ингибирующее воздействие на вид Penecillium expansum и не образуется устойчивых штаммов Botrytis как это происходит при применении фунгицидов. (56) Сельское хозяйство Молдавии, 1985, 7, 57 (прототип). The use of a strain of micromycete (N 86) Trichoderma harzianum, Rifai VKM F-3272 D as a biological preparation for controlling Botrytis cinerea reduces the number of chemical treatments of grapes and also reduces their harmful side effects. The advantage of the use of this strain is that it also has an inhibitory effect on the species Penecillium expansum and resistant strains of Botrytis are not formed as occurs with the use of fungicides. (56) Agriculture of Moldova, 1985, 7, 57 (prototype).

Claims

The strain of micromycete Trichoderma harzianum Rifai VKM F - 3270 D to obtain the drug against the causative agent of gray rot of grapes.