RU2005352C1

RU2005352C1 - Method for assessment of specificity of endosperm mutants of corn to accumulation of carotenoids

Info

Publication number: RU2005352C1
Authority: RU
Inventors: В.С. Феденко; Владимир Савельевич Феденко; В.С. Стружко; Виктор Степанович Стружко; В.В. Глушко; Василий Васильевич Глушко
Original assignee: Владимир Савельевич Феденко
Priority date: 1991-09-19
Filing date: 1991-09-19
Publication date: 1994-01-15

Abstract

FIELD: agriculture. SUBSTANCE: method involves taking measurements of optical density of grain samples. Maximum values of density are indicative of maximum accumulation of carotenoids. EFFECT: simpler method. 5 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии, сельскому хозяйству, в частности к генетическим исследованиям зерновых культур, и может быть использовано в селекции и семеноводстве для отбора форм кукурузы с улучшенным качеством зерна. The invention relates to biotechnology, agriculture, in particular to genetic research of grain crops, and can be used in selection and seed production for the selection of forms of corn with improved grain quality.

Селекционные программы по улучшению качества зерна кукурузы включают использование эндоспермовых мутаций, изменяющих сбалансированность белкового комплекса. Для биологической ценности зерна является важным также оптимальное накопление каротиноидов, содержание которых изменяется под действием эндоспермовых мутаций. Для решения этой важной для селекции проблемы необходимы способы экспресс-диагностики, определяющие специфичность накопления каротиноидов в зерне эндоспермовых мутантов кукурузы. Breeding programs to improve the quality of corn grain include the use of endosperm mutations that alter the balance of the protein complex. For the biological value of grain, the optimal accumulation of carotenoids, the content of which changes under the influence of endosperm mutations, is also important. To solve this important problem for breeding, rapid diagnostic methods are needed that determine the specificity of the accumulation of carotenoids in the grain of corn endosperm mutants.

Известные способы оценки воздействия эндоспермовых мутаций на каротиноидный комплекс зерна кукурузы включают экстракцию пигментов органическим растворителем, хроматографическое разделение экстракта на основные каротиноидные фракции, их идентификацию и количественное определение. К основным недостаткам указанных способов следует отнести их длительность и трудоемкость, необходимость использования набора химических реагентов и хроматографических сорбентов. Known methods for assessing the effect of endosperm mutations on the carotenoid complex of maize grains include extraction of pigments with an organic solvent, chromatographic separation of the extract into basic carotenoid fractions, their identification and quantification. The main disadvantages of these methods include their duration and complexity, the need to use a set of chemicals and chromatographic sorbents.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ, включающий выделение и количественное определение каротиноидов по величине оптической плотности экстракта. The closest in technical essence and the achieved effect is a method involving the isolation and quantification of carotenoids by the optical density of the extract.

Согласно способа навеску размолотого зерна кукурузы экстрагируют водонасыщенным бутанолом при постоянном встряхивании в течение 25 мин. Экстракт каротиноидов отделяют фильтрованием и измеряют оптическую плотность окрашенного раствора на спектрофотометре при 435,8 нм. С использованием известного коэффициента экстинктции по величине оптической плотности рассчитывают содержание каротиноидов, которое используют для оценки селекционного материала. According to the method, a weighed portion of ground corn is extracted with water-saturated butanol with constant shaking for 25 minutes. The carotenoid extract is separated by filtration and the optical density of the colored solution is measured on a spectrophotometer at 435.8 nm. Using the known extinction coefficient, the carotenoid content is calculated from the optical density value, which is used to evaluate the selection material.

Основными недостатками способа является необходимость проведения количественной экстракции каротиноидов с использованием токсичного бутанола и предварительной подготовки органического растворителя, большое количество селекционного материала, требуемого для анализа, что существенно ограничивает применение указанного способа для экспресс-диагностики. The main disadvantages of the method is the need for quantitative extraction of carotenoids using toxic butanol and preliminary preparation of an organic solvent, a large amount of breeding material required for analysis, which significantly limits the use of this method for express diagnostics.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение и ускорение способа. The aim of the invention is to simplify and accelerate the method.

Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.

Определяют оптическую плотность отражения среза зерновок или размолотого зерна кукурузы на денситометре ДО-1М (синий светофильтр, интервал пропускания 425-454 нм). Отбор высококаротиноидных мутантных форм проводят по максимальному значению спектрального показателя среди анализируемых селекционных образцов. Determine the optical reflection density of a slice of caryopsis or crushed corn grain on a densitometer DO-1M (blue filter, transmission interval 425-454 nm). The selection of high carotenoid mutant forms is carried out by the maximum value of the spectral index among the analyzed breeding samples.

