Claims (21)
1. Кристалл белка PDE5 с модифицированной последовательностью, содержащей SEQ ID NO:4, в который может быть включено соединение формулы, представленной на фиг.4, так что данное соединение связывается с активным центром указанного белка.1. A PDE5 protein crystal with a modified sequence containing SEQ ID NO: 4, into which a compound of the formula shown in FIG. 4 can be incorporated, so that this compound binds to the active center of the protein.
2. Кристалл по п.1, содержащий последовательность SEQ ID NO:5.2. The crystal according to claim 1, containing the sequence of SEQ ID NO: 5.
3. Кристалл по п.1, выращенный с использованием полиэтиленгликоля в качестве осаждающего агента.3. The crystal according to claim 1, grown using polyethylene glycol as a precipitating agent.
4. Кристалл по п.1, выращенный в буфере при рН в пределах от 6,5 до 8,0.4. The crystal according to claim 1, grown in buffer at a pH in the range from 6.5 to 8.0.
5. Кристалл по п.1, выращенный в присутствии спирта.5. The crystal according to claim 1, grown in the presence of alcohol.
6. Кристалл по любому из предыдущих пунктов, выращенный в растворе, содержащем буфер HEPES, полиэтиленгликоль 4000 и изопропанол.6. The crystal according to any one of the preceding paragraphs, grown in a solution containing HEPES buffer, polyethylene glycol 4000 and isopropanol.
7. Кристалл по п.1, который имеет одну или несколько из нижеследующих характеристик:7. The crystal according to claim 1, which has one or more of the following characteristics:
(m) принадлежит к пространственной группе С2;(m) belongs to the space group C2;
(n) размеры элементарной ячейки составляют а ~56±1%, b ~77Е±1%, с ~81Е±1%, α=γ=90°, β=103°±1%;(n) the unit cell sizes are a ~ 56 ± 1%, b ~ 77E ± 1%, c ~ 81E ± 1%, α = γ = 90 °, β = 103 ° ± 1%;
(о) содержит 1 молекулу на один асимметричный элемент:(o) contains 1 molecule per asymmetric element:
(р) содержит белок с молекулярной массой приблизительно 40 кДа ± 2 кДа;(p) contains a protein with a molecular weight of approximately 40 kDa ± 2 kDa;
(q) вычисленное содержание растворителя составляет приблизительно 44±5%; и(q) the calculated solvent content is approximately 44 ± 5%; and
(г) имеет моноклинную кристаллическую систему.(d) has a monoclinic crystalline system.
8. Кристалл по п.1, где указанный белок имеет активный центр в третьем субдомене белка, который ограничен спиралями 15 (H15 813-824) и 14 (Н14 772-797), С-концом спирали 13 (Н13 749-765) и С-концом спирали 11 (Н11 706-721) вместе с областью петли, расположенной между спиралями 11 и 12а (Н12а 725-731), как показано на фиг.2.8. The crystal according to claim 1, where the specified protein has an active center in the third subdomain of the protein, which is limited by helices 15 (H15 813-824) and 14 (H14 772-797), the C-end of helix 13 (H13 749-765) and With the end of the spiral 11 (H11 706-721) together with the region of the loop located between the spirals 11 and 12a (H12a 725-731), as shown in Fig.2.
9. Кристалл по любому из предыдущих пунктов, где указанный белок имеет активный центр в третьем субдомене белка и содержит Leu 765, Ala 767 и Ile 768 и один или несколько из Phe 820, Val 782, Phe 786, Tyr 612, Leu 804, Ala 779, Ala 783, Ile 813, Met 816 и Gin 817.9. The crystal according to any one of the preceding paragraphs, where the specified protein has an active center in the third subdomain of the protein and contains Leu 765, Ala 767 and Ile 768 and one or more of Phe 820, Val 782, Phe 786, Tyr 612, Leu 804, Ala 779, Ala 783, Ile 813, Met 816 and Gin 817.
10. Кристалл по п.1, где указанный белок имеет трехмерную структуру, характеризующуюся атомными координатами, представленными в таблице 4, или серией производных, выраженных в любой системе отсчета.10. The crystal according to claim 1, where the specified protein has a three-dimensional structure, characterized by atomic coordinates presented in table 4, or a series of derivatives expressed in any reference frame.
11. Кристалл по п.1, где в указанный кристалл включен лиганд PDE5.11. The crystal according to claim 1, where a PDE5 ligand is included in said crystal.
12. Кристалл по п.11, где указанный белок имеет трехмерную структуру, характеризующуюся атомными координатами, представленными в таблице 5, или серией производных, выраженных в любой системе отсчета.12. The crystal according to claim 11, where the specified protein has a three-dimensional structure, characterized by atomic coordinates presented in table 5, or a series of derivatives expressed in any reference frame.
13. Производное кристалла по п.1, содержащее тяжелый атом.13. The derivative of the crystal according to claim 1, containing a heavy atom.
