RU2006038C1 - Способ количественного определения гаптенов - Google Patents
Способ количественного определения гаптенов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2006038C1 RU2006038C1 SU4937595A RU2006038C1 RU 2006038 C1 RU2006038 C1 RU 2006038C1 SU 4937595 A SU4937595 A SU 4937595A RU 2006038 C1 RU2006038 C1 RU 2006038C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hapten
- haptens
- acoustic
- antibodies
- quantitative determination
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 17
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 9
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 9
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 8
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 8
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 4
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 4
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Использование: биотехнология, иммунология, функциональная диагностика. Сущность изобретения: количественное определение гаптенов с помощью конкурентного иммуноферментного анализа в акустической камере и регистрации изменения начальной скорости распространения акустических колебаний в реакционной среде. Нижний предел обнаружения гаптенов составляет 5×10-8M.
Description
Изобретение относится к иммунологии и может найти применение в биотехнологии и медицине при количественном определении гаптенов.
Известен способ количественного определения антигенов или гаптенов с помощью пьезоэлектрического датчика. Способ включает иммобилизацию соответствующих антител на поверхности пьезоэлектрического кристалла, инкубацию иммобилизованных антител с раствором исследуемого антигена или гаптена, возбуждение резонансной частоты в пьезоэлектрическом иммуносенсоре и регистрацию изменений данной резонансной частоты.
Недостатком этого способа является низкая точность анализа, обусловленная неопределенностью процесса иммобилизации антител на поверхности пьезоэлектрического кристалла. Другим недостатком способа является низкая чувствительность, в частности, для IgG нижний предел обнаружения составляет 1,5 ˙ 10-7 М.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ количественного определения гаптенов путем проведения конкурентного связывания антигаптеновых антител с исследуемым образцом и конъюгатом белок-гаптен в акустической камере и регистрации скорости распространения акустических колебаний в реакционной среде.
Недостатком известного способа является низкая точность и длительность анализа, за счет использования второй стадии реакции антиген-антитело, в ходе которой образуется нерастворимый преципитат. Эта стадия иммунохимической реакции не подчиняется строгой стехиометрии и на несколько порядков медленнее первой стадии, в ходе которой образуется только бимолекулярный комплекс антиген-антитело. Другим недостатком известного способа является низкая чувствительность определения гаптенов. Нижний предел обнаружения гаптенов составляет 5 ˙ 10-8 М.
Целью предложенного способа является повышение чувствительности и точности анализа.
Цель достигается тем, что в известном способе количественного определения гаптенов путем проведения конкурентного связывания антигаптеновых антител с исследуемым образцом и конъюгатом белок-гаптен в акустической камере и регистрации скорости распространения акустических колебаний в реакционной среде, согласно изобретению в качестве конъюгата белок-гаптен используют конъюгат фермент-гаптен, который подвергают предварительной инкубации с антителами к гаптену, в акустическую камеру дополнительно вводят соответствующий субстрат фермента, а количество гаптена определяют по изменению начальной скорости распространения акустических колебаний в реакционной среде.
Сравнительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что он отличается от известного тем, что конкурентное связывание антигаптеновых антител с гаптеном проводят в присутствии конъюгата фермент-гаптен и соответствующего субстрата этого фермента, что позволяет определять количество гаптена по изменению начальной скорости распространения акустических колебаний в реакционной среде и тем самым работать с компонентами иммунохимической реакции в концентрациях на несколько порядков меньших, чем требуется для образования и акустического проявления стадии преципитации, необходимой для осуществления способа-прототипа.