Интервал длин волн, используемый для анализа, выбран на основании спектральных характеристик каротиноидов и соответствует оптическим параметрам светофильтра. The wavelength range used for analysis is selected based on the spectral characteristics of carotenoids and corresponds to the optical parameters of the filter.

Отличительной особенностью способа является использование в качестве образца среза зерновки или размолотого зерна кукурузы и проведение отбора по величине оптической плотности отражения. A distinctive feature of the method is the use as a sample of a slice of a grain or crushed corn grain and the selection of the optical density of reflection.

П р и м е р 1. Измеряют оптическую плотность отражения среза 5 индивидуальных зерновых исходных (+/+) и мутантных по гену опейк-2 (o2/o2) линий кукурузы на денситомере ДО-1М (синий светофильтр, интервал пропускания 425-454 нм). Параллельно проводят определение содержания каротиноидов в анализируемых образцах известным способом. Полученные данные (табл. 1) показывают генотипическую специфичность воздействия мутации типа о2 на накопление каротиноидов в зерне. PRI me R 1. Measure the optical reflectance of the slice of 5 individual grain source (+ / +) and mutated gene opeyk-2 (o2 / o2) lines of corn on a densitometer DO-1M (blue filter, transmission interval 425-454 nm). In parallel, the determination of carotenoid content in the analyzed samples is carried out in a known manner. The data obtained (Table 1) show the genotypic specificity of the effect of the o2 type mutation on the accumulation of carotenoids in grain.

Так, исходные линии А 204 (+/+) и Cг 2 (+/+) близки по величине оптической плотности отражения, что соответствует содержанию каротиноидов. Однако введение в генотип мутантного гена о2 в большей степени снижает содержание каротиноидов для линии Cг o2/o2 в сравнении с линией А 204 o2/o2, что подтверждается величиной спектрального параметра. So, the initial lines A 204 (+ / +) and Cg 2 (+ / +) are close in magnitude of the optical reflection density, which corresponds to the content of carotenoids. However, the introduction of the mutant o2 gene into the genotype reduces the carotenoid content for the Cg o2 / o2 line to a greater extent in comparison with the A line 204 o2 / o2, which is confirmed by the magnitude of the spectral parameter.

П р и м е р 2. Аналогично примеру 1 измеряют оптическую плотность отражения размолотого зерна и определяют специфичность воздействия мутаций типа о2, su 2, o2 su 2 на исходный генотип (линия W 64 А) (табл. 2). PRI me R 2. Analogously to example 1, measure the optical density of reflection of crushed grain and determine the specificity of the impact of mutations of type o2, su 2, o2 su 2 on the original genotype (line W 64 A) (table. 2).

Установленные величины оптической плотности показывают, что опейковая мутация приводит к значительному снижению накопления каротиноидов, тогда как в случае мутаций типа su2 и o2su2 снижение указанного показателя в сравнении с исходной формой незначительно. The established values of optical density show that the opiate mutation leads to a significant decrease in carotenoid accumulation, whereas in the case of mutations of the su2 and o2su2 type, the decrease in this indicator compared to the initial form is insignificant.

П р и м е р 3. Аналогично примеру 1 измеряют спектральный параметр отражения размолотого зерна, определяют специфичность двойных эндоспермовых мутантов o2/o2 su2/su2 на основе различных исходных генотипов к накоплению каротиноидов и проводят отбор линии А 619 o2/o2 su2/su2 с повышенным содержанием каротиноидов в ряду анализируемых мутантных форм (табл. 3). PRI me R 3. Analogously to example 1, measure the spectral reflection parameter of the ground grain, determine the specificity of the double endosperm mutants o2 / o2 su2 / su2 based on different initial genotypes for the accumulation of carotenoids and select the line A 619 o2 / o2 su2 / su2 s a high content of carotenoids in the series of analyzed mutant forms (table. 3).

П р и м е р 4. Аналогично примеру 1 проводят определение оптической плотности размолотого зерна гетерогенного селекционного материала, в качестве которого использованы семь третьего года самоопыления (S₃), полученные во ВНИИ кукурузы из 16 линейных синтетиков кукурузы, содержащих в своем генотипе мутантный ген опейк-2 (табл. 4).PRI me R 4. Analogously to example 1, the optical density of the ground grain of a heterogeneous breeding material is determined, which is used as the third third year of self-pollination (S ₃ ) obtained in the All-Russian Research Institute of Maize from 16 linear corn synthetics containing a mutant gene in their genotype opeyk-2 (table. 4).

