Claims (48)
1. Мутантная алкогольдегидрогеназа, устойчивая к аэробной инактивации, выбранная из группы, состоящей из1. Mutant alcohol dehydrogenase resistant to aerobic inactivation, selected from the group consisting of
А) белка, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, исключая белок, содержащий мутацию в позиции 568 в SEQ ID NO:2, и содержащего, по крайней мере, одну дополнительную мутацию, улучшающую рост бактерии в жидкой среде, содержащей этанол в качестве единственного источника углерода, отличающийся тем, что указанная дополнительная мутация находится в позиции, отличной от позиции 267 в SEQ ID NO:2; иA) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, excluding a protein containing a mutation at position 568 in SEQ ID NO: 2, and containing at least one additional mutation that improves bacterial growth in a liquid medium containing ethanol as a single carbon source, characterized in that said additional mutation is in a position other than position 267 in SEQ ID NO: 2; and
Б) варианта белка А, обладающего активностью алкогольдегидрогеназы.B) a variant of protein A having alcohol dehydrogenase activity.
2. Мутантная алкогольдегидрогеназа по п.1 отличающаяся тем, что указанная дополнительная мутация выбрана из группы, состоящей из2. The mutant alcohol dehydrogenase according to claim 1, characterized in that said additional mutation is selected from the group consisting of
A) замены остатка глутаминовой кислоты в позиции 560 в SEQ ID NO:2 на остаток другой аминокислоты;A) replacing the glutamic acid residue at position 560 in SEQ ID NO: 2 with another amino acid residue;
Б) замены остатка фенилаланина в позиции 566 в SEQ ID NO:2 на остаток другой аминокислоты;B) replacing the phenylalanine residue at position 566 in SEQ ID NO: 2 with a residue of another amino acid;
B) замены остатка глутаминовой кислоты, остатка метионина, остатка изолейцина и остатка аланина в позиции 22, 236, 554 и 786, соответственно, в SEQ ID NO:2 на остатки другой аминокислоты; иB) replacing the glutamic acid residue, methionine residue, isoleucine residue and alanine residue at positions 22, 236, 554 and 786, respectively, in SEQ ID NO: 2 with the residues of another amino acid; and
Г) комбинации этих замен.D) combinations of these substitutions.
3. Мутантная алкогольдегидрогеназа по п.1 отличающаяся тем, что указанная дополнительная мутация выбрана из группы, состоящей из3. The mutant alcohol dehydrogenase according to claim 1, characterized in that said additional mutation is selected from the group consisting of
A) замены остатка глутаминовой кислоты в позиции 560 в SEQ ID NO:2 на остаток L-лизина;A) replacing the glutamic acid residue at position 560 in SEQ ID NO: 2 with a L-lysine residue;
Б) замены остатка фенилаланина в позиции 566 в SEQ ID NO:2 на остаток L-валина;B) replacing the phenylalanine residue at position 566 in SEQ ID NO: 2 with an L-valine residue;
B) замены остатка глутаминовой кислоты, остатка метионина, остатка изолейцина и остатка аланина в позициях 22, 236, 554 и 786 в SEQ ID NO:2 на остаток глицина, валина, серина и валина, соответственно; иB) replacing the glutamic acid residue, methionine residue, isoleucine residue and alanine residue at positions 22, 236, 554 and 786 in SEQ ID NO: 2 with the glycine, valine, serine and valine residue, respectively; and
Г) комбинации этих замен.D) combinations of these substitutions.
4. Фрагмент ДНК, кодирующий мутантную алкогольдегидрогеназу по любому из пп.1-3.4. A DNA fragment encoding a mutant alcohol dehydrogenase according to any one of claims 1 to 3.
5. Бактерия-продуцент L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, содержащая мутантную алкогольдегидрогеназу по любому из пп.1-3.5. The bacterium producing L-amino acids of the Enterobacteriaceae family, containing the mutant alcohol dehydrogenase according to any one of claims 1 to 3.
6. Бактерия-продуцент L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, отличающаяся тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что активность мутантной алкогольдегидрогеназы по любому из пп.1-3 в этой бактерии увеличена.6. A bacterium producing L-amino acids of the Enterobacteriaceae family, characterized in that said bacterium is modified so that the activity of the mutant alcohol dehydrogenase according to any one of claims 1 to 3 in this bacterium is increased.