Определение количества гаптена в исследуемой среде проводят по калибровочной кривой, которую получают следующим образом. Раствор антигаптеновых антител заданной концентрации инкубируют несколько минут с конъюгатом фермент-гаптен. В две идентичные акустические камеры вносят раствор субстрата. Затем в одну из камер, выбранную в качестве рабочей, вносят исследуемую пробу. В другую камеру, выбранную в качестве опорной, вносят буферный раствор. После этого в обе камеры вносят смесь конъюгата фермент-гаптен с антигаптеновыми антителами, перемешивают, возбуждают в камере с исследуемой смесью стоячую акустическую волну, регистрируют скорость акустических колебаний в реакционной среде сразу после смешивания и через определенное время (длительность которого зависит от активности фермента) определяют разность полученных значений. Операции повторяют при использовании различных концентраций гаптена и строят калибровочную кривую.
П р и м е р 1. Для построения калибровочной кривой определения тестостерона смешивают раствор антител к тестостерону (концентрация IgG 50 мкг/мл) с конъюгатом α-амилаза - тестостерон в концентрации 0,5 мкг/мл и инкубируют 3 мин при 37оС в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4. В две идентичные акустические камеры вносят по 0,4 мл 1% раствора крахмала в 0,5 М фосфатном буфере, рН 6,5. Затем в одну из камер, выбранную в качестве рабочей, вносят 0,4 мл исследуемой пробы с тестостероном. В другую камеру, выбранную в качестве опорной, вносят 0,4 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 6,5. После этого в обе камеры вносят по 0,06 мл смеси конъюгата α -амилаза-тестостерон с антительной сывороткой к тестостерону и перемешивают магнитной мешалкой при 37оС. В камерах создают стоячую волну и регистрируют изменения собственной частоты резонатора в области 7,4 МГц. Учитывая, что изменения собственной частоты резонатора линейно связаны с изменениями скорости распространения акустических колебаний в исследуемой среде, рассчитывают разность скоростей акустических колебаний между первой и восьмой минутами реакции (ΔU8).
Операции повторяют при использовании различных концентраций тестостерона в диапазоне 4 ˙ 10-10-1,3 ˙ 10-8 М и строят калибровочную кривую.
Результаты представлены в табл. 1.
Неизвестную концентрацию тестостерона определяют, повторив процедуру с исследуемой пробой и далее сравнением результата с калибровочной кривой.
Как видно из таблицы, предел обнаружения тестостерона за восемь минут ферментативной реакции составляет 4 ˙ 10-10 М, а погрешность измерения контрольной пробы 1,8% .
П р и м е р 2. Для построения калибровочной кривой определения эстрадиола смешивают антитела к эстрадиолу (концентрация IgG 100 мкг/мл) с конъюгатом α -амилаза - эстрадиол в концентрации 1 мкг/мл и инкубируют 3 минуты при 37оС в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,4. В две идентичные акустические камеры вносят по 0,4 мл 1% раствора крахмала в 0,5 М фосфатном буфере, рН 6,5. Затем в одну из камер, выбранную в качестве рабочей, вносят 0,2 мл исследуемой пробы с эстрадиолом. В другую камеру, выбранную в качестве опорной, вносят 0,2 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 6,5. После этого в обе камеры вносят по 0,06 мл смеси коньюгата α -амилаза-эстрадиол с антительной сывороткой к эстрадиолу и перемешивают магнитной мешалкой при 37оС. В камерах создают стоячую волну и регистрируют изменения собственной частоты резонатора в области 7,4 МГц. Учитывая, что изменения собственной частоты резонатора линейно связаны с изменениями скорости распространения акустических колебаний в исследуемой среде, рассчитывают разность скоростей акустических колебаний между первой и восьмой минутами реакции ( ΔU8).
Операции повторяют при использовании различных концентраций эстрадиола в диапазоне 8 ˙ 10-10-3,8 ˙ 10-8 М и строят калибровочную кривую.
Результаты представлены в табл. 2.
Неизвестную концентрацию эстрадиола определяют, повторив процедуру с исследуемой пробой и далее сравнением результата с калибровочной кривой.
Как видно из таблицы предел обнаружения эстрадиола за восемь мин ферментативной реакции составляет 8 ˙ 10-10 М, а погрешность измерения контрольной пробы 1,6% .