Анализ полученных данных показывает, что селекционным образцам с повышенным содержанием каротиноидов (2,00-2,40 мг% ) в ряду исследуемых синтетиков соответствует величина оптической плотности отражения размолотого зерна в интервале 0,37-0,45. An analysis of the data shows that selection samples with a high content of carotenoids (2.00-2.40 mg%) in the range of synthetics studied correspond to the optical reflection density of the ground grain in the range of 0.37-0.45.

П р и м е р 5. Аналогично примеру 1 измеряют оптическую плотность отражения размолотого зерна высоколизиновых гибридов кукурузы на основе мутации опейк-2 и выявляют гибрид Днепровский 385 ВЛ, для которого максимальное значение спектрального параметра соответствует повышенному содержанию каротиноидов (табл. 5). PRI me R 5. Analogously to example 1, the optical reflectance of the crushed grain of high-lysine maize hybrids based on the opeyk-2 mutation is measured and the Dnieper 385 VL hybrid is detected, for which the maximum value of the spectral parameter corresponds to an increased content of carotenoids (Table 5).

Использование предлагаемого способа в сравнении с прототипом позволит существенно упростить и ускорить проведение отбора путем исключения экстракции каротиноидов и использования химических реагентов. На основании установленного спектрального параметра возможен вариант неразрушающего позернового экспресс-отбора, что дает возможность сохранить высококаротиноидные зерновки перспективных форм для селекционно-генетических исследований. Процесс селекционной диагностики с применением маркерного признака идентифицирует генотипы с повышенным содержанием каротиноидов среди однотипных мутаций, определяет генотипическую вариабельность данного признака для эндоспермовых мутаций различной природы, а также их сочетаний, выявляет перспективные селекционные формы среди синтетиков и высоколизиновых гибридов кукурузы. Using the proposed method in comparison with the prototype will significantly simplify and speed up the selection process by eliminating the extraction of carotenoids and the use of chemical reagents. Based on the established spectral parameter, a variant of non-destructive grain express selection is possible, which makes it possible to preserve high-carotenoid grains of promising forms for selection and genetic studies. The process of selection diagnostics using a marker trait identifies genotypes with a high content of carotenoids among mutations of the same type, determines the genotypic variability of this trait for endosperm mutations of various nature, as well as their combinations, reveals promising breeding forms among synthetics and high lysine hybrids of corn.

Способ позволяет выделить селекционные формы на основе эндоспермовых мутантов, в которых сбалансированность белкового комплекса зерна оптимально сочетается с содержанием каротиноидов и, таким образом, проводить экспресс-отбор по комплексу хозяйственно ценных признаков в процессе реализации селекционных программ на улучшение качества зерна кукурузы. (56) Grogan C. D. , Blessin C. W. Crop Science, 1968, vol. 8, N 6, р. 730-732. The method allows to select breeding forms based on endosperm mutants in which the balance of the protein complex of grain is optimally combined with the content of carotenoids and, thus, to conduct rapid selection for a complex of economically valuable traits in the process of implementing selection programs to improve the quality of corn grain. (56) Grogan C. D., Blessin C. W. Crop Science, 1968, vol. 8, N 6, p. 730-732.

Neamtu G. , Cabulea I. , Botez C. , Illyes G. , Irimie F. Stud. Cercet. Bioсhim. , 1984, t. 27, nr. 1, р. 63-69. Neamtu G., Cabulea I., Botez C., Illyes G., Irimie F. Stud. Cercet. Biohim. , 1984, t. 27, nr. 1, p. 63-69.

Методы оценки технологических качеств зерна, М. , 1971, с. 100-101. Methods for assessing the technological qualities of grain, M., 1971, p. 100-101.

Claims

1. METHOD FOR DETERMINING THE SPECIFICITY OF THE CORD MAKE ENDOSPERMAL MUTANTS TO THE CAROTINOID ACCUMULATION, which includes measuring the spectral parameter of the sample, characterized in that when measuring the spectral parameter, the optical density of reflection of the grain sample is determined in the region of 425-454 nm and the maximum accumulation of carotenoids at density.

2. The method according to p. 1, characterized in that as a sample using a slice of grain or crushed grain of corn.