Claims (60)
1. Способ получения по меньшей мере одного варианта белка с улучшенной эффективностью в сравнении с исходным белком, предусматривающий модификацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях в указанном исходном белке для получения по меньшей мере одного варианта белка, имеющего более положительный, более отрицательный, менее положительный или менее отрицательный заряд в сравнении с исходным белком.1. A method of obtaining at least one variant of a protein with improved efficiency compared to the original protein, comprising modifying at least one amino acid residue in one or more positions in the specified source protein to obtain at least one variant of the protein having a more positive, more negative, less positive or less negative charge compared to the original protein.
2. Способ по п.1, где указанная модификация включает замену, добавление и/или делецию.2. The method according to claim 1, where the specified modification includes the replacement, addition and / or deletion.
3. Способ по п.1, где указанная модификация включает химическую модификацию.3. The method according to claim 1, where the specified modification includes a chemical modification.
4. Способ по п.1, где указанным белком является фермент.4. The method according to claim 1, where the specified protein is an enzyme.
5. Способ по п.4, где указанный фермент является протеазой, амилазой, целлюлазой, полиэстеразой, эстеразой, липазой, кутиназой, пектиназой, оксидазой, трансферазой, алкалазой или каталазой.5. The method according to claim 4, where the specified enzyme is a protease, amylase, cellulase, polyesterase, esterase, lipase, kutinase, pectinase, oxidase, transferase, alkalase or catalase.
6. Способ по п.5, где указанная протеаза является сериновой протеазой или нейтральной металлопротеазой.6. The method according to claim 5, where the specified protease is a serine protease or a neutral metalloprotease.
7. Способ по п.1, где эффективность указанного по меньшей мере одного варианта белка оценивают с использованием по меньшей мере одного представляющего интерес теста.7. The method according to claim 1, where the effectiveness of the specified at least one variant of the protein is evaluated using at least one test of interest.
8. Способ по п.7, где указанный по меньшей мере один представляющий интерес тест предусматривает измерение связывания субстрата, ингибирования фермента, уровней экспрессии, стабильности в детергенте, термостабильности, скорости реакции, степени реакции, термальной активности, разжижения крахмала, гидролиза сложных эфиров, ферментативного отбеливания, моющей эффективности, деградации биомассы, растворимости, стабильности к хелаторам и/или осахаривания.8. The method of claim 7, wherein said at least one test of interest comprises measuring substrate binding, enzyme inhibition, expression levels, detergent stability, thermal stability, reaction rate, reaction rate, thermal activity, starch thinning, hydrolysis of esters, enzymatic whitening, washing efficiency, biomass degradation, solubility, chelator stability and / or saccharification.
9. Способ по п.8, где указанный по меньшей мере один вариант белка проявляет улучшенную эффективность по меньшей мере в одном указанном представляющем интерес тесте в сравнении с указанным исходным белком.9. The method of claim 8, where the specified at least one variant of the protein exhibits improved efficiency in at least one specified test of interest in comparison with the specified source protein.
10. Способ получения по меньшей мере одного варианта фермента с улучшенной моющей эффективностью в сравнении с исходным ферментом, предусматривающий модификацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях в указанном исходном ферменте для получения указанного по меньшей мере одного варианта фермента, имеющего более положительный, более отрицательный, менее положительный или менее отрицательный заряд в сравнении с исходным ферментом.10. A method of obtaining at least one variant of the enzyme with improved washing efficiency compared to the original enzyme, comprising modifying at least one amino acid residue in one or more positions in the specified source enzyme to obtain the specified at least one variant of the enzyme having a more positive , more negative, less positive or less negative charge in comparison with the original enzyme.
11. Способ по п.10, где указанная модификация включает замену, добавление и/или делецию.11. The method of claim 10, where the specified modification includes the replacement, addition and / or deletion.
12. Способ по п.10, где указанная модификация включает химическую модификацию.12. The method of claim 10, wherein said modification comprises a chemical modification.
13. Способ по п.10, дополнительно предусматривающий: тестирование моющей эффективности указанного варианта фермента и указанного исходного фермента для получения показателей эффективности для указанных вариантов фермента и указанного исходного фермента.13. The method according to claim 10, further comprising: testing the washing efficiency of the indicated variant of the enzyme and the specified starting enzyme to obtain performance indicators for the indicated variants of the enzyme and the specified starting enzyme.
14. Способ по п.13, где указанный показатель эффективности указанного варианта фермента имеет величину, большую, чем 1,0, а моющая эффективность исходного фермента имеет показатель эффективности 1,0.14. The method according to item 13, where the specified indicator of the effectiveness of the specified variant of the enzyme has a value greater than 1.0, and the washing efficiency of the original enzyme has an efficiency indicator of 1.0.