Как видно из выше приведенных примеров предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность измерений с 5 ˙ 10-8 М до (4-8) ˙ 10-10, т. е. примерно на два порядка, а точность измерений в 2-3 раза. (56) Авторское свидетельство СССР N 960627, кл. G 01 N 33/48, 1982.
Claims (1)
- СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГАПТЕНОВ путем конкурентного связывания антигаптеновых антител с исследуемым образцом и конъюгатом белок - гаптен в акустической камере и регистрации скорости распространения акустических колебаний в реакционной среде с последующим учетом результатов, отличающийся тем, что в качестве конъюгата белок - гаптен используют конъюгат фермент - гаптен, предварительно инкубированный с антигаптеновыми антителами, в акустическую камеру дополнительно вводят субстрат фермента, а результат учитывают по изменению начальной скорости распространения акустических колебаний в реакционной среде.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU4937595 RU2006038C1 (ru) | 1991-04-18 | 1991-04-18 | Способ количественного определения гаптенов |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU4937595 RU2006038C1 (ru) | 1991-04-18 | 1991-04-18 | Способ количественного определения гаптенов |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006038C1 true RU2006038C1 (ru) | 1994-01-15 |
Family
ID=21575231
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU4937595 RU2006038C1 (ru) | 1991-04-18 | 1991-04-18 | Способ количественного определения гаптенов |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2006038C1 (ru) |
-
1991
- 1991-04-18 RU SU4937595 patent/RU2006038C1/ru active
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Suleiman et al. | Recent developments in piezoelectric immunosensors. A review | |
| US4999284A (en) | Enzymatically amplified piezoelectric specific binding assay | |
| EP0295965B1 (en) | Oscillator-based methods of detecting a member of a specific binding pair | |
| US4735906A (en) | Sensor having piezoelectric crystal for microgravimetric immunoassays | |
| EP0701698B1 (en) | Analyte-responsive ktp composition and method | |
| US5501986A (en) | Piezoelectric specific binding assay with mass amplified reagents | |
| US5656428A (en) | Homogeneous bioassay using acoustic emission spectroscopy | |
| US5853994A (en) | Particle agglutination assay system | |
| Uttenthaler et al. | Characterization of immobilization methods for African swine fever virus protein and antibodies with a piezoelectric immunosensor | |
| US10234425B2 (en) | Thin film bulk acoustic resonator with signal enhancement | |
| US20090282902A1 (en) | Bio surface acoustic wave (saw) resonator amplification for detection of a target analyte | |
| AU752190B2 (en) | Sensor for detecting biological matter | |
| Le et al. | A goat-anti-human IgG modified piezoimmunosensor for Staphylococcus aureus detection | |
| Abad et al. | A quartz crystal microbalance assay for detection of antibodies against the recombinant African swine fever virus attachment protein p12 in swine serum | |
| Chu et al. | Piezoelectric immunosensor for the detection of immunoglobulin M | |
| CN107250794B (zh) | 具有信号增强的薄膜体声波谐振器 | |
| JP3310090B2 (ja) | 抗原又はハプテンの免疫測定 | |
| Su et al. | Serological determination of Helicobacter pylori infection using sandwiched and enzymatically amplified piezoelectric biosensor | |
| RU2006038C1 (ru) | Способ количественного определения гаптенов | |
| EP0408641B1 (en) | Piezoelectric specific binding assay with mass amplified reagents | |
| JPH1090270A (ja) | ２−メチルイソボルネオールの検出方法 | |
| SU1478122A1 (ru) | Способ определени антигенов или антител | |
| RU2007460C1 (ru) | Способ акустического определения активности фермента или количества субстрата в микрообъемах | |
| Leek et al. | Particle counting immunoassay (PACIA) V-its application to the determination of human placental lactogen | |
| JP3598333B2 (ja) | 水晶振動子を用いた測定試薬及び測定方法 |