7. Бактерия по п.6, отличающаяся тем, что активность мутантной алкогольдегидрогеназы увеличена путем усиления экспрессии гена, кодирующего указанную мутантную алкогольдегидрогеназу.7. The bacterium according to claim 6, characterized in that the activity of the mutant alcohol dehydrogenase is increased by enhancing the expression of a gene encoding the indicated mutant alcohol dehydrogenase.
8. Бактерия по п.6, отличающаяся тем, что активность указанной мутантной алкогольдегидрогеназы увеличена путем модификации последовательности, контролирующей экспрессию гена, кодирующего указанную алкогольдегидрогеназу, или путем увеличения количества копий гена, кодирующего указанную алкогольдегидрогеназу.8. The bacterium according to claim 6, characterized in that the activity of the indicated mutant alcohol dehydrogenase is increased by modifying the sequence that controls the expression of the gene encoding the indicated alcohol dehydrogenase, or by increasing the number of copies of the gene encoding the indicated alcohol dehydrogenase.
9. Бактерия по п.5 или 6, отличающаяся тем, что указанная бактерия выбрана из группы, состоящей из Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, and Morganella.9. The bacterium according to claim 5 or 6, characterized in that said bacterium is selected from the group consisting of Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, and Morganella.
10. Бактерия по п.5 или 6, отличающаяся тем, что указанная бактерия является продуцентом L-треонина.10. The bacterium according to claim 5 or 6, characterized in that said bacterium is a producer of L-threonine.
11. Бактерия по п.10, отличающаяся тем, что указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что у этой бактерии усилена экспрессия гена, выбранного из группы, состоящей из11. The bacterium of claim 10, characterized in that the bacterium is further modified so that this bacterium has enhanced expression of a gene selected from the group consisting of
мутантного гена thrA, который кодирует аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;a mutant thrA gene that encodes aspartokinase homoserine dehydrogenase I resistant to threonine inhibition by feedback;
гена thrB, который кодирует гомосеринкиназу;a thrB gene that encodes homoserine kinase;
гена thrC, который кодирует треонинсинтазу;a thrC gene that encodes threonine synthase;
гена rhtA, который кодирует предпологаемый трансмембранный белок;the rhtA gene, which encodes the expected transmembrane protein;
гена asd, который кодирует аспартат-β-семиальдегиддегидрогеназу;an asd gene that encodes aspartate β-semialdehyde dehydrogenase;
гена aspC, который кодирует аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу); иan aspC gene that encodes aspartate aminotransferase (aspartate transaminase); and
комбинации этих генов.combinations of these genes.
12. Бактерия по п.11 отличающаяся тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия указанного мутантного гена thrA, указанного гена thrB, указанного гена thrC и указанного гена rhtA у этой бактерии усилена.12. The bacterium according to claim 11, wherein said bacterium is modified so that the expression of said mutant thrA gene, said thrB gene, said thrC gene, and said rhtA gene is enhanced in this bacterium.
13. Бактерия по п.5 или 6, отличающаяся тем, что указанная бактерия является продуцентом L-лизина.13. The bacterium according to claim 5 or 6, characterized in that said bacterium is a producer of L-lysine.
14. Бактерия по п.5 или 6, отличающаяся тем, что указанная бактерия является продуцентом L-гистидина.14. The bacterium according to claim 5 or 6, characterized in that said bacterium is a producer of L-histidine.
15. Бактерия по п.5 или 6, отличающаяся тем, что указанная бактерия является продуцентом L-фенилаланина.15. The bacterium according to claim 5 or 6, characterized in that said bacterium is a producer of L-phenylalanine.
16. Бактерия по п.5 или 6, отличающаяся тем, что указанная бактерия является продуцентом L-аргинина.16. The bacterium according to claim 5 or 6, characterized in that said bacterium is a producer of L-arginine.
17. Бактерия по п.5 или 6, отличающаяся тем, что указанная бактерия является продуцентом L-триптофана.17. The bacterium according to claim 5 or 6, characterized in that said bacterium is a producer of L-tryptophan.
18. Бактерия по п.5 или 6, отличающаяся тем, что указанная бактерия является продуцентом L-глутаминовой кислоты.18. The bacterium according to claim 5 or 6, characterized in that said bacterium is a producer of L-glutamic acid.