15. Способ по п.10, дополнительно предусматривающий: получение вариантного фермента, имеющего улучшенную моющую эффективность.15. The method according to claim 10, further comprising: obtaining a variant enzyme having improved washing efficiency.
16. Способ по п.10, где указанный фермент является протеазой, амилазой, целлюлазой, полиэстеразой, эстеразой, липазой, кутиназой, пектиназой, оксидазой, трансферазой, алкалазой или каталазой.16. The method of claim 10, wherein said enzyme is a protease, amylase, cellulase, polyesterase, esterase, lipase, kutinase, pectinase, oxidase, transferase, alkalase or catalase.
17. Способ по п.16, где указанная протеаза является сериновой протеазой или нейтральной металлопротеазой.17. The method according to clause 16, where the specified protease is a serine protease or a neutral metalloprotease.
18. Способ по п.17, где указанная протеаза является протеазой Bacillus.18. The method of claim 17, wherein said protease is a Bacillus protease.
19. Способ по п.13, где указанную моющую эффективность тестируют в порошкообразной или жидкой детергентной композиции, имеющей рН между 5 и 12,0.19. The method according to item 13, where the specified washing efficiency is tested in a powder or liquid detergent composition having a pH between 5 and 12.0.
20. Способ по п.13, где указанную моющую эффективность тестируют в жидком детергенте для стирки, имеющем основный рН.20. The method according to item 13, where the specified washing effectiveness is tested in a liquid detergent for washing, having a basic pH.
21. Способ по п.13, где указанную моющую эффективность тестируют в жидком детергенте для холодной воды, имеющем основный рН.21. The method according to item 13, where the specified washing effectiveness is tested in a liquid detergent for cold water having a basic pH.
22. Способ по п.10, где замены находятся в положениях в указанном исходном ферменте, имеющих доступную для растворителя поверхность (SAS), большую, чем 25%.22. The method according to claim 10, where the substitutions are in positions in the specified source enzyme having a solvent accessible surface (SAS) greater than 25%.
23. Способ по п.10, где замены находятся в положениях в исходном ферменте, имеющих доступную для растворителя поверхность (SAS), большую, чем приблизительно 50%, или большую, чем приблизительно 65%.23. The method of claim 10, where the substitutions are at positions in the starting enzyme having a solvent accessible surface (SAS) greater than about 50%, or greater than about 65%.
24. Способ получения вариантов фермента с улучшенной моющей эффективностью в сравнении с исходным ферментом, предусматривающий:24. A method of obtaining variants of the enzyme with improved washing efficiency in comparison with the original enzyme, comprising:
а) модификацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях в исходном ферменте для получения первого варианта фермента, имеющего более положительный, более отрицательный, менее положительный или менее отрицательный заряд в сравнении с исходным ферментом; иa) modifying at least one amino acid residue at one or more positions in the starting enzyme to obtain a first variant of the enzyme having a more positive, more negative, less positive or less negative charge compared to the starting enzyme; and
b) модификацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях в исходном ферменте для получения второго варианта фермента, имеющего более положительный, более отрицательный, менее положительный или менее отрицательный заряд в сравнении с исходным ферментом.b) modifying at least one amino acid residue at one or more positions in the starting enzyme to obtain a second variant of the enzyme having a more positive, more negative, less positive or less negative charge compared to the starting enzyme.
25. Способ по п.24, где указанная модификация включает замену, добавление и/или делецию.25. The method according to paragraph 24, where the specified modification includes the replacement, addition and / or deletion.
26. Способ по п.24, где указанная модификация включает химическую модификацию.26. The method according to paragraph 24, where the specified modification includes a chemical modification.
27. Способ по п.24, где указанные стадии повторяют для получения множества вариантов фермента.27. The method according to paragraph 24, where these steps are repeated to obtain many variants of the enzyme.
28. Способ по п.24, где указанный исходный фермент является протеазой, амилазой, целлюлазой, полиэстеразой, эстеразой, липазой, кутиназой, пектиназой, оксидазой, трансферазой, алкалазой или каталазой.28. The method according to paragraph 24, where the specified starting enzyme is a protease, amylase, cellulase, polyesterase, esterase, lipase, kutinase, pectinase, oxidase, transferase, alkalase or catalase.
29. Способ по п.28, где указанная протеаза является нейтральной металлопротеазой или сериновой протеазой.29. The method of claim 28, wherein said protease is a neutral metalloprotease or serine protease.
30. Способ по п.24, где указанным исходным ферментом является протеаза Bacillus.30. The method according to paragraph 24, where the specified source enzyme is a Bacillus protease.