14. Применение атомных координат, определенных для кристалла по п.1, для установления трехмерной структуры PDE5 или его мутанта, производного, варианта, аналога, гомолога, субдомена или фрагмента.14. The use of atomic coordinates defined for the crystal according to claim 1, for establishing the three-dimensional structure of PDE5 or its mutant, derivative, variant, analogue, homolog, subdomain or fragment.
15. Применение по п.14, где указанным субдоменом является каталитический домен.15. The application of clause 14, where the specified subdomain is a catalytic domain.
16. Способ идентификации соединения, которое является лигандом PDE5, включающий следующие стадии:16. A method for identifying a compound that is a PDE5 ligand, comprising the following steps:
e) получения кристалла по п.1,e) obtaining a crystal according to claim 1,
f) контактирования указанного кристалла с соединением в условиях, способствующих включению (пропитке) данного соединения в указанный кристалл,f) contacting the specified crystal with the compound under conditions conducive to the inclusion (impregnation) of this compound in the specified crystal,
g) определения, путем рентгеноструктурного анализа и разрешения структуры, связывается или нет указанное соединение с активным центром указанного белка в полученном "пропитанном" кристалле,g) determining, by X-ray diffraction analysis and resolution of the structure, whether or not said compound is bound to the active center of said protein in the resulting "impregnated" crystal,
h) необязательно, анализа указанного лиганда для того, чтобы определить, является ли данный лиганд ингибитором PDE5.h) optionally, analyzing said ligand to determine if the ligand is a PDE5 inhibitor.
17. Способ по п.16, где указанное соединение имеет структурную формулу, представленную на фиг.4.17. The method according to clause 16, where the specified connection has the structural formula shown in Fig.4.
18. Способ моделирования соединения, способного связываться с PDE5, включающий следующие стадии:18. A method for simulating a compound capable of binding to PDE5, comprising the following steps:
(a) компьютерного моделирования трехмерного представления структуры белка, присутствующего в кристалле по п.1, или его фрагмента или субдомена,(a) computer simulation of a three-dimensional representation of the structure of the protein present in the crystal according to claim 1, or a fragment or subdomain thereof,
(b) компьютерного моделирования трехмерного представления структуры соединения,(b) computer simulation of a three-dimensional representation of the structure of the compound,
(c) совместного отображения трехмерного представления структуры соединения с трехмерным представлением структуры указанного белка,(c) co-displaying a three-dimensional representation of the structure of the compound with a three-dimensional representation of the structure of the specified protein,
(d) анализа для установления соответствия трехмерного представления структуры соединения с трехмерным представлением активного центра структуры данного белка,(d) analysis to establish a three-dimensional representation of the structure of the compound with a three-dimensional representation of the active center of the structure of a given protein,
(e) необязательно, проведения анализа полученного лиганда для того, чтобы определить, является ли данный лиганд ингибитором PDE5.(e) optionally, analyzing the resulting ligand in order to determine whether the ligand is a PDE5 inhibitor.
19. Способ отбора лиганда PDE5 из группы потенциальных лигандов PDE5, включающий следующие стадии:19. A method of selecting a PDE5 ligand from a group of potential PDE5 ligands, comprising the following steps:
(a) компьютерного моделирования трехмерного представления структуры белка, присутствующего в кристалле по п.1 или его фрагмента или субдомена,(a) computer simulation of a three-dimensional representation of the structure of the protein present in the crystal according to claim 1 or its fragment or subdomain,
(b) компьютерного моделирования трехмерного представления структуры лиганда,(b) computer simulation of a three-dimensional representation of the structure of the ligand,
(c) совместного отображения трехмерного представления структуры лиганда с трехмерным представлением структуры указанного белка,(c) co-displaying a three-dimensional representation of the ligand structure with a three-dimensional representation of the structure of the specified protein,
(d) анализа для установления соответствия трехмерного представления структуры лиганда с трехмерным представлением активного центра структуры данного белка,(d) analysis to establish a three-dimensional representation of the structure of the ligand with a three-dimensional representation of the active center of the structure of a given protein,
(e) необязательно, проведения анализа полученного лиганда для того, чтобы определить, является ли данный лиганд ингибитором PDE5.(e) optionally, analyzing the resulting ligand in order to determine whether the ligand is a PDE5 inhibitor.
20. Применение трехмерной структуры, как получено по п.16, для сайт-направленного конструирования мутантов PDE5.20. The use of a three-dimensional structure, as obtained according to clause 16, for site-directed construction of PDE5 mutants.
21. Способ пропитки соединения в кристалле по п.1, включающий следующие стадии:21. The method of impregnating a compound in a crystal according to claim 1, comprising the following steps:
d) инкубирования указанного кристалла в водном стабилизирующем растворе, содержащем буфер и полиэтиленгликоль;d) incubating said crystal in an aqueous stabilizing solution containing a buffer and polyethylene glycol;
e) объединения указанного соединения с указанным стабилизирующим раствором; иe) combining said compound with said stabilizing solution; and
f) необязательно, добавления криозащитного вещества в указанный стабилизирующий раствор.f) optionally, adding a cryoprotective substance to said stabilizing solution.