19. Способ получения L-аминокислоты, включающий19. The method of obtaining L-amino acids, including
А) выращивание бактерии семейства Enterobacteriaceae-продуцента L-аминокислоты, обладающей повышенной способностью усваивать этанол, в питательной среде, иA) growing bacteria of the Enterobacteriaceae family of the producer of the L-amino acid, which has an increased ability to assimilate ethanol, in a nutrient medium, and
Б) выделение L-аминокислоты из культуральной жидкости.B) the allocation of L-amino acids from the culture fluid.
20. Способ по п.19, отличающийся тем, что способность бактерии семейства Enterobacteriaceae усваивать этанол усилена путем введения мутации, придающей алкогольдегидрогеназе устойчивость к аэробной инактивации.20. The method according to claim 19, characterized in that the ability of the bacteria of the Enterobacteriaceae family to absorb ethanol is enhanced by introducing a mutation that confers resistance to aerobic inactivation to alcohol dehydrogenase.
21. Способ по п.20, отличающийся тем, что указанная мутантная алкогольдегидрогеназа содержит мутацию в позиции 568 в SEQ ID NO:2 и, по крайней мере, одну дополнительную мутацию, улучшающую рост бактерии в жидкой среде, содержащей этанол в качестве единственного источника углерода.21. The method according to claim 20, characterized in that the mutated alcohol dehydrogenase contains a mutation at position 568 in SEQ ID NO: 2 and at least one additional mutation that improves the growth of bacteria in a liquid medium containing ethanol as the sole carbon source .
22. Способ по п.21, отличающийся тем, что указанная дополнительная мутация выбрана из группы, состоящей из22. The method according to item 21, wherein the specified additional mutation is selected from the group consisting of
А) замены остатка глутаминовой кислоты в позиции 560 в SEQ ID NO:2 на остаток другой аминокислоты;A) replacing the glutamic acid residue at position 560 in SEQ ID NO: 2 with a residue of another amino acid;
Б) замены остатка фенилаланина в позиции 566 в SEQ ID NO:2 на остаток другой аминокислоты;B) replacing the phenylalanine residue at position 566 in SEQ ID NO: 2 with a residue of another amino acid;
В) замены остатка глутаминовой кислоты, остатка метионина, остатка изолейцина и остатка аланина в позициях 22, 236, 554 и 786, соответственно, в SEQ ID NO:2 на остаток другой аминокислоты.B) replacing the glutamic acid residue, methionine residue, isoleucine residue and alanine residue at positions 22, 236, 554 and 786, respectively, in SEQ ID NO: 2 with another amino acid residue.
23. Способ по п.21, отличающийся тем, что указанная дополнительная мутация выбрана из группы, состоящей из23. The method according to item 21, wherein the specified additional mutation is selected from the group consisting of
A) замены остатка глутаминовой кислоты в позиции 560 в SEQ ID NO:2 на остаток L-лизина;A) replacing the glutamic acid residue at position 560 in SEQ ID NO: 2 with a L-lysine residue;
Б) замены остатка фенилаланина в позиции 566 в SEQ ID NO:2 на остаток L-валина;B) replacing the phenylalanine residue at position 566 in SEQ ID NO: 2 with an L-valine residue;
B) замены остатка глутаминовой кислоты, остатка метионина, остатка изолейцина и остатка аланина в позициях 22, 236, 554 и 786 в SEQ ID NO:2 на остатки глицина, валина, серина и валина, соответственно.B) replacing the glutamic acid residue, methionine residue, isoleucine residue and alanine residue at positions 22, 236, 554 and 786 in SEQ ID NO: 2 with glycine, valine, serine and valine residues, respectively.
24. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что активность мутантной алкогольдегидрогеназы в этой бактерии увеличена.24. The method according to claim 19, characterized in that said bacterium is modified in such a way that the activity of mutant alcohol dehydrogenase in this bacterium is increased.
25. Способ по п.24, отличающийся тем, что указанная активность увеличена путем усиления экспрессии гена, кодирующего указанную мутантную алкогольдегидрогеназу.25. The method according to paragraph 24, wherein the specified activity is increased by enhancing the expression of a gene encoding the indicated mutant alcohol dehydrogenase.