31. Способ по п.24, дополнительно предусматривающий: тестирование моющей эффективности вариантных ферментов и исходного фермента и сравнение способности указанного исходного фермента и указанных вариантных ферментов удалять пятно в указанном тесте моющей эффективности, причем моющая эффективность указанного исходного фермента принимается за величину 1,0, а вариантный фермент с улучшенной моющей эффективностью достигает величины, большей, чем 1,0.31. The method according to paragraph 24, further comprising: testing the washing efficiency of the variant enzymes and the starting enzyme and comparing the ability of the specified starting enzyme and these variant enzymes to remove a stain in the indicated washing efficiency test, the washing efficiency of the specified starting enzyme being taken as 1.0 and the variant enzyme with improved washing efficiency reaches a value greater than 1.0.
32. Способ по п.31, дополнительно предусматривающий получение вариантного фермента, имеющего улучшенную моющую эффективность в сравнении с исходным ферментом.32. The method according to p. 31, further comprising obtaining a variant enzyme having improved detergent efficiency compared with the original enzyme.
33. Способ по п.32, где указанным исходным ферментом является сериновая протеаза.33. The method according to p, where the specified source enzyme is a serine protease.
34. Способ по п.33, где указанной сериновой протеазой является сериновая протеаза Bacillus или сериновая протеаза Cellulomonas.34. The method of claim 33, wherein said serine protease is Bacillus serine protease or Cellulomonas serine protease.
35. Способ по п.31, где указанную моющую эффективность тестируют в порошкообразной или жидкой детергентной композиции, имеющей рН между 5 и 12,0.35. The method according to p, where the specified detergency is tested in a powder or liquid detergent composition having a pH between 5 and 12.0.
36. Способ по п.31, где указанную моющую эффективность тестируют в жидком детергенте для стирки, имеющем основный рН.36. The method according to p, where the specified washing efficiency is tested in a liquid detergent for washing, having a basic pH.
37. Способ по п.31, где указанную моющую эффективность тестируют в жидком детергенте для холодной воды, имеющем основный рН.37. The method according to p, where the specified washing effectiveness is tested in a liquid detergent for cold water having a basic pH.
38. Способ по п.25, где указанные замены находятся в положениях в указанном исходном ферменте, имеющих доступную для растворителя поверхность (SAS), большую, чем приблизительно 25%.38. The method according A.25, where these substitutions are in positions in the specified source enzyme having an accessible surface for the solvent (SAS), greater than about 25%.
39. Способ по п.38, где указанные замены находятся в положениях в исходном ферменте, имеющих доступную для растворителя поверхность (SAS), большую, чем приблизительно 50%, или большую, чем приблизительно 65%.39. The method of claim 38, wherein said substitutions are at positions in the parent enzyme having a solvent accessible surface (SAS) greater than about 50%, or greater than about 65%.
40. Способ по п.25, где по меньшей мере один кислый аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним основным аминокислотным остатком.40. The method according A.25, where at least one acidic amino acid residue is replaced by at least one basic amino acid residue.
41. Способ по п.25, где по меньшей мере один кислый аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним нейтральным аминокислотным остатком.41. The method according A.25, where at least one acidic amino acid residue is replaced by at least one neutral amino acid residue.
42. Способ по п.25, где по меньшей мере один нейтральный аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним основным аминокислотным остатком.42. The method according A.25, where at least one neutral amino acid residue is replaced by at least one basic amino acid residue.
43. Способ по п.25, где по меньшей мере один основный аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним кислым аминокислотным остатком.43. The method according A.25, where at least one basic amino acid residue is replaced by at least one acidic amino acid residue.
44. Способ по п.25, где по меньшей мере один основный аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним нейтральным аминокислотным остатком.44. The method according A.25, where at least one basic amino acid residue is replaced by at least one neutral amino acid residue.
45. Способ по п.25, где по меньшей мере один нейтральный аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним кислым аминокислотным остатком.45. The method according A.25, where at least one neutral amino acid residue is replaced by at least one acidic amino acid residue.
46. Способ по п.25, где по меньшей мере один нейтральный аминокислотный остаток в указанном исходном ферменте заменен по меньшей мере одним нейтральным аминокислотным остатком с получением варианта фермента, имеющего один и тот же заряд в сравнении с исходным ферментом.46. The method according A.25, where at least one neutral amino acid residue in the specified source enzyme is replaced by at least one neutral amino acid residue to obtain a variant of the enzyme having the same charge in comparison with the original enzyme.
47. Способ получения по меньшей мере одного варианта белка с улучшенной эффективностью в сравнении с исходным белком, предусматривающий модификацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях в указанном исходном белке для получения по меньшей мере одного варианта белка, имеющего более положительный, более отрицательный, менее положительный или менее отрицательный заряд в сравнении с указанным исходным белком, причем указанные одно или несколько положений имеют доступную для растворителя поверхность (SAS), большую, чем приблизительно 25%.47. A method of obtaining at least one variant of a protein with improved efficiency compared to the original protein, comprising modifying at least one amino acid residue in one or more positions in the specified source protein to obtain at least one variant of the protein having a more positive, more negative, less positive or less negative charge in comparison with the specified source protein, wherein said one or more positions have a surface accessible to the solvent five (SAS), greater than about 25%.
48. Способ по п.47, где указанные одно или несколько положений не являются консервативными в выравниваниях аминокислот гомологичных белковых последовательностей, содержащих указанный исходный белок и по меньшей мере один дополнительный белок.48. The method according to clause 47, where the specified one or more positions are not conservative in the alignment of amino acids of homologous protein sequences containing the specified source protein and at least one additional protein.
49. Способ по п.47, где указанный исходный белок является ферментом.49. The method according to clause 47, where the specified source protein is an enzyme.
50. Способ по п.49, где указанный фермент является протеазой, амилазой, целлюлазой, полиэстеразой, эстеразой, липазой, кутиназой, пектиназой, оксидазой, трансферазой, алкалазой или каталазой.50. The method of claim 49, wherein said enzyme is a protease, amylase, cellulase, polyesterase, esterase, lipase, kutinase, pectinase, oxidase, transferase, alkalase or catalase.
51. Способ по п.47, где указанная улучшенная эффективность включает увеличение одного или нескольких свойств, выбранных из связывания субстрата, ингибирования фермента, экспрессии, стабильности в детергенте, термостабильности, скорости реакции, степени реакции, термальной активности, разжижения крахмала, деградации биомассы, осахаривания, гидролиза сложных эфиров, ферментативного отбеливания, моющей эффективности, растворимости, стабильности к хелаторам и/или модификации текстиля.51. The method according to clause 47, where the specified improved efficiency includes increasing one or more properties selected from binding of the substrate, inhibition of the enzyme, expression, stability in the detergent, thermal stability, reaction rate, degree of reaction, thermal activity, liquefaction of starch, degradation of biomass, saccharification, hydrolysis of esters, enzymatic whitening, washing efficiency, solubility, stability to chelators and / or textile modifications.
52. Способ по п.47, где указанная модификация включает замену, добавление и/или делецию.52. The method according to clause 47, where the specified modification includes the replacement, addition and / or deletion.
53. Способ по п.47, где указанная модификация включает химическую модификацию.53. The method according to clause 47, where the specified modification includes a chemical modification.
54. Способ по п.52, где указанная по меньшей мере одна замена включает изменение суммарного заряда 0, -1 или -2 относительно исходного белка.54. The method according to paragraph 52, where the specified at least one substitution includes a change in the total charge of 0, -1 or -2 relative to the source protein.
55. Способ по п.52, где указанная по меньшей мере одна замена включает изменение суммарного заряда +1 или +2 относительно исходного белка.55. The method according to paragraph 52, where the specified at least one substitution includes changing the total charge +1 or +2 relative to the source protein.
56. Способ по п.52, где по меньшей мере одна из указанных замен в указанном исходном белке включает изменение суммарного заряда 0, -1 или -2, причем по меньшей мере одна дополнительная замена в указанном исходном белке включает изменение заряда +1 или +2 относительно указанного исходного белка.56. The method according to paragraph 52, where at least one of these substitutions in the specified source protein includes a change in the total charge of 0, -1 or -2, and at least one additional substitution in the specified source protein includes a change in charge of +1 or + 2 relative to the specified source protein.
57. Способ по п.52, где указанный вариант белка имеет изменение суммарного заряда +1 или +2 относительно исходного белка.57. The method according to paragraph 52, where the specified variant of the protein has a change in the total charge of +1 or +2 relative to the source protein.
58. Способ по п.52, где указанный вариант белка имеет изменение суммарного заряда 0, -1 или -2 относительно исходного белка.58. The method according to paragraph 52, where the specified variant of the protein has a change in the total charge of 0, -1 or -2 relative to the source protein.
59. Способ по п.52, где указанные замены находятся в положениях в исходном ферменте, имеющих доступную для растворителя поверхность (SAS), большую, чем приблизительно 50%.59. The method of claim 52, wherein said substitutions are in positions in the parent enzyme having a solvent accessible surface (SAS) greater than about 50%.
60. Способ по п.52, где замены находятся в положениях в исходном ферменте, имеющих доступную для растворителя поверхность (SAS), большую, чем приблизительно 65%.
60. The method according to paragraph 52, where the substitutions are in positions in the starting enzyme having a solvent accessible surface (SAS) greater than about 65%.