26. Способ по п.24, отличающийся тем, что указанная активность увеличена путем модификации последовательности, контролирующей экспрессию гена, кодирующего указанную алкогольдегидрогеназу, или путем увеличения количества копий гена, кодирующего указанную алкогольдегидрогеназу.26. The method according to paragraph 24, wherein the specified activity is increased by modifying the sequence that controls the expression of the gene encoding the specified alcohol dehydrogenase, or by increasing the number of copies of the gene encoding the specified alcohol dehydrogenase.
27. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанная бактерия выбрана из группы, состоящей из Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, and Morganella.27. The method according to claim 19, wherein said bacterium is selected from the group consisting of Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, and Morganella.
28. Способ по п.20, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность указанной мутантной алкогольдегидрогеназы, по крайней мере, на 90% идентична последовательности SEQ ID NO:2.28. The method according to claim 20, characterized in that the amino acid sequence of the indicated mutant alcohol dehydrogenase is at least 90% identical to the sequence of SEQ ID NO: 2.
29. Способ по п.20, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность указанной мутантной алкогольдегидрогеназы, по крайней мере, на 95% идентична последовательности SEQ ID NO:2.29. The method according to claim 20, characterized in that the amino acid sequence of the indicated mutant alcohol dehydrogenase is at least 95% identical to the sequence of SEQ ID NO: 2.
30. Способ по п.20, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность указанной мутантной алкогольдегидрогеназы, по крайней мере, на 98% идентична последовательности SEQ ID NO:2.30. The method according to claim 20, characterized in that the amino acid sequence of the indicated mutant alcohol dehydrogenase is at least 98% identical to the sequence of SEQ ID NO: 2.
31. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанной L-аминокислотой является L-треонин.31. The method according to claim 19, characterized in that said L-amino acid is L-threonine.
32. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанной L-аминокислотой является L-лизин.32. The method according to claim 19, characterized in that said L-amino acid is L-lysine.
33. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанной L-аминокислотой является L-гистидин.33. The method according to claim 19, characterized in that said L-amino acid is L-histidine.
34. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанной L-аминокислотой является L-фенилаланин.34. The method according to claim 19, characterized in that said L-amino acid is L-phenylalanine.
35. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанной L-аминокислотой является L-аргинин.35. The method according to claim 19, characterized in that said L-amino acid is L-arginine.
36. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанной L-аминокислотой является L-триптофан.36. The method according to claim 19, characterized in that said L-amino acid is L-tryptophan.
37. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанной L-аминокислотой является L-глутаминовая кислота.37. The method according to claim 19, characterized in that said L-amino acid is L-glutamic acid.
38. Способ получения L-аминокислоты, включающий38. A method of obtaining an L-amino acid, comprising
А) выращивание бактерии-продуцента L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, содержащей алкогольдегидрогеназу, в питательной среде, содержащей этанол; иA) the cultivation of bacteria producing L-amino acids of the Enterobacteriaceae family containing alcohol dehydrogenase in a nutrient medium containing ethanol; and
Б) выделение L-аминокислоты из культуральной жидкости, отличающийся тем, что указанная алкогольдегидрогеназа экспрессируется под контролем промотора, функционирующего в условиях аэробного культивирования.B) the allocation of L-amino acids from the culture fluid, characterized in that the indicated alcohol dehydrogenase is expressed under the control of a promoter that functions under aerobic cultivation conditions.
39. Способ по п.38, отличающийся тем, что указанный промотор, функционирующий в условиях аэробного культивирования, выбран из группы, состоящей из промоторов Ptac, lac, trp, trc, PR, и PL.39. The method according to § 38, wherein said promoter, operating under aerobic cultivation conditions, is selected from the group consisting of promoters Ptac, lac, trp, trc, P R , and P L.
40. Способ по п.38, отличающийся тем, что указанная алкогольдегидрогеназа является мутантной алкогольдегидрогеназой, устойчивой к аэробной инактивации.40. The method according to § 38, wherein said alcohol dehydrogenase is a mutant alcohol dehydrogenase resistant to aerobic inactivation.
41. Способ по п.38, отличающийся тем, что указанная алкогольдегидрогеназа получена из штамма бактерии, выбранной из группы, состоящей из Escherichia coli, Erwinia carotovora, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Yersinia pestis, Pantoea ananatis, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis.41. The method according to § 38, wherein said alcohol dehydrogenase is obtained from a bacterial strain selected from the group consisting of Escherichia coli, Erwinia carotovora, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Yersinia pestis, Pantoea ananatis, Lactobacillus plantarum lactococactum.
42. Способ по п.38, отличающийся тем, что указанная алкогольдегидрогеназа включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, исключая алкогольдегидрогеназу, в которой остаток глутаминовой кислоты в позиции 568 заменен на остаток другой аминокислоты, иной, чем остаток аспарагиновой кислоты.42. The method according to § 38, wherein said alcohol dehydrogenase comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, excluding alcohol dehydrogenase, in which the glutamic acid residue at position 568 is replaced by a residue of a different amino acid other than the aspartic acid residue.
43. Способ по п.38, отличающийся тем, что указанная алкогольдегидрогеназа включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, исключая алькогольдегидрогеназу, в которой остаток глутаминовой кислоты в позиции 568 заменен на остаток лизина.43. The method according to § 38, wherein said alcohol dehydrogenase comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, excluding alcohol dehydrogenase, in which the glutamic acid residue at position 568 is replaced by a lysine residue.
44. Способ по п.42, отличающийся тем, что указанная алкогольдегидрогеназа содержит, по крайней мере, одну дополнительную мутацию, улучшающую рост указанной бактерии в жидкой среде, содержащей этанол в качестве единственного источника углерода.44. The method according to § 42, wherein said alcohol dehydrogenase contains at least one additional mutation that improves the growth of said bacterium in a liquid medium containing ethanol as the sole carbon source.
45. Способ по п.44, отличающийся тем, что указанная дополнительная мутация выбрана из группы, состоящей из45. The method according to item 44, wherein the specified additional mutation is selected from the group consisting of
A) замены остатка глутаминовой кислоты в позиции 560 в SEQ ID NO:2 на остаток другой аминокислоты;A) replacing the glutamic acid residue at position 560 in SEQ ID NO: 2 with another amino acid residue;
Б) замены остатка фенилаланина в позиции 566 в SEQ ID NO:2 на остаток другой аминокислоты;B) replacing the phenylalanine residue at position 566 in SEQ ID NO: 2 with a residue of another amino acid;
B) замены остатка глутаминовой кислоты, остатка метионина, остатка изолейцина и остатка аланина в позициях 22, 236, 554 и 786, соответственно, в SEQ ID NO:2 на остатки другой аминокислоты; иB) replacing the glutamic acid residue, methionine residue, isoleucine residue and alanine residue at positions 22, 236, 554 and 786, respectively, in SEQ ID NO: 2 with the residues of another amino acid; and
Г) комбинации этих замен.D) combinations of these substitutions.
46. Способ по п.44, отличающийся тем, что указанная дополнительная мутация выбрана из группы, состоящей из:46. The method according to item 44, wherein the specified additional mutation is selected from the group consisting of:
А) замены остатка глутаминовой кислоты в позиции 560 в SEQ ID NO:2 на остаток лизина;A) replacing the glutamic acid residue at position 560 in SEQ ID NO: 2 with a lysine residue;
Б) замены остатка фенилаланина в позиции 566 в SEQ ID NO:2 на остаток валина;B) replacing the phenylalanine residue at position 566 in SEQ ID NO: 2 with a valine residue;
В) замены остатка глутаминовой кислоты, остатка метионина, остатка изолейцина и остатка аланина в позициях 22, 236, 554 и 786 в SEQ ID NO:2 на остатки глицина, валина, серина и валина, соответственно; иC) replacing the glutamic acid residue, methionine residue, isoleucine residue and alanine residue at positions 22, 236, 554 and 786 in SEQ ID NO: 2 with glycine, valine, serine and valine residues, respectively; and
Г) комбинации этих замен.D) combinations of these substitutions.
47. Способ по п.38, отличающийся тем, что указанная бактерия-продуцент L-аминокислоты выбрана из группы, состоящей из Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, and Morganella.47. The method of claim 38, wherein said L-amino acid producing bacterium is selected from the group consisting of Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, and Morganella.
48. Способ по п.38, отличающийся тем, что указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-гистидина, L-фенилаланина, L-аргинина, L-триптофана и L-глутаминовой кислоты.48. The method according to § 38, wherein said L-amino acid is selected from the group consisting of L-threonine, L-lysine, L-histidine, L-phenylalanine, L-arginine, L-tryptophan and L-glutamic acid .